产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法

摘要

本申请涉及基因工程领域，具体涉及产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法。本发明通过敲除罗尔斯通氏菌H16中的葡萄糖激酶基因（

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法。

背景技术

气候变化正在造成新一轮的全球粮食危机，化石燃料的大量使用所释放的温室气体（如CO

目前已有利用代谢工程手段生产葡萄糖的报道见于以大肠杆菌和酿酒酵母为宿主菌株。碳源包括可被直接利用的木糖、阿拉伯糖和先通过电化学方法转化为乙酸而后被菌株利用的CO

罗尔斯通氏菌H16（

发明内容

为实现利用可再生物质及温室气体CO

本发明的再一目的是提供一种高效发酵生产葡萄糖的方法。

根据本发明的产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌，所述工程菌为敲除罗尔斯通氏菌的葡萄糖激酶基因、并敲除了Entner-Doudoroff（ED）途径和聚([R]-3羟基丁酸)（PHB）合成途径中关键基因的突变型罗尔斯通氏菌，

其中，被敲除的葡萄糖激酶基因为葡萄糖激酶编码基因glk（H16_B2564），其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述ED途径关键基因为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因

所述PHB合成途径关键基因为聚([R]-3羟基丁酸)聚合酶编码基因

根据本发明的构建产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌的方法，包括以下步骤：

敲除的葡萄糖激酶基因为葡萄糖激酶编码基因

敲除ED途径和PHB合成途径中的关键基因，

其中，被敲除的葡萄糖激酶基因为葡萄糖激酶编码基因

所述ED途径关键基因为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因

所述PHB合成途径关键基因为聚([R]-3羟基丁酸)聚合酶编码基因

本发明另一个目的是提供一种发酵生产葡萄糖的方法，包括如下步骤：摇瓶发酵上述的产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌株，得到葡萄糖。

根据本发明的发酵生产葡萄糖的方法，其中，利用以果糖、甘油或CO

根据本发明的发酵生产葡萄糖的方法，其中，发酵培养基的配方为：3.5 g/LNa

根据本发明的发酵生产葡萄糖的方法，其中，所述发酵培养基中添加卡那霉素抗生素终浓度为200 mg/L。

根据本发明的发酵生产葡萄糖的方法，其中，所述摇瓶发酵条件为温度30℃，转速200 rpm。

本申请的技术方案的优点：

1. 利用罗尔斯通氏菌H16工程菌株进行葡萄糖合成的优势在于其不能利用葡萄糖，不需要对菌株进行改造即可实现产物的积累。同时，罗尔斯通氏菌H16具有广泛的底物谱。能够利用果糖、甘油等有机物作为碳源进行产物合成的同时，还具有高效的CO

2. 为构建葡萄糖积累的工程菌株，首先需对参与葡萄糖代谢第一步反应的葡萄糖激酶进行失活。而罗尔斯通氏菌H16野生型菌株是无法利用葡萄糖作为碳源的。因此，本发明首先对菌株中的葡萄糖激酶进行了活性鉴定。利用游离质粒在野生型菌株中表达运动发酵单胞菌（

3. 通过单敲除或组合敲除ED途径和PHB合成途径中的关键基因来通过截断各途径对葡萄糖合成前体葡萄糖6-磷酸的分流，提高了突变型罗尔斯通氏菌底盘细胞中的产物前体供应，利用果糖、甘油及CO

