基于液质联用技术的鸡骨草与毛鸡骨草化学成分、药动学和排泄动力学比较研究

摘要

鸡骨草和毛鸡骨草分别为豆科相思子属植物广东相思子Abrus cantoniensis Hance和毛相思子Abrus mollis Hance去除荚果的干燥全草，主要盛产于广东、广西等地。《中国药典》对鸡骨草有收录，毛鸡骨草则收录于《广东省中药材标准》等地方标准中。据文献报道两者的药理作用类似，如都具有清热解毒，利湿等作用，均能用于治疗急慢性肝炎或用于煲汤、煮凉茶等保健食疗。临床上常把毛鸡骨草作为鸡骨草的替代品使用。
　　本文首先建立了一种简单、灵敏、可靠的可同时测定鸡骨草与毛鸡骨草中15种黄酮、2种酚酸和3种生物碱类成分含量的液质联用（HPLC-MS/MS）方法，用于不同产地的15批鸡骨草和27批毛鸡骨草药材的比较与评价，同时测定了4批鸡骨草与7批毛鸡骨草的根、茎和叶的含量，比较各成分在两种药材不同部位的差异性。该实验不仅为鸡骨草和毛鸡骨草的质量控制提供了有效分析方法，更为鸡骨草和毛鸡骨草的替代合理性评价提供了依据。
　　为进一步评价鸡骨草和毛鸡骨草的替代合理性，更好的为鸡骨草和毛鸡骨草的临床使用提供指导，本文对二者的体内过程进行了较深入的比较研究。分别建立LC-MS/MS法比较研究了灌胃给予大鼠鸡骨草和毛鸡骨草提取物后4种黄酮和2种生物碱类成分的药动学特征，尿液和胆汁中主要成分的排泄动力学特点。
　　第一部分基于液质联用技术的鸡骨草与毛鸡骨草主要化学成分含量的比较研究
　　目的：建立LC-MS/MS方法同时测定鸡骨草及毛鸡骨草药材中15种黄酮、2种酚酸及3种生物碱类成分，通过多重线图和聚类分析对二者进行比较，并对同一药材的根、茎和叶等不同部位中化学成分的含量进行测定，比较不同药材及不同部位化学成分的异同，初步为评价二者相互替代的合理性及临床合理用药提供依据。
　　方法：色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5μm），流动相为甲醇-乙腈-0.5‰乙酸水溶液，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，进样量10μL。采用单因素试验对提取条件进行优化，运用所建立的方法对鸡骨草及毛鸡骨草进行了测定，运用聚类分析对不同来源的鸡骨草及毛鸡骨草药材的茎进行分类比较。质谱检测采用多反应监测（MRM）模式，ESI源，正负离子切换模式。源喷射电压（IS）为5500/-4500 V；雾化温度为650℃；雾化气（GS1，N2）：4.14×105 Pa；辅助气（GS2，N2）：4.48×105 Pa；气帘气（N2）：1.72×105 Pa。
　　结果：方法学结果显示20种化学成分的峰面积与浓度在测定浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r2≥0.9904，精密度、准确度、稳定性、检测限和定量限均符合要求，平均加样回收率为94.3–108.2％。样品测定结果表明，在鸡骨草和毛鸡骨草中都含有此20种化学成分。虽然不同产地的鸡骨草与毛鸡骨草化学成分绝对含量差异较大，但是每种成分的相对含量相差不大。通过比较根、茎、叶中的20种成分的总含量发现：在毛鸡骨草中，叶>茎>根；在鸡骨草中，叶>根>茎。在鸡骨草与毛鸡骨草中，异夏佛塔苷和夏佛塔苷在叶中的含量最高；然而，相思子碱和刺桐碱在根中含量最高。
　　结论：本法简便、灵敏度高、专属性好，可用于鸡骨草及毛鸡骨中15种黄酮，2种酚酸和3种生物碱类成分的含量测定，该方法可用于二者的质量控制。通过对鸡骨草及毛鸡骨草含有的主要化学成分含量的比较，初步说明二者的相互替代具有一定的合理性。
　　第二部分液质联用法测定鸡骨草与毛鸡骨草中6种成分在大鼠血浆中的浓度及其药代动力学比较研究
　　目的：建立HPLC-MS/MS方法同时测定鸡骨草及毛鸡骨草中下箴刺桐碱、相思子碱、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、异甘草素和木犀草素等6种成分在大鼠血浆中的浓度，并用于对比研究两种药材提取物灌胃给予大鼠后的药代动力学特征。
