一种鸡骨草与毛鸡骨草高效薄层鉴别方法

摘要

本发明涉及一种鸡骨草与毛鸡骨草高效薄层鉴别方法。该高效薄层鉴别方法包括如下步骤：S1：以甲醇溶液作为提取液对待测物进行提取，过滤，取滤液蒸干，并配制为待测液，备用；以夏佛塔苷作为对照品配制对照液，备用；S2：利用薄层色谱法对待测液和对照液进行测定，根据待测液与对照液的显色斑点，判断所述待测物是鸡骨草，还是毛鸡骨草。本发明提供的高效薄层鉴别方法可实现鸡骨草与毛鸡骨草的高效鉴别，利于鸡骨草的质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及药物质量控制技术领域，特别涉及一种鸡骨草与毛鸡骨草高效薄层鉴别方法。

背景技术

鸡骨草在我国药源丰富，它既是食品也是药品，主要集中于两广地区。鸡骨草富含多种化学成分，主要化学成分为生物碱类，黄酮类，多糖类，皂苷类等。鸡骨草提取物具有抗癌、抗菌、抗炎、抗病毒及保肝等作用。鸡骨草最早记载于近代书籍《岭南采药录》，主要用来治疗肝胆方面的疾病，在临床上主要为单味制剂和复方制剂使用，目前临床制剂有复方鸡骨草胶囊、鸡骨草丸、结石通片、鸡骨草肝炎颗粒、复方鸡骨草片等。最新2020版《中国药典》规定鸡骨草为豆科植物广州相思子(Abrus cantoniensis Hance)的干燥全株。然而目前在市场上流通的大都是毛鸡骨草，在民间常出现混用现象，因此，如何快速有效的鉴别鸡骨草与毛鸡骨草药材成了重中之重。

鸡骨草与毛鸡骨草的外观形态相似，叶片的区别较大，但其药材在市场上流通时大都无叶片，导致鸡骨草药材不易通过其叶片的形态差异来鉴别基源。目前对鸡骨草药材的鉴别是以相思子碱作为对照参照进行薄层鉴定(国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[S].北京:中国医药科技出版社，2020.)，但鸡骨草及毛鸡骨草均含有相思子碱成分，利用该薄层鉴色谱法无法实现两者的有效区分。

因此，开发一种可高效鉴别鸡骨草与毛鸡骨草的方法具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的鉴别方法无法有效区分鸡骨草与毛鸡骨草的缺陷或不足，提供一种鸡骨草与毛鸡骨草高效薄层鉴别方法。本发明提供的高效薄层鉴别方法可实现鸡骨草与毛鸡骨草的高效鉴别，利于鸡骨草的质量控制。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸡骨草与毛鸡骨草高效薄层鉴别方法，包括如下步骤：

S1：以甲醇溶液作为提取液对待测物进行提取，过滤，取滤液蒸干，并配制为待测液，备用；以夏佛塔苷作为对照品配制对照液，备用；

S2：利用薄层色谱法对待测液和对照液进行测定，根据待测液与对照液的显色斑点，判断所述待测物是鸡骨草，还是毛鸡骨草；

S2中所述薄层色谱法以乙酸乙酯-甲酸-水混合液、乙酸乙酯-冰醋酸-水混合液或乙酸乙酯-丙酮-甲酸混合液作为展开剂，以三氯化铝溶液作为显色剂。

薄层色谱法是中药鉴别的常用方法，但如果想利用薄层色谱法实现鸡骨草与毛鸡骨草高效鉴别，需要解决以下几个问题：

(1)鸡骨草与毛鸡骨草中存在差异性成分，并可形成专属性斑点，以作为区分的基础；

(2)鸡骨草与毛鸡骨草中存在相同成分，利用提取工艺可以实现鸡骨草与毛鸡骨草中各成分的提取，特别是其相同成分及差异性成分的提取，以获得含有相同和差异成分的待测液，进而进行薄层色谱鉴定。