附图说明

图1显示罗尔斯通氏菌野生株和工程菌对葡萄糖的利用及菌体生长情况；

图2显示罗尔斯通氏菌敲除glk后在不同碳源中生长时葡萄糖的积累；

图3显示罗尔斯通氏菌野生株和本申请的工程菌株利用果糖为碳源合成葡萄糖的结果；

图4显示罗尔斯通氏菌野生株和本申请的工程菌株的果糖消耗结果；

图5显示罗尔斯通氏菌野生株和本申请的工程菌株利用果糖为碳源合成葡萄糖时菌体生长测定结果；

图6显示罗尔斯通氏菌野生株和本申请的工程菌株利用甘油为碳源合成葡萄糖的结果；

图7显示罗尔斯通氏菌野生株和本申请的工程菌株的甘油糖消耗结果；

图8显示罗尔斯通氏菌野生株和本申请的工程菌株利用甘油为碳源合成葡萄糖时菌体生长测定结果；

图9显示罗尔斯通氏菌野生株和本申请的工程菌株利用CO

图10显示罗尔斯通氏菌野生株和本申请的工程菌株利用CO

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1罗尔斯通氏菌H16中葡萄糖激酶

罗尔斯通氏菌H16能够利用果糖、甘油以及CO

基于此，利用可在罗尔斯通氏菌H16中自主复制的游离质粒pBBR1-MCS2为载体在菌株中异源表达了运动发酵单胞菌（

实施例2构建罗尔斯通氏菌H16

突变型罗尔斯通氏菌底盘细胞为敲除葡萄糖激酶基因、ED途径关键基因和PHB合成途径关键基因的突变菌株。被敲除的葡萄糖激酶基因为

一、构建罗尔斯通氏菌H16

将

1. 构建带有

根据

2. 构建pK18-glk质粒整合到基因组中的罗尔斯通氏菌H16菌株

将带有pK18-glk质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16菌株接种LB液体培养基过夜培养，并分别添加相应抗生素（卡那霉素50 µg/mL或庆大霉素10 µg/mL）。4600rpm离心8 min收集菌体，利用LB培养基分别洗涤菌体三次。将带有pK18-glk质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16菌株按照3:1的比例进行混合后点于LB平板上，于30℃过夜孵育。用LB洗下过夜孵育的混合菌体，涂布于LB固体平板（卡那霉素200 µg/mL和庆大霉素10 µg/mL）上。平板于30℃培养48小时后筛选阳性克隆子，目标片段为卡那霉素抗性基因片段，长度500 bp。将阳性克隆子于添加有LB液体培养基1.5 mL EP管中于30℃进行过夜培养。

