人脐带间充质干细胞外泌体在制备治疗椎间盘退变药物中的应用

摘要

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞(UC‑MSC)外泌体在制备治疗椎间盘退变(IDD)药物中的应用，属于生物医药技术领域，本发明的UC‑MSC外泌体能够显著减轻髓核细胞(NPC)铁死亡与自噬，并抑制P38MAPK通路的激活，促进NPC增殖，而且显著改善椎间盘退变症状，此外脐带组织来源丰富、取材较为容易，外泌体具有低免疫原性等巨大优势，在临床应用中避免了干细胞移植所带来的免疫排斥反应，因此本发明有望为UC‑MSC外泌体治疗IDD的临床转化应用提供新依据。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞外泌体在制备治疗椎间盘退变药物中的应用。

背景技术

腰背痛是人类的常见、多发病，不仅严重影响个人生活质量，而且给家庭和社会带来沉重的经济负担。椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)导致的腰椎间盘突出症压迫脊神经是引起腰背痛的主要原因。在腰椎间盘突出症的早期阶段，患者主要通过卧床休息、理疗和止痛药等保守治疗方法缓解疼痛；而在发病后期，腰椎间盘突出压迫神经导致患者的疼痛无法缓解时，则需要进行脊柱融合术、椎间盘切除术或髓核摘除术等外科手术从根本上解除压迫。然而，手术治疗后可能会增加相邻椎间盘的机械负荷和应力，导致腰椎手术融合节段相邻椎间盘发生临椎病等后续问题，无法从根本上延缓或逆转椎间盘退变的进展以降低腰突症的发病率。作为脊柱承重和缓冲单位，椎间盘(IVD)由髓核(nucleus pulposus,NP)、软骨终板和纤维环(annulus fibrosus,AF)三部分组成。髓核细胞(NPC)是NP中主要的细胞类型，负责合成胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ及蛋白聚糖等凝胶状的细胞外基质，维持椎间盘的结构稳定和生物力学平衡。近年来，作为新颖细胞疗法的NPC移植和间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植是全球学者研究的热点。但伴随IDD程度加重，NPC活性和数量减少，很难获得足够的自体NPC用于移植。MSC具有自我更新和多向分化能力，其中脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UC-MSC)是一种来源丰富、生命力强、无痛采集且具有更快自我更新能力等突出优势的干细胞，有望成为椎间盘修复的理想细胞来源。

随着对干细胞疗法研究的深入，干细胞来源的外泌体凭借低免疫原性、可改造性强等独特优势，对椎间盘退变的治疗价值也备受关注。外泌体是由细胞内的多泡小体与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径为30～150nm的细胞外囊泡，包含蛋白质、脂质、mRNA、miRNA和lncRNA等多种有效成分，参与细胞间生物信息通讯、信号传导和代谢调节，而脐带间充质干细胞(umbilical cord MSC,UC-MSC)外泌体在IDD治疗中的作用及其机制却并不明确。因此，探究UC-MSC来源的外泌体对IDD的修复作用将有助于推进干细胞外泌体的IDD临床治疗应用转化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞外泌体(UC-MSC Exo)在制备治疗椎间盘退变药物中的应用，该UC-MSC Exo显著减轻了椎间盘退变症状，并有效促进退变髓核细胞的增殖和细胞外基质再生。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体在制备治疗椎间盘退变药物中的应用。

本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体在制备促进退变髓核细胞增殖药物中的应用。

优选地，所述脐带间充质干细胞外泌体抑制退变髓核细胞自噬和铁死亡。

优选地，所述脐带间充质干细胞外泌体抑制退变髓核细胞p38MAPK通路激活。

本发明还提供了一种治疗椎间盘退变药物，所述药物的有效成分为脐带间充质干细胞外泌体。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的盐。

优选地，上述脐带间充质干细胞外泌体的分离方法，包括以下步骤：

将脐带间充质干细胞溶液通过两步离心后，收集脐带间充质干细胞上清，然后加入至蔗糖/重水溶液中，离心收集沉淀，即得脐带间充质干细胞外泌体。

优选地，所述两步离心为将脐带间充质干细胞溶液以1800～2200g离心10～20min，得到脐带间充质干细胞上清后继续以11000～13000g离心25～35min，收集脐带间充质干细胞上清。

