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适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因序列及应用

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本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种新的高效表达碱性蛋白酶的地衣芽胞杆菌工程菌株的构建及应用。本发明通过对克劳氏芽胞杆菌（Bacillus clausii）来源的碱性蛋白酶进行改造和筛选，获得了适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因，所述基因为SEQ ID NO.7所示。将该基因在地衣芽胞杆菌BL10中进行表达，使用国标法检测，构得的地衣芽胞杆菌工程菌株的蛋白酶酶活力，该突变株的碱性蛋白酶酶活力达到29114.85 U/mL，相比原始的碱性蛋白酶生产株的酶活提高了19.41%，本发明促进了碱性蛋白酶应用水平的提高。

著录项

公开/公告号CN114807100A

专利类型发明专利
公开/公告日2022-07-29

原文格式PDF
申请/专利权人湖北大学;
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申请/专利号CN202210471439.7
发明设计人陈守文;张清;贺诗思;朱婉莹;蔡冬波;
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申请日2022-04-28
分类号C12N9/56;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/10;
代理机构武汉宇晨专利事务所(普通合伙);
代理人龚莹莹
地址 430000 湖北省武汉市武昌区友谊大道368号
入库时间 2023-06-19 16:09:34

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2022-07-29

公开

发明专利申请公布

说明书

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及高效表达碱性蛋白酶的地衣芽胞杆菌工程菌株及其构建方法与应用。

背景技术

碱性蛋白酶(alkaline protease)是指在pH偏碱性(9-11)范围内水解蛋白质肽键的内肽酶，属于丝氨酸蛋白水解酶类，分子大小在27kD左右。碱性蛋白酶是在工业用酶中占据的比例最大，主要用作加酶洗涤剂，也在食品、医疗、酿造、丝绸等行业有广泛应用。

当前碱性蛋白酶在蛋白体系中表达水平逐渐成熟，并正处于瓶颈期，急需从多种角度创新突破，构建高效表达碱性蛋白酶的地衣芽胞杆菌工程菌株。碱性蛋白酶在外源蛋白表达体系中表达的基因序列，大多未经过密码子优化工作，便直接用于蛋白表达生产。而目的蛋白的来源菌株与蛋白表达体系的GC含量不尽相同，编码相同氨基酸所使用的密码子的比例也有一定差异，蛋白表达体系中的某些含量较低的密码子可能成为限制目的蛋白翻译和高效表达的重要因素。虽然密码子的优化是本领域的常规技术，但优化本身也存在不确定性，目前的优化多借助相关软件辅助分析完成，通常直接使用最优密码子完成替换过程，其往往并不能最终获得更好的产量提高。有研究表明，密码子的随机化处理(Menzella,2011)、非最优密码子的使用(Zhou,2013)会显著影响蛋白质的结构和功能。因此，进行基因的密码子优化，需要进一步综合考虑目的基因的翻译速率和空间结构、二级结构等因素的复杂关系，往往需要根据经验甚至是运气达到优化的目的。此外，单因素的改变对终目标产生的影响较小，多因素的叠加有助于获得更理想的效果。由于各单因素并非彼此独立，叠加效果也并不总能达到“1+1＝2”的效果。突变位点的个数和顺序的不同组合，将助力筛选到更有实际提升效果的优异突变体。

Menzella HG.Comparison of two codon optimization strategies toenhance recombinant protein production in Escherichia coli.Microb CellFact.2011；10:15.Published 2011Mar 3.doi:10.1186/1475-2859-10-15.

Zhou M,Guo J,Cha J,et al.Non-optimal codon usage affects expression,structure and function of clock protein FRQ.Nature.2013；495(7439):111-115.doi:10.1038/nature11833.

发明内容

适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因，所述基因为SEQ ID NO.7所示。

适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因在制备碱性蛋白酶中的应用。将本发明提供的基因在地衣芽胞杆菌中进行表达，相比原始的碱性蛋白酶生产株的酶活提高了19.41％。

为了达到上述目的，本发明采取了以下措施：

适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因，所述基因为SEQ ID NO.7所示。

适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因在制备碱性蛋白酶中的应用，是将SEQ ID NO.7所示基因在地衣芽胞杆菌中进行表达。

以上所述的应用中，优选的，目前报道的地衣芽胞杆菌均可用于本发明，优选的，碱性蛋白酶的表达宿主为地衣芽胞杆菌BL10(CN104630123A，CCTCC NO：M2013400)。

以上所述的应用中，优选的，将SEQ ID NO.7所示基因在地衣芽胞杆菌中进行表达时，表达载体为pHY300PLK。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

克劳氏芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌的导致碱性蛋白酶在地衣芽胞杆菌中表达受限，本发明通过基因突变，对密码子进行替换，并将有利突变位点进行不同的叠加组合，将组合后的碱性蛋白酶基因转入地衣芽胞杆菌工程菌株BL10后，酶活达到29114.85U/mL，相比原始的碱性蛋白酶生产株的酶活提高了19.41％，本发明促进了碱性蛋白酶应用水平的提高。