(3)利用薄层色谱法可以成功实现待测液中各提取成分的有效分离，并成功显色，进而通过该差异性成分的显色光斑(专属性斑点)来区分鸡骨草与毛鸡骨草。

经发明人研究发现，利用甲醇溶液作为提取液对鸡骨草与毛鸡骨草进行提取，可以实现鸡骨草与毛鸡骨草中差异化学成分和有效成分(夏佛塔苷)的提取，进而得到待测液；然后以夏佛塔苷作为对照，利用特定的展开剂和显色剂对待测液进行薄层检测时，在Rf值为0.18处，鸡骨草和毛鸡骨草均呈现出黄色荧光斑点，表明鸡骨草和毛鸡骨草均含有夏佛塔苷成分；在Rf值为0.72处，鸡骨草都含有相同的蓝色荧光斑点，而在同一位置处毛鸡骨草无蓝色荧光斑点呈现，进而可通过蓝色荧光斑点是否出现来区分鸡骨草与毛鸡骨草。

提取溶剂、展开剂和显色剂的选用是影响薄层检测结果的关键。如选用乙醇溶液作为提取液，在Rf值为0.72的±3％处，无蓝色荧光斑点呈现；如利用其它溶液(例如正己烷-乙酸乙酯)作为展开剂各荧光斑点的分离度不高，无法明显地区分显色的斑点；如利用其它显色剂(例如硫酸乙醇溶液、茚三酮试液、香草醛硫酸乙醇溶液等)来显色，无法获得可区分的荧光光斑。

即本申请通过选用特定的对照品，并利用特定的提取液，展开剂和显色剂等，了实现鸡骨草与毛鸡骨草的高效鉴别，利于鸡骨草的质量控制。

优选地，S1中所述待测物和提取液的料液比为1:(20～50)g/mL。

优选地，S1中所述甲醇溶液的体积分数为50％～100％。

优选地，S1中所述提取方式为超声提取、回流提取或冷浸提取。各方法均可实现较好的提取效果

优选地，S1中所述提取的温度为20～80℃，时间为30～60min。

优选地，S1中选用甲醇作为溶剂来配制待测液和对照液。

优选地，S2的乙酸乙酯-甲酸-水混合液中乙酸乙酯、甲酸和水的体积比为(9～18):1:1；乙酸乙酯-冰醋酸-水混合液中乙酸乙酯、冰醋酸和水的体积比为(9～18):1:1；乙酸乙酯-丙酮-甲酸混合液中乙酸乙酯、丙酮和甲酸的体积比为(9～18):1:1。

优选地，S2中所述薄层色谱法选用高效硅胶G板、默克HPTLC板或高效HF254nm板作为显色板。

优选地，S2中所述薄层色谱法中点样量为2～10μL。

优选地，S2中三氯化铝溶液的浓度为1～5％。

优选地，S2中当待测液出现蓝色荧光斑点时，所述待测物为鸡骨草；反之，则为毛鸡骨草。

优选地，所述待测物为鸡骨草或毛鸡骨草。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的高效薄层鉴别方法可实现鸡骨草与毛鸡骨草的高效鉴别，利于鸡骨草的质量控制。

附图说明

图1为多批次鸡骨草供试品溶液和对照品溶液的薄层色谱图；其中：1.空白(甲醇)；2.对照品(夏佛塔苷)；3.供试品(编号ACH1)；4.供试品(编号ACH2)；5.供试品(编号ACH3)；6.供试品(编号ACH4)；7.供试品(编号ACH5)；8.供试品(编号ACH6)；9.供试品(编号ACH7)；10.供试品(编号ACH8)；11.供试品(编号ACH9)。

图2为多批次毛鸡骨草供试品溶液和对照品溶液的薄层色谱图；其中：1.空白(甲醇)；2.对照品(夏佛塔苷)；3.供试品(编号AMH1)；4.供试品(编号AMH2)；5.供试品(编号AMH3)；6.供试品(编号AMH4)；7.供试品(编号AMH5)；8.供试品(编号AMH6)；9.供试品(编号AMH7)；10.供试品(编号AMH8)11.供试品(编号AMH9)；12.供试品(编号AMH10)；13.供试品(编号AMH11)；14.供试品(编号AMH12)。

图3为多批次鸡骨草供试品溶液和多批次毛鸡骨草供试品溶液的薄层色谱图；其中：1.空白(甲醇)；2.对照品(夏佛塔苷)；3.供试品(编号ACH1)；4.供试品(编号ACH2)；5.供试品(编号ACH3)；6.供试品(编号ACH4)；7.供试品(编号ACH5)；8.供试品(编号AMH1)；9.供试品(编号AMH2)；10.供试品(编号AMH3)；11.供试品(编号AMH4)；12.供试品(编号AMH5)；13.供试品(编号AMH6)。

