大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用

摘要

本发明公开了大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用，属于植物分子生物学领域。本发明提供了提供GmCOL2b蛋白或其编码基因等的相关生物材料在调控大豆种子大小中的应用，所述GmCOL2b蛋白为氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质，具体地，是通过降低所述GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性，使大豆的种子变小。本发明还提供了一种培育种子更小的大豆的方法，是通过对受体大豆中GmCOL2b蛋白的编码基因进行敲除而得到，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明为作物育种提供了宝贵的基因资源，可将大豆GmCOL2b基因广泛应用于大豆育种中。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用。

背景技术

大豆(Glycine max)是我国重要的经济和粮食作物，近年来，国内不断增长的大豆需求量导致国内大豆产量远远不能满足我国自身的大豆需求，对外依存度极高。大豆精准遗传改良可以大幅度加快大豆品种选育进程，对满足大豆生产需求意义重大。大豆种子大小是一个重要而复杂的农艺性状，与大豆产量和品质之间同时存在复杂且密切的联系，小粒品种往往具有更高的单株产量和品质，而大豆种子大小受多基因控制，可以通过遗传改良来控制。

近年来，大豆种子大小的研究一直都在进行。目前已有许多与大豆种子大小调控相关基因被克隆并通过转基因实验验证。例如，GmMYB73和GmGA20OX通过转化拟南芥得以验证；还有很多基因已在大豆本身得到验证，包括GmSWEET10a、GmSWEET10b和GmSWEET39等糖转运相关基因，GmCYP78A72和GmCYP78A5等细胞色素相关基因，以及GmFAD3、BIG SEEDS1、GmWRKY15a、PP2C-1、GmLEC2等。但目前为止，调控大豆种子大小的分子机理仍未被完全阐明，各基因之间的调控网络尚不明晰。因此，进一步挖掘与大豆种子大小相关基因对人们深入了解种子发育过程以及提高产量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该基因是大豆种子大小的关键调控基因，可以用于大豆不同种子大小品种的培育。

本发明的第一个目的是提供GmCOL2b蛋白或其相关生物材料在大豆育种中的应用，特别是调控大豆种子大小中的应用；所述GmCOL2b蛋白为氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质。所述的调控大豆种子大小可以应用于培育新品种大豆或者鉴定与筛选大豆品种。

优选地，所述的相关生物材料为大豆GmCOL2b蛋白的编码基因，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞。

更优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述的调控大豆种子大小，是通过降低所述GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性，使大豆的种子变小；或通过提高所述GmCOL2b蛋白在所述大豆中的表达量和/或活性，使大豆的种子变大。

本发明第二个目的是一种培育种子更小的大豆的方法，包括以下步骤：对受体大豆中GmCOL2b蛋白的编码基因进行敲除，得到种子更小的转基因大豆；所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，所述的敲除是用CRISPR/Cas 9系统对受体大豆中GmCOL2b蛋白的编码基因进行敲除。

更优选地，所述的CRISPR/Cas 9系统中，gRNA序列为：AAATGCTGCGGCACCTGAAC。

更优选地，包括以下步骤：

a.将靶点连接到U3gRNA表达盒，构建CRISPR/gRNA载体；然后将CRISPR/gRNA载体连接到pYLCRISPR/Cas9P35S-B双元载体，获得GmCOL2b敲除载体；所述的靶点序列为：GTTCAGGTGCCGCAGCATTTTCAACCCGG；