3. 构建

将菌液稀释至10

二、构建罗尔斯通氏菌H16

依次将

1. 构建带有

根据

2. 构建pK18-zwf1质粒整合到基因组中的罗尔斯通氏菌H16菌株

将带有pK18- zwf1质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16

3. 构建

将菌液稀释至10

4. 构建

按照上述步骤，分别以罗尔斯通氏菌H16

三、构建罗尔斯通氏菌H16

将phaC1AB1操纵子（含有

1. 构建带有phaC1AB1操纵子序列上下游同源臂的敲除质粒pK18-phaC1AB1

根据phaC1AB1操纵子（

2. 构建pK18-phaC1AB1质粒整合到基因组中的罗尔斯通氏菌H16

将带有pK18-phaC1AB1质粒的大肠杆菌S17-1菌株和罗尔斯通氏菌H16

3. 构建

将菌液稀释至10

表1

实施例3利用产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌株以果糖为碳源发酵生产葡萄糖

将罗尔斯通氏菌H16及产葡萄糖的罗尔斯通氏菌H16∆

制备以果糖为唯一碳源的发酵培养基：准确称取3.5 g Na

将罗尔斯通氏菌H16及产葡萄糖的罗尔斯通氏菌H16∆

菌液OD

葡萄糖浓度、果糖浓度测定：使用高效液相色谱仪对样品中葡萄糖、果糖进行检测。利用检测器为岛津视差折光检测器，色谱柱为Waters Sugar-Pak

葡萄糖浓度检测结果如图3所示，在以果糖为唯一碳源时，单敲除

当利用果糖为唯一碳源时，果糖的消耗主要是经由ED途径进行。因此，在敲除

实施例4利用产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌株以甘油为碳源发酵生产葡萄糖

将罗尔斯通氏菌H16及产葡萄糖的罗尔斯通氏菌H16∆

制备以甘油为唯一碳源的发酵培养基：准确称取3.5 g Na

将罗尔斯通氏菌H16及产葡萄糖的罗尔斯通氏菌H16∆

菌液OD

葡萄糖浓度、甘油浓度测定：使用高效液相色谱仪对样品中葡萄糖、甘油进行检测。利用检测器为岛津视差折光检测器，色谱柱为Waters Sugar-Pak

葡萄糖浓度检测结果如图6所示，在以甘油为唯一碳源时，单敲除glk基因即可合成葡萄糖，发酵6天后，产量为47.5 mg/L。突变株中的罗尔斯通氏菌H16∆

罗尔斯通氏菌在利用甘油为碳源时，首先将其转化为糖酵解中间体磷酸二羟基丙酮，而后磷酸二羟基丙酮转化为磷酸烯醇丙酮酸，然后转化为丙酮酸，进而被用于进行PHB或有机酸的合成。同时，磷酸二羟基丙酮还会经由糖异生途径进行代谢合成产物葡萄糖的前体物葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸。由于罗尔斯通氏菌以甘油为碳源时的ED途径较弱，因此敲除zwf基因后葡萄糖产量仅有0.5倍的提升而代谢果糖时主要经由ED途径，利用果糖为碳源时敲除zwf基因对产物的提升效果更为明显。与以果糖作为碳源相似，敲除PHB合成途径后的葡萄糖产量下降可以归因于较低的菌体量（如图8所示）和碳流量的损失。同时，由于以甘油为碳源时，碳流量主要是通过糖酵解流向PHB的合成途径，因此，切断ED途径也不能完全避免该部分碳流量的损失。关于罗尔斯通氏菌菌株较低的甘油利用速率已有报道，如图7所示，野生型需3天才能够耗尽4 g/L甘油，而野生株在1天内即可耗尽相同质量的果糖。因此该菌株本身对果糖和甘油的利用能力存在很大差异。如图7所示罗尔斯通氏菌野生型和突变菌株的甘油代谢速率并无明显的差异，可能与其天然的甘油的利用特性有关，使得各突变菌株之间并没有表现出明显的碳源利用差异。

实施例5利用产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌株以CO

将罗尔斯通氏菌H16及产葡萄糖的罗尔斯通氏菌H16∆

制备以甘油为唯一碳源的发酵培养基：准确称取3.5 g Na

将罗尔斯通氏菌H16及产葡萄糖的罗尔斯通氏菌H16∆

菌液OD

葡萄糖浓度测定：使用高效液相色谱仪对样品中葡萄糖进行检测。利用检测器为岛津视差折光检测器，色谱柱为Waters Sugar-Pak

葡萄糖浓度检测结果如图9所示，在以CO

罗尔斯通氏菌在利用CO

以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1014

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccacca ctgcatcctc ctgcgctgac ttcccccgcc tgctcggcga tgtgggcggc 60