图4为不同提取方法考察薄层色谱图；其中，1～13分别对应供试品溶液提取方法1～13。

图5为不同展开溶剂系统考察薄层色谱图；其中：1.供试品(编号ACH1)；2.供试品(编号ACH2)；3.供试品(编号AMH1)；4.供试品(编号ACH4)；5.供试品(编号ACH5)；6.供试品(编号AMH1)。

图6为不同展开溶剂系统考察薄层色谱图；其中：1.供试品(编号ACH1)；2.供试品(编号ACH4)；3.供试品(编号ACH5)；4.供试品(编号AMH1)。

图7为不同薄层板考察薄层色谱图；其中：1.供试品(编号ACH1)；2.供试品(编号ACH4)；3.供试品(编号ACH5)；4.供试品(编号AMH1)。

图8为不同点样量考察薄层色谱图；其中：供试品(编号ACH5)1.2μL；2.5μL；3.8μL；4.10μL；供试品(编号AMH1)5.2μL；6.5μL。

图9为不同显色剂考察薄层色谱图；其中：1.对照品(夏佛塔苷)；2.供试品(编号ACH5)；3.供试品(编号ACH2)；4.供试品(编号ACH7)；5.供试品(编号AMH1)。

图10为不同湿度条件考察色谱图；其中：1.对照品(夏佛塔苷)；2.供试品(编号ACH5)；3.供试品(编号ACH2)；4.供试品(编号ACH7)；5.供试品(编号AMH1)。

图11为不同温湿度考察色谱图；其中：1.对照品(夏佛塔苷)；2.供试品(编号ACH5)；3.供试品(编号ACH2)；4.供试品(编号ACH7)；5.供试品(编号AMH1)。

图12为系统适应性考察薄层色谱图；其中：1.对照品(夏佛塔苷)；2.供试品(编号ACH5)；3.供试品(编号ACH2)；4.供试品(编号ACH7)；5.供试品(编号AMH1)。

图13为方法专属性考察薄层色谱图；其中：注：1.空白(甲醇)；2.对照品(夏佛塔苷)；3.供试品(编号ACH5)；4.供试品(编号ACH2)；5.供试品(编号ACH7)；6.供试品(编号AMH1)。

图14为方法重复性考察薄层色谱图；其中：1.对照品(夏佛塔苷)；2.供试品(编号ACH5-1)；3.供试品(编号ACH5-2)；4.供试品(编号ACH5-3)；5.供试品(编号ACH5-4)；6.供试品(编号ACH5-5)；7.供试品(编号ACH5-6)。

图15为方法稳定性考察薄层色谱图；其中：1.对照品(夏佛塔苷)；2.供试品(编号ACH5)；3.供试品(编号ACH2)；4.供试品(编号ACH7)；5.供试品(编号AMH1)。

图16为采购鸡骨草药材鉴定结果图；其中：1.对照品(夏佛塔苷)；2.供试品(J1)；3.供试品(J2)。

图17为采购毛鸡骨草药材鉴定结果图；其中：1.对照品(夏佛塔苷)；2.供试品(M1)；3.供试品(M2)；4.供试品(M3)。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

本发明各实施例中的薄层鉴别参照高效薄层色谱法测定(USP43-203)进行。

1.供试品溶液及对照品溶液的制备与测定法：

(1)供试品溶液的制备：取本品粉末1g，加甲醇40mL，超声处理30min，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，即得供试品溶液。

对照品溶液的制备：取夏佛塔苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。

测定法：照高效薄层色谱法(USP43-203)试验，吸取供试品溶液5μL、对照品溶液2μL，采用全自动点样仪分别点于同一高效硅胶G薄层板上，利用展开剂展开乙酸乙酯-甲酸-水(9:1:1)，取出，晾干，喷以显色剂1％三氯化铝试液，吹干，供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且在Rf值(0.72)的±3％范围内有/无蓝色荧光斑点显现。