b.利用农杆菌介导的遗传转化将所述GmCOL2b敲除载体导入大豆愈伤组织中，获得从愈伤组织转化而来的植株col2b；

c.通过PCR对基因敲除靶点位置进行扩增并测序；

d.从T1代开始筛选除草剂阴性且靶点纯合植株，从而得到种子更小的转基因大豆。

进一步地，使用的引物序列如下：

步骤a中，所述GmCOL2b敲除载体的构建引物：

COL2b-AtU6-29T4F:attgAAATGCTGCGGCACCTGAAC，

COL2b-AtU6-29T4R:aaacGTTCAGGTGCCGCAGCATTT；

步骤c中，所述通过PCR对基因敲除靶点位置进行扩增并测序的检测引物：

COL2b-target-F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT，

COL2b-target-R:TGACTAAGAGAACCATCGTAACTG；

步骤d中，所述筛选除草剂阴性且靶点纯合植株的检测引物：

COL2b-target-F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT，

COL2b-target-R:TGACTAAGAGAACCATCGTAACTG。

与现有技术相比，本发明有益效果如下：

本发明首次揭示了大豆GmCOL2b基因控制大豆种子大小的生物学功能，该基因功能缺使大豆种子显著变小，百粒重显著降低。本发明为作物育种提供了宝贵的基因资源，可将大豆GmCOL2b基因广泛应用于大豆育种中。

附图说明

图1为pYLsgRNA-AtU3b载体结构图。

图2为pYLCRISPR/Cas9P35S-B双元载体结构图。

图3为对照植株和GmCOL2b敲除植株的基因编辑靶点序列的PCR扩增测序分析。

图4为W82植株和GmCOL2b敲除植株的种子籽粒大小的表型图，比例尺为5毫米。

图5为W82植株和GmCOL2b敲除植株的种子籽粒大小和百粒重。误差性代表标准误差(籽粒大小，n＝50；百粒重，n＝5)。**代表与W82植株相比存在显著性差异。双尾T检验用于显著性差异分析：**P<0.01。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。

下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序可自主完成或委托第三方基因公司完成。

实施例1 GmCOL2b敲除载体的构建及遗传转化

植物材料

供试是大豆品种为威廉82(williams 82)。

实施例1GmCOL2b敲除载体的构建及遗传转化

1、通过NCBI获得GmCOL2b的全基因组序列(SEQ ID No.1，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其表达的蛋白的序列如SEQ ID No.3所示)，该基因位于19号染色体，其在大豆中的基因位点编号为Glyma19g05170。通过网站(http://www.rgenome.net/cas-designer/)中的target design设计并选取脱靶率较低的靶点，靶点序列为：GTTCAGGTGCCGCAGCATTTTCAACCCGG(SEQ ID No.4)，gRNA序列为：AAATGCTGCGGCACCTGAAC(SEQ ID No.5)；并设计相应靶点引物为：

F：attgAAATGCTGCGGCACCTGAAC；

R：aaacGTTCAGGTGCCGCAGCATTT。

2、利用载体pYLsgRNA-AtU3b(图1)载体，将靶点连接到U3gRNA表达盒，特异引物扩增出表达盒产物，详细地：先进行第一轮PCR，PCR扩增引物：U-F：5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3；gRNA-R:5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3。随后进行第二轮，用位置特异引物扩增出表达盒产物。PCR扩增引物：F：attgAAATGCTGCGGCACCTGAAC；R：aaacGTTCAGGTGCCGCAGCATTT。

PCR反应体系：

3、并将扩增后的片段连接到pPTG-gRNA-Cas9-AtU6-1双元载体，获得GmCOL2b敲除载体pYLCRISPR/Cas9P35S-B(图2)。连接反应步骤如下：配制10μl 1x BsaI酶切连接反应液：在1x Bsa I-内切酶Buffer(NEB公司)中加入0.5μl 10 x NEB T4 DNA ligase buffer至终浓度0.5～1.0mM，随后加入约20ng pPTG-gRNA-Cas9-AtU6-1质粒(预先配好20ng/μl保存)，0.5μl接头(最终浓度0.05～0.1μM)，～5UBsaI(NEB公司)，～35U T4 DNA ligase(Takara公司)。用变温循环仪(或PCR仪)循环反应5循环：37℃5min，20℃5min。

4、利用农杆菌EH105菌株介导的遗传转化将上述GmCOL2b敲除载体pYLCRISPR/Cas9P35S-B导入大豆愈伤组织中，获得从愈伤组织转化而来的植株col2b。