accaacgtgc gctttgcact ggaaaccgca ccaatgcgga tcggcccggt gaccgcgctg 120

aaggtggccg atttcccgtc gctcgaagca gccctgcgcc aatacctcga cggactttcc 180

gcgtcgggca agccggtgcc gcgccacgcg gcgatcggcc tggccaaccc ggtgaccggc 240

gaccaggtcc ggctcaccaa ccacaactgg tcgttctcga tcgacggcat gcggcgcgcg 300

ctcgggctgc agacgctggt ggccatcaac gacttcaccg cgctggcgct ggccctgccg 360

tacctgcctg ccgacgggct ggtgcccgtg cgtgccggca ccgcggtgcg caccgcgccg 420

ctcgcgctgg tcgggccggg caccgggctg ggcgtttccg gcctggtgcc ggcgccgggc 480

ggagcagccg tggcgctggc cggcgaaggc ggccatatcg agctgatgcc cgacactgac 540

gacgaatgga tcgcctggcg cgccgcccat cgcaacgttg gccgggtgtc ggcggagagg 600

ctcctgtgcg gcagcggcct gtcgcatatc catgccgcgc tggccgcaga aacgggtacg 660

cttttgctcg cgccgctgtt gccggagcag gtcaccaccg gcgccttcga gcgccacgac 720

ccgctgtgcc agcgcgccat ggcggtgttc ttcggcctgc tcggctcggt tgcggccgac 780

atcgccctgg tgctgggcgc acgtggcggg gtctacctgg gcggcggcat cctgccacgc 840

ttcgtgcctg cgctgcaggc ctcggccttc gccgagcgct ttgtcgccaa gggccgcatg 900

cgcggctggc tggaggccgt gccggtccac gtcatcaccg ccagccaccc cgcgctgccg 960

ggactggcgc gcgcactggc cgagcagctc gacggccgcg gccggaacgc atag 1014

<210> 2

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcaaacca cccgaaccgc ctcttcttcc ggcactgccg acgcgcggcc actggacctc 60

gtcatcttcg gcggcgccgg cgacctgtcg gcacgcaagc tgctgccatc gctctacatg 120

tgccaccgcg acggcaacct gcccgacggc acccgcatca tcggcgtggg ccggcaccgc 180

tgggaccgcg aggcctttgt caattttgcc gatgaaagcg cacaaccctt tgtcgaagcg 240

cgctatctcg agccggccaa atggcagacc ttcctgcagc ggctggattt cgtgcacgtt 300

gacgcgtcgc agtccgggga ctatccggcg ctggccgcgc aactgcgcca ggaggcgctg 360

cgcatctatt acatggcgat gccgccgggc ttgttcgcgg ccacctgcga caaccttgcc 420

agccatggcc tgatcgccaa cgacacccgg ctggtgctgg aaaaaccgct gggcgtggac 480

ctggcctcgg ccatcggcat cggcgaggtg gtcagccgct acttcagcga ggaccgcacc 540

taccggatcg accactacct gggcaaggaa acggtgcaga acctgatggc gctgcgcttc 600

ggcaattcga tcttcgagcc gctgtggcgc acgccgttcg tgcgcagcgt gcagatcacc 660

gtggccgaga ccgtgggcgt gggcacgcgc ggcggcttct acgacgaggc cggcgccatg 720

cgcgacatgg tgcagaacca cctgctgcag ctggtcagca tcctggcgat ggagccgccg 780

gcagcgctca cctccgatgc ggtgcgcgat gagaagctca aggtgctgcg ctcgctgcgg 840

ccgatgtcgc ccgaggacgt acgccgcaat accgtgcgcg gccagtacac cgcgggcgcc 900

atcgccggcg agctggtgcg cggctacctg caggaagaag gcattccgcc agacagccgc 960

accgagacct tcgtcgcgat gcgcgccgag ctcggcacgt ggcgctggaa caaggtgccg 1020

ttctacctgc gcactggcaa gcgcatgcag gagcgcgtga ccgaggtggt gatcaacttc 1080

gccgaggtgc cgcattcgat cttcgatgcc ggcagcacgc tgcagcccaa ccgcatggtg 1140

atccggctgc agccggaaga gtcggtgcgg ctgacgctga tggtcaagca gccaggcgag 1200

ggcatgaagc tgaagccgct gagcctggcg ctgaacctgg actcggcctt caccacccgg 1260

cgcgccgaag cctacgagcg cctgctgctc gacgtgatac gcggacggct ggcgctgttc 1320

gtgcggcgcg acgaactgca ggccgcctgg acctgggtcg acccgatcct ggaagcgtgg 1380

cgccagcagg acgaaggccc gcgcccctat accgccggca cctggggccc ggcggcttcg 1440

tcggcgttca tggcgcgcga aggcgtgcag tggtctgagg aggcgtga 1488

<210> 3

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgatggcta gcccccctgc cggcgctccg gcacctgaac ctgctccaga gttcgatttc 60