2.仪器与试剂

本发明实施例所用的仪器设备见下表1。

表1使用的仪器

本发明实施例所用试剂为：

乙酸乙酯、冰醋酸、甲醇、正丁醇、三氯甲烷、甲酸、丙酮，均为分析纯，广州化学试剂厂；

香草醛、茚三酮、六水合氯化镁纯度98％、氯化钠纯度99.5％、硫氰化钾纯度98.5％，均为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；

正己烷，色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

超纯水，实验室自制。

本发明实施例所用对照品为：夏佛塔苷，批号：111912-201703，95.6％，购于中国食品药品鉴定研究院。

鸡骨草样品批次编号为ACH1-ACH9，毛鸡骨草样品批次编号为AMH1-AMH12，由中山市中智药业集团有限公司提供。

实施例1

一种鸡骨草与毛鸡骨草高效薄层鉴定方法，包括以下步骤：

S1.对照品溶液的制备：

精密称取对照品夏佛塔苷0.01119g，加甲醇溶液制成浓度为1.119mg/mL，即得。

S2.鸡骨草与毛鸡骨草供试品溶液的制备：

精密称取1g鸡骨草或毛鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入40mL甲醇溶液，超声30min，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液。

S3.鸡骨草与毛鸡骨草高效薄层色谱测定：

采用高效薄层色谱法，在相同的检测条件下分别获得供试品溶液和对照品溶液的色谱图；

检测条件包括：

薄层板：高效薄层G板；

展开剂：乙酸乙酯-甲酸-水(9：1：1)；饱和展缸20min，平衡薄层板15min，展开距离8cm；

点样量：供试品5μL，对照品2μL；

显色剂：1％三氯化铝试液；

检测：晾干，喷以1％三氯化铝试液，吹干，置紫外光灯(366nm)下检视，记录色谱图。

分别取ACH1-ACH9鸡骨草供试品溶液和对照品溶液，按照上述薄层色谱条件进行测定，色谱图如图1所示，在Rf值为0.20处，各鸡骨草供试品溶液出现与对照品夏佛塔苷相同的显色斑点(黄色荧光斑点)，在Rf值为0.72处，各鸡骨草供试品溶液均出现蓝色荧光斑点。

分别取AMH1-AMH12毛鸡骨草供试品溶液和对照品溶液，按照上述薄层色谱条件进行测定，色谱图如图2所示，在Rf值为0.18处，各毛鸡骨草供试品溶液出现与对照品夏佛塔苷相同的显色斑点(黄色荧光斑点)，而在Rf值为0.72的±3％处，，各毛鸡骨草供试品溶液均无蓝色荧光斑点显现。

为更清晰明了的呈现色谱图的差别，将ACH1-ACH5鸡骨草供试品溶液与AMH1-AMH6毛鸡骨草供试品溶液点于同一高效薄层G板上，并按上述薄层色谱条件进行测定，结果如图3所示，在Rf值为0.20处，各鸡骨草与毛鸡骨草供试品溶液均出现与对照品夏佛塔苷相同的显色斑点(黄色荧光斑点)，在Rf值为0.70处，各鸡骨草供试品溶液出现蓝色荧光斑点，而各毛鸡骨草溶液未出现呈现相同斑点，因此，此蓝色荧光斑点为鸡骨草药材的专属性斑点，可以用来进行鸡骨草与毛鸡骨草药材的鉴别。

实施例2

1提取条件考察

本实验从提取溶剂(甲醇、乙醇)、提取方法(超声、回流、冷浸)、提取溶剂浓度(50％、80％和100％甲醇)、提取时间(30min、45min、60min)、提取料液(0.5g:20mL、1g:20mL、1g:30mL、1g:40mL、1g:50mL)五个方面考察了鸡骨草中化学成分提取效果的因素。

提取方法如下：

提取方法1：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇溶液，超声60min(20～40℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液1。

提取方法2：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入20mL乙醇溶液，超声60min(20～40℃)用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液2。

提取方法3：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇溶液，超声30min(20～40℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液3。

提取方法4：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇溶液，超声45min(20～40℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液4。

提取方法5：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇溶液，回流提取60min(80℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液5。

提取方法6：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇溶液，冷浸过夜(20℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液6。

提取方法7：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入20mL 80％甲醇溶液，超声30min(20～40℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液7。

提取方法8：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入20mL 50％甲醇溶液，超声30min(20～40℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液8。