　　方法：按一定剂量灌胃给予大鼠鸡骨草与毛鸡骨草提取物，分别于给药后不同时间点眼内眦取血，制备血浆样品。用甲醇沉淀蛋白，离心，取上清液，过滤，注入色谱系统，采用内标法进行定量。色谱柱为ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇（A）和0.5‰乙酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序如下：初始0~4 min，30%A；4~8 min，30~36%A；8~12 min，36%~95%A；12~16 min保持95%A不变，流速为1 mL/min，预平衡时间10 min，进样量20μL。质谱条件与第一部分相同。采用DAS3.0软件获得各成分的药动学参数，并对两种药材中相同成分的药动学参数进行比较。
　　结果：方法学验证结果表明，血浆中6种成分与内标的峰面积之比与样品中的浓度在测定浓度范围内呈良好的线性关系（r2≥0.9933），日内与日间精密度的RSD%范围为3.7%-14.6%，RE%为-11.0%-13.5%，平均回收率与基质效应的范围分别为83.5%-102.7%和69.2%-101.0%，均在允许的范围内。药动学试验结果表明，6种成分进入胃肠道后吸收快速，所有成分均在3h内达到最大血药浓度，黄酮类在大鼠体内的吸收要快于生物碱类，并且4种黄酮成分的Tmax相同。但是这6种化合物在体内的消除速率差异较大，黄酮苷类化合物（夏佛塔苷和异夏佛塔苷）要比苷元（异甘草素和木犀草素）的消除速率慢。比较鸡骨草与毛鸡骨草的药动学结果发现，两种药材中相同化合物的药时曲线具有很高的一致性，除下箴刺桐碱和相思子碱的达峰时间略有差异外，其余4种成分没有差别。
　　结论：本文建立的HPLC-MS/MS方法简单快速、灵敏度高、专属性强，可用于测定大鼠血浆中此6种成分的浓度；实验结果表明鸡骨草与毛鸡骨中的相同化学成分具有相同的药动学特征，进一步证明了二者在临床使用上相互替代的合理性。
　　第三部分液质联用法测定鸡骨草与毛鸡骨草中主要成分在大鼠尿液和胆汁中的浓度及其排泄动力学比较研究
　　目的：建立同时测定尿液中9种成分和胆汁中6种成分的HPLC-MS/MS方法，并对鸡骨草与毛鸡骨草中这些成分在大鼠尿液和胆汁中的排泄动力学进行比较。
　　方法：取SD大鼠，按一定剂量灌胃给予鸡骨草与毛鸡骨草提取物，置于代谢笼中，收集不同时间段的尿液并分别记录体积；另取SD大鼠，麻痹后进行胆管插管术，按一定剂量灌胃给予鸡骨草与毛鸡骨草提取物，收集并记录不同时间段的胆汁体积。收集的尿液和胆汁经与血浆处理相同的方法进行预处理，取滤液注入色谱系统，进样量10μL，采用内标法进行定量，色谱条件和质谱条件与第一部分相同。
　　结果：方法学验证结果表明，尿液中9种成分、胆汁中6种成分与内标的峰面积之比与样品中的浓度在测定浓度范围内呈良好的线性关系（r2≥0.9933），日内与日间精密度，平均回收率与基质效应均在允许范围内。鸡骨草与毛鸡骨草中的被测成分96小时内基本经尿液排泄完全。除芒柄花素在尿液中的排泄率最高外，其他成分以原型的排泄率并不高。两种药材相比，下箴刺桐碱和芒柄花素的尿累积排泄百分数相差最大，其他成分无明显差别。比较鸡骨草与毛鸡骨草的胆汁排泄结果发现，各成分以原型在胆汁的排泄率很低。除相思子碱在胆汁的排泄率没差异外，其他5种成分有差异。
　　结论：本文建立的HPLC-MS/MS方法简单、快速、灵敏度高，可用于测定尿液中的9种成分和胆汁中的6种成分的浓度，实验结果表明，鸡骨草与毛鸡骨草中的多数成分在尿液中的排泄情况相似，但在胆汁中差异较大，本研究为全面评价二者相互替代的合理性提供了依据。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写

引言

第一部分基于液质联用技术的鸡骨草与毛鸡骨草主要化学成分含量的比较研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分液质联用法测定鸡骨草与毛鸡骨草中6种成分在大鼠血浆中的浓度及其药代动力学比较研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分液质联用法测定鸡骨草与毛鸡骨草中主要成分在大鼠尿液和胆汁中的浓度及其排泄动力学比较研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:鸡骨草与毛鸡骨草的现代研究进展

致谢

个人简历