优选地，所述的蔗糖溶液是由蔗糖与重水按质量体积比为0.25～0.35:1制备而成。

优选地，离心收集沉淀时，所述离心的方式为90000～110000g超速离心2.5～3.5h。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体在制备治疗椎间盘退变药物中的应用，本发明的UC-MSC外泌体能够显著减轻髓核细胞(NPC)铁死亡与自噬，并抑制P38MAPK通路的激活，促进NPC增殖，而且显著改善椎间盘退变症状，此外脐带组织来源丰富、取材较为容易，因此本发明有望为UC-MSC外泌体治疗IDD的临床转化应用提供新依据。

附图说明

图1中A.NTA检测UC-MSC外泌体的粒径；B.Westernblot检测UC-MSC外泌体特征性抗原CD9和CD63的表达；C.透射电镜观察UC-MSC外泌体的形态，其中箭头所指的即为UC-MSC外泌体；

图2为UC-MSC外泌体对大鼠退变尾椎间盘的作用；A.不同组别的大鼠椎间盘进行磁共振(MRI)成像；B.不同组别的大鼠椎间盘使用苏木精-伊红(H&E)和阿利新蓝(AlcianBlue)染色图片；

图3中A.不同浓度UC-MSC外泌体与人退变髓核细胞共孵育，分别在24h、48h以及72h检测细胞增殖情况；B.Western blot检测不同组别的COL2A1表达情况；C.不同组别COL2A1表达的统计学分析；D.Westernblot检测不同组别的MMP13表达情况；E.不同组别MMP13表达的统计学分析；其中***P<0.001,**P<0.01；

图4中，A.Westernblot检测不同组别的自噬标志性蛋白LC3的表达情况；B.不同组别自噬标志性蛋白LC3表达的统计学分析；C.Westernblot检测不同组别的铁死亡标志性蛋白GPX4的表达情况；D.不同组别铁死亡标志性蛋白GPX4表达的统计学分析；其中，***P<0.001,*P<0.05；E.免疫荧光检测不同组别LC3点状数量变化；

图5中，A.Westernblot检测不同组别的p-p38MAPK/p38MAPK的表达变化；B.不同组别p-p38MAPK/p38MAPK表达的统计学分析；其中，***P<0.001。

具体实施方式

本发明提供了一种脐带间充质干细胞外泌体在制备治疗椎间盘退变药物中的应用。

本发明还提供了一种脐带间充质干细胞外泌体在制备促进退变髓核细胞增殖药物中的应用。

在本发明中，所述脐带间充质干细胞优选地取自人源、鼠源、兔源或猪源。本发明对脐带间充质干细胞、髓核细胞的分离培养方法不做具体限定，为本领域的常规方法。

在本发明中，所述脐带间充质干细胞外泌体抑制髓核细胞自噬和铁死亡，并抑制髓核细胞p38MAPK通路激活。

本发明还提供了一种治疗椎间盘退变药物，所述药物的有效成分为脐带间充质干细胞外泌体。

在本发明中，所述药物优选地还包括药学上可接受的盐。所述药物中有效成分的含量优选为0.1～99％。所述药物的剂型优选包括注射剂、片剂、颗粒剂、栓剂、胶囊剂、贴剂或混悬剂。

在本发明中，作为一优选的实施方式，上述脐带间充质干细胞外泌体的分离方法，包括以下步骤：

将脐带间充质干细胞溶液通过两步离心后，收集脐带间充质干细胞上清，然后加入至蔗糖/重水溶液中，离心收集沉淀，即得脐带间充质干细胞外泌体。

在本发明中，通过两步离心后，收集脐带间充质干细胞上清。所述两步离心优选为将脐带间充质干细胞溶液以1800～2200g离心10～20min，得到脐带间充质干细胞上清后继续以11000～13000g离心25～35min，收集脐带间充质干细胞上清。其中，为了除去细胞组分，本发明优选地以1800～2200g离心10～20min得到脐带间充质干细胞上清。为了除去细胞碎片，本发明优选地将得到脐带间充质干细胞上清继续以11000～13000g离心25～35min。