5、通过PCR对基因敲除靶点位置进行扩增并测序。

PCR引物：

COL2b-target-F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT，

COL2b-target-R:TGACTAAGAGAACCATCGTAACTG。

PCR体系：

PCR程序：在95℃预变性10min，进入循环扩增阶段：95℃30s→59℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温10min。

6、从T1代开始筛选除草剂阴性且靶点纯合突变体植株。详细地，利用步骤5的检测方法。对靶点位置进行PCR检测，进行PCR测序，挑选靶点位置DNA序列编辑且纯合的株系，并进行利用除草剂特异引物进行筛选，获得阴性植株筛选。引物：

COL2b-target-F:ATTCACTTCCCTTCCTCCAAAT，

COL2b-target-R:TGACTAAGAGAACCATCGTAACTG；

PCR体系：

对获得的纯合植株的种子进行观察，对种子籽粒大小表型拍照，用image J测量种子面积，并用分析天平称量百粒重。

通过PCR扩增突变位点，并通过序列测定，检测突变位点确定序列突变情况(突变类型)，如图3所示。对种子进行观察发现，col2b种子籽粒明显比W82减小(图4)。通过数据统计种子籽粒大小和百粒重，GmCOL2b敲除株系的种子籽粒大小和百粒重均显著低于野生型的W82(图5)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明群里要求书确定的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 大豆GmCOL2b基因在调控种子大小中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3710