提取方法9：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇溶液，超声30min(20～40℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液9。

提取方法10：精密称取0.5g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入20mL甲醇溶液，超声30min，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液10。

提取方法11：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇溶液，超声30min(20～40℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液11。

提取方法12：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入40mL甲醇溶液，超声30min(20～40℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液12。

提取方法13：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入50mL甲醇溶液，超声30min(20～40℃)，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液。

将上述13种提取方法所制备的供试品溶液1～13按实施例1中的薄层色谱条件进行检测，用薄层成像仪记录色谱图。结果见图4，从图中可以看出甲醇比乙醇对鸡骨草的化学成分提取效果比较好，除提取方法2外各提取方法的薄层色谱的显色斑点在同一位置相一致，只是成分斑点颜色深浅不同。因此，优选供试品的制备方法为提取方法12：精密称取1g鸡骨草药材粉末(过三号筛)，于150mL的具塞锥形瓶中，加入40mL甲醇溶液，超声30min，用漏斗过滤至蒸发皿中，于水浴锅上蒸干，冷却，后加入2mL的甲醇溶液溶解，过0.22μm的微孔滤膜，即得供试品溶液。

2 薄层色谱条件考察

2.1 展开溶剂系统的选择

以各显色斑点的分离度为选择标准，首先比较了3种极性段的展开剂，低极性系统正己烷-乙酸乙酯、中等极性系统氯仿-甲醇、高极性系统正丁醇-甲醇对鸡骨草供试品溶液中化学成分的分离效果，之后并在此基础上进行薄层展开条件的优化。

弱极性系统：展开剂A-C：正己烷-乙酸乙酯(3:1)、正己烷-乙酸乙酯(6:1)、正己烷-乙酸乙酯(9:1)

中等极性系统：展开剂D-F：氯仿-甲醇(3:1)、氯仿-甲醇(6:1)、氯仿-甲醇(9:1)

强极性系统：展开剂G-I：正丁醇-甲醇(3:1)、正丁醇-甲醇(6:1)、正丁醇-甲醇(9:1)

以上结果见图5。

根据图5的结果可知，鸡骨草中的化学成分在中等和高极性段能进行较好的分离，进而优化展开剂系统：展开剂J-N：乙酸乙酯-甲酸-水(9:1:1)、乙酸乙酯-冰醋酸-水(9:1:1)、乙酸乙酯-丙酮-甲酸(10:1:1)、乙酸乙酯-甲酸-水(9:0.5:0.5)、乙酸乙酯-甲酸-水(15:1:1)结果见图6，由图可知，在展开剂J-N条件下均可以区分显色的斑点，实现鸡骨草和毛鸡骨草药材的鉴别，其中在展开剂J、展开剂M、展开剂N条件下各斑点的分离度高，可以明显的区分显色的斑点，鉴别鸡骨草和毛鸡骨草药材的效果更好。

2.2薄层板的考察

以各显色斑点的分离度为选择标准，考察同一供试品溶液在不同生产厂家薄层板(HPTLC默克G板、青岛海洋高效G板、青岛海洋高效HF254nm板)对薄层展开效果的影响，以乙酸乙酯-甲酸-水(9:1:1)为展开剂，1％三氯化铝试液显色，在紫外光366nm下观察，结果见图7，默克HPTLC板的各斑点的条带狭窄呈现性好但各斑点的分离度不高，青岛海洋高效G板和HF254nm板的各斑点的位置相一致且分离度高，在Rf值为0.18处均有黄色荧光斑点显现，在Rf值为0.72处ACH1、ACH4、ACH5鸡骨草药材有蓝色荧光斑点显现，而毛鸡骨草药材处无斑点显现，从节约金钱成本考虑，薄层板选择青岛海洋高效G板。

2.3点样量的考察

以各显色斑点的条带宽窄为选择标准，考察同一供试品溶液点样2μL、5μL、8μL、10μL对薄层展开效果的影响，以乙酸乙酯-甲酸-水(9:1:1)为展开剂，1％三氯化铝试液显色，在紫外光366nm下观察，结果如图8所示，点样量为2μL时各化合物斑点颜色呈现性弱，点样量为8μL和10μL时各化合物的条带较为宽大易拖尾，而点样量为5μL时各化合物的条带狭窄呈现性较好斑点清晰可见。