在本发明中，收集脐带间充质干细胞上清后，加入至蔗糖溶液中。所述的蔗糖溶液优选地是由蔗糖与重水按质量体积比为0.25～0.35:1制备而成。

在本发明中，加入至蔗糖溶液中后，离心收集沉淀，即得脐带间充质干细胞外泌体。所述离心的方式优选为90000～110000g超速离心2.5～3.5h。在本发明中，作为一优选的实施方式，将脐带间充质干细胞外泌体转移至超滤管中，加入PBS溶液2000～4000g离心10～20min，收集沉淀，离心重复3次，最后将脐带间充质干细胞外泌体溶于PBS中，备用。本发明通过超速离心方法分离脐带间充质干细胞外泌体，该方法简单高效，得到的脐带间充质干细胞外泌体的粒径大小集中在100～200nm，并能保证脐带间充质干细胞外泌体的生物活性。

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.1分离、鉴定人脐带间充质干细胞(UC-MSC)外泌体

1)征得济宁医学院附属医院医学伦理委员会批准，并经患者及家属知情同意，收集本院产科病人的新生儿脐带，采用常规方法分离培养人UC-MSC。

2)分离UC-MSC外泌体的分离

蔗糖溶液的制备：将蔗糖：重水按照0.3g：1mL比例混合后，即得。

将100mL脐带间充质干细胞溶液以2000g离心15min去除细胞组分，收集的UC-MSC细胞上清再以12000g离心30min去除细胞碎片，收集UC-MSC细胞上清至新的50mL离心管，约为45mL/管。配制5mL蔗糖/重水溶液放入50mL超速离心管中，将UC-MSC细胞上清小心缓慢地加至蔗糖/重水溶液液面上方，100000g超速离心3h，收集离心管底部的UC-MSC外泌体，将UC-MSC外泌体转移至10KDa超滤管，加入PBS，3000g离心15min，离心重复3次，最后将超滤管滤芯中浓缩的约200μLUC-MSC外泌体溶于500μLPBS中，备用。

3)采用常规的电镜、Nanosight、western blot方法对上述分离得到的UC-MSC外泌体进行鉴定。

由图1的结果表明，NTA检测外泌体的粒径大小集中在100～200nm之间，westernblot检测分离的外泌体表达特征性抗原CD9和CD63，透射电镜观察外泌体的形态呈“茶托状”，因此，上述分离得到的外泌体为UC-MSC外泌体。

1.2UC-MSC外泌体对椎间盘退变的影响

1.2.1UC-MSC外泌体对大鼠退变尾椎间盘的修复作用

1)构建大鼠尾椎间盘退变模型：

SD大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，8周龄，雄性，SPF级。

根据已发表文献(Developing consistently reproducible intervertebraldisc degeneration at rat caudal spine by using needle puncture.Huina Zhang,Frank La Marca,Scott J.Hollister,Steven A.Goldstein,and Chia-YingLin.JNeurosurg Spine，2009，10(6):522-530)使用的方法步骤，采用针刺损伤法构建大鼠尾椎间盘退变模型。将18只SD大鼠随机分为三组，实验前对大鼠尾椎间盘进行磁共振成像，正常组不进行任何处理，对照组和实验组使用21G穿刺针对大鼠尾椎间盘Co6/7和Co8/9穿刺造模。

2)对Co6/7和Co8/9椎间盘针刺损伤造模，1周后，向造模的大鼠尾椎间盘分别注射10μLPBS、10μL 10

由图2的结果表明，与PBS组相比，注射UC-MSC Exo组的大鼠Co6/7和Co8/9尾椎间盘结构和形态更完整，大鼠尾椎间盘退变症状显著减轻。

1.3UC-MSC外泌体对人原代髓核细胞的影响

1)分离、鉴定人原代髓核细胞：征得济宁医学院附属医院医学伦理委员会批准，并经患者及家属知情同意，收集本院脊柱外科腰椎间盘突出病人的椎间孔镜手术中取出的髓核组织，体外分离、鉴定人原代髓核细胞；

2)用500μM H

由图3结果可知，随着时间延长，与对照组相比，UC-MSC外泌体处理的人退变髓核细胞增殖速度明显加快(见图3中的A)；westernblot结果表明UC-MSC外泌体能够减弱H

1.4UC-MSC外泌体对退变髓核细胞铁自噬和铁死亡过程的影响

在有或无500μM H

由图4结果表明，UC-MSC外泌体减少H

1.5UC-MSC外泌体对p38MAPK信号通路的调控

在有或无500μM H

由图5可知，UC-MSC外泌体抑制H

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。