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 1

taaaaaaaaa gtatcatatt tagagagact aaaagattat ttaagtcaaa aaataatttt 60

tgtttagcat ttgttctcac cgagttctag gcaagtgatc cgtcttcgtc ttccctttag 120

tagttgaaca ggtcaattgg ttaaaccaca gattgatgga agtgatataa tgattaaata 180

tgcgatatat attacttgtg tcacatatta atgaaattgt gcggatggtc tagtggtaaa 240

tatactagaa agattttcct agacaaagat cgactctatg gttggtaatt tacttttaca 300

atttccttaa aatagtcaag taactagctg taaacctcag caaatttagt acttggagca 360

actatgaaca attaatgata tttattttaa acattccacc ttaattaaca tcttagttct 420

ccaaactcca ccaaccaaaa atttctattt attttcataa tcacaagcac tccacattct 480

atctgcaaaa tcagtaatta accaaacact tgctttaatc cttttagagc caataagatt 540

actgagagga aaggatatat taaggggtaa caagagattc taactggtgc aagtatagaa 600

tctacatgga cccaaatgac acgtgtctcc aagttgtgtc accatagcaa tacgaacaaa 660

gcctcagcat ctctttaatg attccaaaag gcaaagaagc aacatgcatg gacaggtcca 720

acaccaaaac aaaaaaccct ctctcctaat caaccctgaa acacaaccaa ccacaagata 780

agcaagaact tgtgcacgcc actaacttgc tgccacgttg gcactcttga ttctcccccc 840

aacactactt ggttcacctc actaaactca atttctcact cacactcact tcagttcaat 900

tcacttccct tcctccaaat tagttccaac acaaaaacca agcaaagaaa aagactctac 960

cgaaacactt cactactcat acaatatttt cagacacaac atgttgaagg aaggcaccaa 1020

caacgttggt ggcagcaaca ctggcaccac ctggtcacgt gtctgtgaca cgtgcctgtc 1080

tgcgccatgc gtgctgtact gccatgcaga ctcagcatat ctttgctctt cctgtgatgc 1140

tcgtgtgcat gcagctaacc gtgtggcctc gagacacaag cgtgtgtggg tgtgcgaagc 1200

gtgtgagcgt gctccggcgg cgtttctatg caaagctgac gcagcttctc tttgttcttc 1260

ctgtgatgct gacattcact cagcaaaccc tctcgctagc cgccacaacc gtgttcccat 1320

tctcccgatc tcaggttccc tcttcaggga accagagcac aatcacaaac gcgtggaaca 1380

cgcgttcgtg aatgaggttg aggaggaaga ggaaggggtt tttgatgagt atgaagacga 1440

ggttgaagct gcttcgtggt tgttgccaca tcctatgaaa aataatgatg aaattgagga 1500

gaatgattgt ggtgacgagg gttttttgtt tgttgatgag tatttggaca atcttgttga 1560

ttgttgtaac tcatgtggtc acaatgacaa ccagtttagc aacgtttatc agcaccagca 1620

gaattacaac actgtccctc agaactatgt agtggttcca gttcaggtgc cgcagcattt 1680

tcaacccggt ttggactttg actcatcaaa agctgggttc agttacgatg gttctcttag 1740

tcaaagtgta agactcttct tttcaattac ttctgtgttt ctttttcggt ttgtttttta 1800

tatgaatagt gttttccctt tttctctttc tttttctttt cccagactct ttggatcatt 1860

catccattgg attatacttt atcagatttt gattttgcct tgacaccttt gctaactctt 1920

ccttccaatt ggcagtttct ttcctttctc cgttcatatg aaactagggt tttaaattat 1980

actcatgatc aataatttgg ttgcaatttt tgatattgta gtacaattgc tattgttgtt 2040

gtgaaaagtt aaaaaaatct taatgttgta accgaaatct caatcacata ctgtttgtaa 2100

aatccttggt tgaaatcaaa gtgggtttcc caagtagctt cttttactag aaacgctagc 2160

aaagtcaact actctagttc aattgccata tatgtgacta atttgattca ttccacaact 2220

cttcatattt ctttgactac ccttttaccg ttcactttgc ggtcttgaga gacttttatt 2280

tattttcttt tttgtcgtat ataagatcag ctttgccttt atggtgtctt ttatttgcta 2340

gttatagttg tgattcctct taaactttgt ttcctcattt catcaactgt atattaattt 2400

cccataattt ttcagcttca attaaaaaaa ttgagcctaa gtgcctgatt tattaaagcc 2460

acaaaatggg tggtttaatt ttttcgacac ctttctttta tatttctttt actcttcttc 2520

tcttttcttt ttctattaca tcatctataa tatatcttca cctttttctt cttactttgg 2580

ggacaaacat ttttgtttca caaagctggt tagctactag tttattgctt agaaaattta 2640

tagccttacc tgtgatctct caaacttcat acacgatttt gtgttaatct tttatatttc 2700

atttttaatt taggtttcgg tttcatcaat ggatgttgga gttgtacccg aatcaacagt 2760

aagtggcatc tcaatgtccc actcaaagtc accaataggg acaaatgacc tatttcctcc 2820

ccttctcatg ccttcacatc tcacaccaat ggacagagag gcaagagtcc taagatatag 2880

ggagaaaaag aagacaagaa agttcgagaa gaaaataaga tatgcctcaa ggaaggccta 2940

tgcagagact agaccccgca taaagggtcg ttttgcaaag agaactgatg tagaagctga 3000

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tcattggaag aacttcatgt aatttttatg tagtctaatt agtttggtat tatatttact 3180

tctatcttgt gctttataaa tataaagtat catttgagtc gctatatatt ttgtctacat 3240

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tagtcgaggt cttaaagaat ccaaacgaga agtaaaattc aagattacaa ttttgtactg 3600

atagttcaat tttccatgtt aggagatata atgttaattt gatggtaaaa gaagaaggaa 3660

aaaagaaata aattgtgagt ttaaattcat tcgagttaaa aaaattaata 3710

<210> 2

<211> 1101

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 2

atgttgaagg aaggcaccaa caacgttggt ggcagcaaca ctggcaccac ctggtcacgt 60

gtctgtgaca cgtgcctgtc tgcgccatgc gtgctgtact gccatgcaga ctcagcatat 120

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gcagcttctc tttgttcttc ctgtgatgct gacattcact cagcaaaccc tctcgctagc 300

cgccacaacc gtgttcccat tctcccgatc tcaggttccc tcttcaggga accagagcac 360

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tttgatgagt atgaagacga ggttgaagct gcttcgtggt tgttgccaca tcctatgaaa 480