gtactgttcg gcgccaccgg cgacctggcg cggcgcaagc tgctgccggc actgttcgat 120

gcccacgccg ccggttcgct gcatccgcgc gggcgcatcc tggcactggg cagccagccg 180

ctgtcgcatg acgcctacct ggcgatgcta aacgacgaag tgctgccagc gctggccggc 240

aacgccgcgg ccgcagcgtg gcagggcttt ctcgaccgca tcgtgtacct gcaggtcgat 300

gccaacgccg atgccggctt cggcgcgctg gccgagctgg tcaatgcgcg cgcggcgcca 360

gtggtggtgt tctacctggc cacggccccg cacctgttcg tcaccatctg cgagcaactg 420

gcgcgcgtgg gcctgaccgg cccgcgcagc cgcatcgtgc tggaaaaacc gctcgggcac 480

gacctggcct cgtccgaggc catcaacgcg gaagtggcgc ggcactttgc cgaggaccag 540

atctaccgga tcgaccacta cctgggcaag gagtcggtgc agaacctgat ggcggtgcgc 600

tttggcaacg tgctgttcga gccgctgtgg cggcgcgaat gggtgcgcca ggtgcagatc 660

accatcgccg aagagctggg cgtggagcgc cgcggcaact tctatgacgg catcggcgcg 720

ctgcgcgaca tggtgcagaa ccacctgctg cagctgctgt gcatggtggc gatggagccg 780

cccacgagcc tgtcggaaga cgccatccgc gatgagaagc tcaagatcct gaaggcgctg 840

cggccgatcc ggccggaaga cgtggccgaa aaggtggtgc gtggccagta ctcccgtggc 900

gccgcgggcg gcgacccggt gcccggctat gccagtgaac ccggcatcgc gcccgacagc 960

cgcaccgaga ccttcgtcgc tatccgcgcc gagatcgcca actggcgctg ggccggggtg 1020

ccgttctacc tgcgtaccgg caagcgcatg cagtcgcgcg tggcggagat cgtaatccat 1080

ttccatgacg tgccctaccc gctgttcccg cacccgctgg gaatcatgtc cggcaaccgg 1140

ctggtgatca cgctgcagcc cgaggagagc atccggctgt atttcctgac caagcagccg 1200

ggcgacacgc aggcgctgat tcccgcgtcc ctcgacctgc agctgaacac tgccgcccca 1260

cgtgtacggc gcgtgggcgc gtacgagcgc ctgctgctcg acgtgatccg cggccggctg 1320

ggcctgttcg tgcggcgcga tgagcaggta caggcgtggc gctgggtcgc gcccatcctg 1380

aagacgtggg agaactcgcc cacgccgccc aagccttaca ccgccggcac ctggggcccg 1440

gcagcctcca gtgccctgct gtcgcgagac ggcatggcct ggcatgaaga gatgtag 1497

<210> 4

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcctgatt tcgacatggt gctgttcggc ggcaccggcg acctggcgcg gcgcaagctg 60