2.4显色剂的优化

以色谱图能呈现鸡骨草与毛鸡骨草成分差别为选择标准，考察同一供试品溶液对不同显色剂的显色效果，以乙酸乙酯-甲酸-水(9:1:1)为展开剂，平行展开4组薄层板，依次喷以1％三氯化铝试液、3％三氯化铝试液、5％三氯化铝试液、10％硫酸乙醇溶液、茚三酮试液、1％香草醛硫酸乙醇溶液(1→10)显色，喷以1％三氯化铝试液、3％三氯化铝试液、5％三氯化铝试液在紫外光366nm下观察，其他3种显色剂在日光下显色，结果见图9，喷以1％三氯化铝试液、3％三氯化铝试液、5％三氯化铝试液的薄层板能鉴别区分开鸡骨草与毛鸡骨草药材，而其他三种显色剂无法鉴别区分。

3耐用性考察

考察不同温度(4℃：85％，20℃：50％，26℃：85％，35℃：50％)和不同相对湿度(33％：22℃、47％：22℃、75％：22℃)条件下对薄层展开效果的影响，以乙酸乙酯-甲酸-水(9:1:1)为展开剂，1％三氯化铝试液显色，在紫外光366nm下观察，结果见图10-11。由图可知在不同的相对湿度和温度的条件下，薄层展开图相一致，但在低温条件下，斑点扩散性小呈现性较好，结果表明，所建立的高效薄层鉴定方法耐用性好。

实施例3

方法学验证

1.系统适应性考察

取鸡骨草和毛鸡骨草样品适量，按实施例1中的样品制备方法制备供试品溶液及对照品溶液，并按实施例1中的薄层色谱条件进行检测，结果如图12所示，在Rf值为0.18处，鸡骨草和毛鸡骨草均呈现出黄色荧光斑点，表明鸡骨草和毛鸡骨草均含有夏佛塔苷成分。在Rf值为0.72处，鸡骨草都含有相同的蓝色荧光斑点，而在同一位置处毛鸡骨草无蓝色荧光斑点呈现。

2.方法专属性考察

取鸡骨草、毛鸡骨草供试品溶液及甲醇溶液按实施例1中的薄层色谱条件进行检测，考察薄层鉴定的方法是否受提取溶剂(甲醇)的影响，检测结果如图13所示，在甲醇溶剂处无其他斑点干扰，表明该方法的专属性良好。

3.方法重复性考察

取适量鸡骨草药材，按实施例1中的样品制备方法制备供试品溶液，平行制备6份，并按实施例1中的薄层色谱条件进行测定，结果如图14所示，各个样品之间在同一位置有相同的斑点显现，表明该方法的重复性良好。

4.方法稳定性考察

取适量鸡骨草和毛鸡骨草药材各1g，按实施例1中的样品制备方法制备供试品溶液，分别在第0、1、2、3天按实施例1中的薄层色谱条件进行检测，结果如图15所示，相同位置处样品斑点显色在3天内无变化，表明供试品制备的提取溶液在3天内稳定。

实施例4

取采购的鸡骨草(见表2)样品适量，按实施例1中的样品制备方法制备供试品溶液及对照品溶液，并按实施例1中的薄层色谱条件进行检测，结果如图16所示，在Rf值为0.18处，J1和J2鸡骨草均呈现出黄色荧光斑点，表明所采购的鸡骨草均含有夏佛塔苷成分。在Rf值为0.70处，所采购的鸡骨草都含有相同的蓝色荧光斑点，表明所采购的鸡骨草药材为药典规定品种广州相思子。

表2采购的鸡骨草药材

取采购的毛鸡骨草(见表3)样品适量，按实施例1中的样品制备方法制备供试品溶液及对照品溶液，并按实施例1中的薄层色谱条件进行检测，结果如图17所示，在Rf值为0.20处，M1-M3毛鸡骨草均呈现出黄色荧光斑点，表明采购的各毛鸡骨草均含有夏佛塔苷成分。在Rf值为0.72的±3％处，采购的各毛鸡骨草均无蓝色荧光斑点呈现，表明所采购的毛鸡骨草药材鉴定为毛鸡骨草。

表3采购的毛鸡骨草药材

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。