羟基红花黄色素A在制备治疗子宫腺肌病药物中的应用

摘要

本发明公开了羟基红花黄色素A在制备治疗子宫腺肌病药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明以口服他莫昔芬诱导子宫腺肌病模型小鼠为研究对象，首次发现羟基红花黄色素A对子宫腺肌病的治疗作用，其能缓解小鼠子宫内膜和腺体向肌层的浸润，胶原沉积，上皮间质转化以及纤维化的发生发展。本发明为提供一种新的治疗子宫腺肌病药物奠定了药理基础，为子宫腺肌病的治疗提供了一种新的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种羟基红花黄色素A在制备治疗子宫腺肌病药物中的新用途，属于生物医药技术领域。

背景技术

子宫腺肌病是一种由子宫内膜腺体和间质向下侵入子宫肌层，发生出血、肌纤维结缔组织增生，形成弥漫性或局限性病变的常见良性妇科疾病。临床表现主要有痛经、月经过多、子宫异常出血、慢性盆腔疼痛、生育率低下及不孕等。目前流行病学尚无准确的临床数据，行子宫切除术检测出的患病率约为20％-30％，随着检测手段的进步，患病率呈现上升趋势，患者也由原来认为的30-50岁经产妇，扩大到更为年轻的未生育女性。子宫腺肌病尚缺乏有效的治疗手段，目前治疗手段主要是手术治疗和药物治疗，药物治疗存在患者症状停药反复，更年期症状、闭经等诸多不良反应。临床治疗应考虑患者年龄、症状及生育需求，基于目前患者年龄呈现下降趋势，年轻患者保留生育需求的现状，临床上亟需有效的治疗药物。

羟基红花黄色素A(hydroxysaffloryellowA,HSYA)是菊科植物红花药理功效的最有效水溶性成分，可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体的结合，是红花黄色素的活血化瘀有效成分，现有技术中已有关于羟基红花黄色素A抗血小板和抗心肌缺血作用、抗氧化、抗肿瘤活性等方面的报道，但尚无羟基红花黄色素A用于治疗子宫腺肌病方面的介绍。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中治疗子宫腺肌病药物存在的不足，提供一种羟基红花黄色素A在制备治疗子宫腺肌病药物中的新用途。

技术方案

羟基红花黄色素A在制备治疗子宫腺肌病药物中的应用，所述羟基红花黄色素A的结构式如下所示：

进一步，所述药物包括羟基红花黄色素A和药学上可接受的赋形剂。

进一步，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、贴剂、膏剂、喷雾剂、注射剂、口服液或纳米制剂。

一种用于治疗子宫腺肌病的药物，所述药物包括羟基红花黄色素A，还包括药学上可接受的赋形剂。

本发明的有益效果：

本发明通过实验研究发现，羟基红花黄色素A能够减少模型动物子宫内膜向肌层浸润，上调E-cadherin，下调N-cadherin和Vimentin蛋白水平，抑制上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)，抑制胶原沉积，降低血清中TGF-β1水平，抑制子宫腺肌病纤维化的发展，因此推断并证明其能够用于子宫腺肌病的治疗。

附图说明

图1为模型组和对照组小鼠子宫石蜡切片的HE染色图；

图2为小鼠子宫形态及石蜡切片HE染色图；

图3为小鼠子宫石蜡切片Masson染色图；

图4为药物治疗后小鼠子宫E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白水平变化的Western Blot检测结果；

图5为药物治疗后小鼠子宫E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白水平变化的统计图；

图6为小鼠血清中TGF-β1水平的ELISA检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作详细的说明。

实施例1

口服他莫昔芬诱导子宫腺肌病模型建立：

16只ICR小鼠(雌鼠12只，雄鼠4只，6周龄，体重18～20g，由南京大学医学院动物房提供)，以雄雌比1:3的比例进行合笼，检查到雌鼠受孕后将雄鼠取出。将新生ICR小鼠随机分组(模型组n＝45，对照组n＝10)，小鼠出生第2-5天进行下列处理：模型组滴喂5μL/g的花生油/卵磷脂/炼乳混合液(2:0.2:3,v/v/v)+2.7μmol/kg他莫昔芬的混悬液，对照组滴喂不含药物的等剂量溶媒混合液；1-21d均由母鼠哺乳喂养，22d起与母鼠分笼，自由饮食摄水。所有的小鼠均于空气湿度为50％-60％、温度为21℃、光照/黑暗各12小时的清洁级鼠房中饲养。日龄42d时随机选取小鼠处死，取子宫，石蜡切片HE染色观察内膜侵入子宫肌层情况，判断造模是否成功。

图1为模型组和对照组小鼠子宫石蜡切片的HE染色图，其中，图1A和图1C分别为对照组和模型组小鼠子宫石蜡切片的HE染色图，图1B和图1D图分别为图1A和图1C图的局部放大图片，由图1结果可知，模型组于42d时出现肌束紊乱，内膜侵入子宫肌层的现象，证明口服他莫昔芬诱导子宫腺肌病模型建立。