ctgccgtccc tgttcgatgc ccaccacgcc ggcctgctgc atccggccgc acgcatcctc 120

gccaccggca gccagccgct ctcgaccgcg gactacctcg cctcgctgga gcagaccgtg 180

cgccccgggc tagcccatgc gccgcccgag tcatgggaca agttctgcgc gcgcattgtc 240

tacgtgcagg ccgatgcacg cgtgcccgcg catttcgatg cgctcgcgga gcaggtgctg 300

gcacgcaagc ctgaagtggt ggtgtgctat ctcgccaccg cgccgcacct gttcgtgtcg 360

atctgcgagc agctggcacg caccggcctg aacacgcgcc aggcgcccaa cgtgcgcatc 420

gtgctggaaa aaccgctggg gcatgacctc gaatccaacg aggcaatcaa ctcggcagtg 480

gcgaagttct tcgccgaaga gcagatctac cgcatcgatc attacctcgg caaggagtcg 540

gtgcagaacc tgatggcgat ccgcttcggc aacgcgctgt tcgagccgct gtggcggcgc 600

gagtgggtgc aggacgtgca gatcaccatc gccgaagaac tcggcgtgga aacgcgcggc 660

gacttctacg accgcaccgg cgcgctgcgc gacatggtgc agaaccactt gctgcagctc 720

ttgtgcatgg tggcgatgga gccgccggcc agcctcagcg aagatgccat ccgcgacgag 780

aagatcaaga tcctgaaggc gctcaagccg atcacgccgc aggacgtggc cgagaagacc 840

gtgcgcggcc agtaccgctc cggtgccatc ggcggcaagc cggtgccggg ctacctggaa 900

gaagcgggca tcgcgcccga cagccgcacc gagacctttg tcgcgatcaa ggccgagatc 960

gccaactggc gctgggaagg cgtgccgttc tacctgcgca ccggcaagcg tatgcagtcg 1020

cgcgtggccg agatcgtgat ccatttccgc gacgtgccgc acgcgatctt cccgcggccg 1080

ctgacgctgt cgccgcagaa ccggctggtg atccagctgc agccggaaga aagcatccgc 1140

ctgtactgcc tggtcaagca gcctggcgac acgctggagc tgacgccgac ctcgctcgac 1200

ctggactttg ccaactcgtt caaggtgcgc cgcgccggcg cctacgaacg cttgctgctc 1260

gacgtgatcc gcggccggct gggcctgttc gtgcgccgcg atgaacaagt gcaggcctgg 1320

cgctgggtcg aacccatcat cgacacctgg gatgccagca ccgtgccgcc caagccctat 1380

accgccggca cctggggacc ggccgcgtcg tcggcgctga tgtcgcgcga cggcgggctg 1440

tggcacgagg aagcctga 1458

<210> 5

<211> 1770

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcgaccg gcaaaggcgc ggcagcttcc acgcaggaag gcaagtccca accattcaag 60