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tatttggaca atcttgttga ttgttgtaac tcatgtggtc acaatgacaa ccagtttagc 600

aacgtttatc agcaccagca gaattacaac actgtccctc agaactatgt agtggttcca 660

gttcaggtgc cgcagcattt tcaacccggt ttggactttg actcatcaaa agctgggttc 720

agttacgatg gttctcttag tcaaagtgtt tcggtttcat caatggatgt tggagttgta 780

cccgaatcaa cagtaagtgg catctcaatg tcccactcaa agtcaccaat agggacaaat 840

gacctatttc ctccccttct catgccttca catctcacac caatggacag agaggcaaga 900

gtcctaagat atagggagaa aaagaagaca agaaagttcg agaagaaaat aagatatgcc 960

tcaaggaagg cctatgcaga gactagaccc cgcataaagg gtcgttttgc aaagagaact 1020

gatgtagaag ctgaagtgga tcagatgttc tccacaaaac tattcaatga agttggaggt 1080

agcatttttc ccactttcta g 1101

<210> 3

<211> 366

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 3

Met Leu Lys Glu Gly Thr Asn Asn Val Gly Gly Ser Asn Thr Gly Thr

1 5 10 15

Thr Trp Ser Arg Val Cys Asp Thr Cys Leu Ser Ala Pro Cys Val Leu

20 25 30

Tyr Cys His Ala Asp Ser Ala Tyr Leu Cys Ser Ser Cys Asp Ala Arg

35 40 45

Val His Ala Ala Asn Arg Val Ala Ser Arg His Lys Arg Val Trp Val

50 55 60

Cys Glu Ala Cys Glu Arg Ala Pro Ala Ala Phe Leu Cys Lys Ala Asp

65 70 75 80

Ala Ala Ser Leu Cys Ser Ser Cys Asp Ala Asp Ile His Ser Ala Asn

85 90 95

Pro Leu Ala Ser Arg His Asn Arg Val Pro Ile Leu Pro Ile Ser Gly

100 105 110

Ser Leu Phe Arg Glu Pro Glu His Asn His Lys Arg Val Glu His Ala

115 120 125

Phe Val Asn Glu Val Glu Glu Glu Glu Glu Gly Val Phe Asp Glu Tyr

130 135 140

Glu Asp Glu Val Glu Ala Ala Ser Trp Leu Leu Pro His Pro Met Lys

145 150 155 160

Asn Asn Asp Glu Ile Glu Glu Asn Asp Cys Gly Asp Glu Gly Phe Leu

165 170 175

Phe Val Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Leu Val Asp Cys Cys Asn Ser Cys

180 185 190

Gly His Asn Asp Asn Gln Phe Ser Asn Val Tyr Gln His Gln Gln Asn

195 200 205

Tyr Asn Thr Val Pro Gln Asn Tyr Val Val Val Pro Val Gln Val Pro

210 215 220

Gln His Phe Gln Pro Gly Leu Asp Phe Asp Ser Ser Lys Ala Gly Phe

225 230 235 240

Ser Tyr Asp Gly Ser Leu Ser Gln Ser Val Ser Val Ser Ser Met Asp

245 250 255

Val Gly Val Val Pro Glu Ser Thr Val Ser Gly Ile Ser Met Ser His

260 265 270

Ser Lys Ser Pro Ile Gly Thr Asn Asp Leu Phe Pro Pro Leu Leu Met

275 280 285

Pro Ser His Leu Thr Pro Met Asp Arg Glu Ala Arg Val Leu Arg Tyr

290 295 300

Arg Glu Lys Lys Lys Thr Arg Lys Phe Glu Lys Lys Ile Arg Tyr Ala

305 310 315 320

Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Thr Arg Pro Arg Ile Lys Gly Arg Phe

325 330 335

Ala Lys Arg Thr Asp Val Glu Ala Glu Val Asp Gln Met Phe Ser Thr

340 345 350

Lys Leu Phe Asn Glu Val Gly Gly Ser Ile Phe Pro Thr Phe

355 360 365

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaatgctgcg gcacctgaac 20