实施例2

取周龄为16周的造模小鼠(n＝40)及空白对照小鼠(Control，n＝8)，造模小鼠随机分为5组：模型组(Model)、阳性药对照组(Celecoxib，塞来昔布6.5mg/kg)、羟基红花黄色素低剂量组(HSYAL,2.5mg/kg)、羟基红花黄色素中剂量组(HSYAM,5mg/kg)、羟基红花黄色素高剂量组(HSYAH,10mg/kg)，给药方式为腹腔注射(ip)，模型组与空白对照组给予等量生理盐水，每日给药，持续3周，每周检测体重。给药3周后，异氟烷麻醉小鼠，行球后静脉丛取血，离心(5000g,4℃,15min)，得到的小鼠血清置于-80℃保存。取血后处死小鼠，取子宫。称子宫湿重，一侧子宫角置于4％多聚甲醛中固定，另一侧置于液氮速冻后，-80℃冰箱保存。后续提取小鼠子宫全蛋白进行蛋白免疫印迹实验，分析药物治疗后小鼠子宫EMT相关蛋白N-cadherin、E-cadherin及Vimentin在蛋白水平的变化。

测试方法及测试结果如下：

(1)取4％多聚甲醛固定子宫组织进行石蜡包埋，切成4μm厚度切片，进行HE染色和Masson染色，考察羟基红花黄色素A对子宫形态及纤维化的作用。

小鼠子宫形态及石蜡切片HE染色图见图2。图2显示：在子宫形态上，模型组子宫壁增厚，给予羟基红花黄色素A治疗后有明显缓解；对小鼠子宫石蜡切片进行HE染色，模型组小鼠内膜或腺体侵入子宫肌层中部，羟基红花黄色素A有剂量依赖性的改善作用。图3为小鼠子宫石蜡切片Masson染色图，图3中的柱状图是使用Image J软件计算出的胶原纤维与组织总面积比值的定量图。

结果显示：模型组小鼠子宫出现明显胶原沉积，纤维化加剧，给予羟基红花黄色素A治疗，中、高剂量组胶原沉积显著减少。

(2)提取小鼠子宫全蛋白，用蛋白免疫印迹法检测羟基红花黄色素A对EMT标志蛋白的作用。

取-80℃冰箱中保存的小鼠子宫组织，使用眼科剪将组织剪碎，含有1％的PMSF、1％的cocktai1的RIPA裂解液，超声破碎，离心(4℃，5000rpm)后取上清液。上清液加入总体积五分之一的5×loadingbuffer溶液，于100℃的金属浴中加热8分钟，使蛋白变性以备后续实验。按照试剂说明书配置相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶、电泳缓冲液、转膜缓冲液以及封闭液。将蛋白样品点入上样孔中，设置电泳电压为60伏至所有样品跑出浓缩胶后，将电压调制120伏直至溴酚蓝电泳至凝胶最下端。使用湿转法在将聚凝胶中的蛋白转至PVDF膜上，转膜电压为100伏，时间为90min。使用5％脱脂牛奶与室温下进行封闭2h。根据marker指示，在相应的蛋白分子量位置剪切下相应的蛋白条带，于4℃摇床孵育过夜。次日使用TBST洗涤3次，每次10min，使用5％脱脂牛奶稀释的二抗，于室温下孵育2h后，使用TBST清洗3次，每次10min。使用ECL发光液进行发光反应，于自动曝光仪中进行发光检测并获取相应的蛋白图像，利用Image J进行灰度分析。

图4为药物治疗后小鼠子宫E-cadherin、N-cadherin及Vimentin在蛋白水平变化的Western Blot检测结果，图5为统计图，由图4和5可知，模型组中E-cadherin下调，N-cadherin和Vimentin上调，提示子宫腺肌病组织中发生EMT，羟基红花黄色素A治疗以剂量依赖的形式抑制EMT发生。

(3)酶联免疫法(ELISA)检测小鼠血清中TGF-β1水平

取-80℃冰箱中保存的小鼠血清，使用小鼠TGF-β1ELISA试剂盒(EM010，依科赛生物科技)检测血清中TGF-β1水平，按照试剂盒的步骤进行测定。测试结果见图6。

由图6可知，模型组小鼠血清TGF-β1水平明显上调，给予羟基红花黄色素A治疗后下调。

综上，本发明以口服他莫昔芬诱导子宫腺肌病模型小鼠为研究对象，首次发现羟基红花黄色素A对子宫腺肌病的治疗作用，其能缓解小鼠子宫内膜和腺体向肌层的浸润，胶原沉积，EMT以及纤维化的发生发展。本发明为提供一种新的治疗子宫腺肌病药物奠定了药理基础，为子宫腺肌病治疗下一步研究提供实验和理论依据。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，不对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员依据本发明的技术实质对上述技术实施方式进行任何简单修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。