gtcacgccgg ggccattcga tccagccaca tggctggaat ggtcccgcca gtggcagggc 120

actgaaggca acggccacgc ggccgcgtcc ggcattccgg gcctggatgc gctggcaggc 180

gtcaagatcg cgccggcgca gctgggtgat atccagcagc gctacatgaa ggacttctca 240

gcgctgtggc aggccatggc cgagggcaag gccgaggcca ccggtccgct gcacgaccgg 300

cgcttcgccg gcgacgcatg gcgcaccaac ctcccatatc gcttcgctgc cgcgttctac 360

ctgctcaatg cgcgcgcctt gaccgagctg gccgatgccg tcgaggccga tgccaagacc 420

cgccagcgca tccgcttcgc gatctcgcaa tgggtcgatg cgatgtcgcc cgccaacttc 480

cttgccacca atcccgaggc gcagcgcctg ctgatcgagt cgggcggcga atcgctgcgt 540

gccggcgtgc gcaacatgat ggaagacctg acacgcggca agatctcgca gaccgacgag 600

agcgcgtttg aggtcggccg caatgtcgcg gtgaccgaag gcgccgtggt cttcgagaac 660

gagtacttcc agctgttgca gtacaagccg ctgaccgaca aggtgcacgc gcgcccgctg 720

ctgatggtgc cgccgtgcat caacaagtac tacatcctgg acctgcagcc ggagagctcg 780

ctggtgcgcc atgtggtgga gcagggacat acggtgtttc tggtgtcgtg gcgcaatccg 840

gacgccagca tggccggcag cacctgggac gactacatcg agcacgcggc catccgcgcc 900

atcgaagtcg cgcgcgacat cagcggccag gacaagatca acgtgctcgg cttctgcgtg 960

ggcggcacca ttgtctcgac cgcgctggcg gtgctggccg cgcgcggcga gcacccggcc 1020

gccagcgtca cgctgctgac cacgctgctg gactttgccg acacgggcat cctcgacgtc 1080

tttgtcgacg agggccatgt gcagttgcgc gaggccacgc tgggcggcgg cgccggcgcg 1140

ccgtgcgcgc tgctgcgcgg ccttgagctg gccaatacct tctcgttctt gcgcccgaac 1200

gacctggtgt ggaactacgt ggtcgacaac tacctgaagg gcaacacgcc ggtgccgttc 1260

gacctgctgt tctggaacgg cgacgccacc aacctgccgg ggccgtggta ctgctggtac 1320

ctgcgccaca cctacctgca gaacgagctc aaggtaccgg gcaagctgac cgtgtgcggc 1380

gtgccggtgg acctggccag catcgacgtg ccgacctata tctacggctc gcgcgaagac 1440

catatcgtgc cgtggaccgc ggcctatgcc tcgaccgcgc tgctggcgaa caagctgcgc 1500

ttcgtgctgg gtgcgtcggg ccatatcgcc ggtgtgatca acccgccggc caagaacaag 1560

cgcagccact ggactaacga tgcgctgccg gagtcgccgc agcaatggct ggccggcgcc 1620

atcgagcatc acggcagctg gtggccggac tggaccgcat ggctggccgg gcaggccggc 1680

gcgaaacgcg ccgcgcccgc caactatggc aatgcgcgct atcgcgcaat cgaacccgcg 1740

cctgggcgat acgtcaaagc caaggcatga 1770

<210> 6

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgactgacg ttgtcatcgt atccgccgcc cgcaccgcgg tcggcaagtt tggcggctcg 60

ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc gctggagcgc 120

gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct gaccgccggt 180

tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc gatggtgccg 240

gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct ggccgccaac 300

gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa catgagcgcc 360

gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc caagctggtc 420

gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat gggcatcacc 480

gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga gttcgccgtc 540

ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga agagatcgtc 600

ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac ccggtggcct tcaagaccga cgagttcgtg 660

cgccagggcg ccacgctgga cagcatgtcc ggcctcaagc ccgccttcga caaggccggc 720

acggtgaccg cggccaacgc ctcgggcctg aacgacggcg ccgccgcggt ggtggtgatg 780

tcggcggcca aggccaagga actgggcctg accccgctgg ccacgatcaa gagctatgcc 840

aacgccggtg tcgatcccaa ggtgatgggc atgggcccgg tgccggcctc caagcgcgcc 900

ctgtcgcgcg ccgagtggac cccgcaagac ctggacctga tggagatcaa cgaggccttt 960

gccgcgcagg cgctggcggt gcaccagcag atgggctggg acacctccaa ggtcaatgtg 1020

aacggcggcg ccatcgccat cggccacccg atcggcgcgt cgggctgccg tatcctggtg 1080

acgctgctgc acgagatgaa gcgccgtgac gcgaagaagg gcctggcctc gctgtgcatc 1140

ggcggcggca tgggcgtggc gctggcagtc gagcgcaaat aa 1182

<210> 7

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgactcagc gcattgcgta tgtgaccggc ggcatgggtg gtatcggaac cgccatttgc 60

cagcggctgg ccaaggatgg ctttcgtgtg gtggccggtt gcggccccaa ctcgccgcgc 120

cgcgaaaagt ggctggagca gcagaaggcc ctgggcttcg atttcattgc ctcggaaggc 180

aatgtggctg actgggactc gaccaagacc gcattcgaca aggtcaagtc cgaggtcggc 240

gaggttgatg tgctgatcaa caacgccggt atcacccgcg acgtggtgtt ccgcaagatg 300

acccgcgccg actgggatgc ggtgatcgac accaacctga cctcgctgtt caacgtcacc 360

aagcaggtga tcgacggcat ggccgaccgt ggctggggcc gcatcgtcaa catctcgtcg 420

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catggcttca ccatggcact ggcgcaggaa gtggcgacca agggcgtgac cgtcaacacg 540

gtctctccgg gctatatcgc caccgacatg gtcaaggcga tccgccagga cgtgctcgac 600

aagatcgtcg cgacgatccc ggtcaagcgc ctgggcctgc cggaagagat cgcctcgatc 660

tgcgcctggt tgtcgtcgga ggagtccggt ttctcgaccg gcgccgactt ctcgctcaac 720

ggcggcctgc atatgggctg a 741