附图说明

图1碱性蛋白酶含有的地衣芽胞杆菌差异密码子的种类与位置示意图；

差异密码子已突出显示。

图2本发明的碱性蛋白酶突变菌株的PCR扩增电泳图

泳道1-3为BL10/aprE，泳道4-6为BL10/aprE-L14，泳道6-9为BL10/aprE-P87，泳道10-12为BL10/aprE-P97，泳道13-15为BL10/aprE-P116，泳道16-18为BL10/aprE-P125，泳道19-21为BL10/aprE-P150，泳道22-24为BL10/aprE-P125，泳道25-27为BL10/aprE-P150，泳道28-30为BL10/aprE-P162、泳道31-32为BL10/aprE-P165，泳道32-34为BL10/aprE-L199，泳道35为BL10/aprE-P240，泳道36为BL10/aprE-P306，泳道37为BL10/aprE-P315，泳道38为BL10/aprE-P344，泳道39为BL10/aprE-L355。目的大小均为2333bp。

图3为不同突变体发酵后得到的碱性蛋白酶酶活。

图4为有利突变位点的叠加表达菌株的碱性蛋白酶酶活示意图。

图5为有利突变位点的叠加表达菌株的PAGE电泳

泳道1、2为对照BL10/aprE，泳道3、4为叠加突变菌株BL10/aprE-L14-L199-L355。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1：

碱性蛋白酶不同密码子的确定

克劳氏芽胞杆菌中碱性蛋白酶aprE的序列为SEQ ID NO.1所示，对应的氨基酸为SEQ ID NO.2所示。

将克劳氏芽胞杆菌中碱性蛋白酶中的第14、199、355位的亮氨酸密码子CUA换为CUG，第87、97、116、125、150、162、165、240、306、315、344位的脯氨酸密码子CCA换为CCG(图1)。

实施例2：

碱性蛋白酶原始表达载体和突变表达载体构建

构建碱性蛋白酶表达载体pHY-aprE的包括以下步骤：

以pHY300PLK质粒为模板，使用引物(pHY-GJ-F、pHY-GJ-R)扩增出表达载体骨架，以地衣芽胞杆菌DW2为模板，使用引物(P43-F、P43-R)扩增出P43启动子(含有SEQ ID NO.3所示序列)，以克劳氏芽胞杆菌DNA为模板，使用引物(aprE-F、aprE-R)扩增出碱性蛋白酶基因aprE；重叠延伸PCR将P43启动子、碱性蛋白酶基因aprE连接，得到表达框P43-aprE；利用重组克隆试剂盒将表达框和载体骨架进行同源重组，并转化到大肠杆菌DH5α中，将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为pHY-amp-F与pHY-amp-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由武汉擎科生物技术有限公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，得到游离表达载体pHY-aprE。使用的引物如下：

pHY-GJ-F：gtaaaggataaaacagcacaattc

pHY-GJ-R：acacgctaactgtcagaccaagt

P43-F：tgctgttttatcctttactgataggtggtatgttt

P43-R：caacggtttcttcatgtgtacattcctctc

aprE-F：gagaggaatgtacacatgaagaaaccgttg

aprE-R：gtctgacagttagcgtgttgccgcttc

pHY-amp-F：gtttattatccatacccttac

pHY-amp-R：cagatttcgtgatgcttgtc。

以现存的碱性蛋白酶表达载体pHY-aprE为模板，使用设计的突变引物，扩增出突变体的骨架。设计的突变引物序列如下：

aprE-L14-F：cactgctcatttctgttgct

aprE-L14-R：caacagaaatgagcagtgcg

aprE-P87-F：taagcccggaagatgtgg

aprE-P87-R：ccacatcttccgggctta

aprE-P97-F：gaactcgatccggcgatttc

aprE-P97-R：gaaatcgccggatcgagttc

aprE-P116-F：caatcagtgccgtggggaat

aprE-P116-R：attccccacggcactgattg

aprE-P125-F：caagccccggctgcccat

aprE-P125-R：atgggcagccggggcttg

aprE-P150-F：cactcatccggacttaaa

aprE-P150-R：tttaagtccggatgagtg

aprE-P162-F：ctttgtaccgggggaacc

aprE-P162-R：ggttcccccggtacaaag

aprE-P165-F：ggaaccgtccactcaaga

aprE-P165-R：tcttgagtggacggttcc

aprE-L199-F：cggaactgtacgctgttaaag

aprE-L199-R：taacagcgtacagttccg

aprE-P240-F：cttcgccgagtgccacac

aprE-P240-R：gtgtggcactcggcgaag

aprE-P306-F：gtcgcaccgggtgtaaac

aprE-P306-R：gtttacacccggtgcgac

aprE-P315-F：cacatacccgggttcaac

aprE-P315-R：gttgaacccgggtatgtg

aprE-P344-F：caaaagaacccgtcttgg

aprE-P344-R：ccaagacgggttcttttg

aprE-L355-F：catctgaagaatacggcaac

aprE-L355-R：tgccgtattcttcagatg。

琼脂糖凝胶电泳分离出目的骨架DNA，使用OMEGA的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，随后将少量突变体骨架DNA加入到大肠杆菌DH5α感受态中，利用菌株自身修复系统，完成突变载体的环化。将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为pHY-amp-F与pHY-amp-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由武汉擎科生物技术有限公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，即突变载体构建成功，即为碱性蛋白酶突变体aprE-L14(含有SEQ ID NO.4所示序列)、aprE-P87、aprE-P97、aprE-P116、aprE-P125、aprE-P150、aprE-P125、aprE-P150、aprE-P162、aprE-P165、aprE-L199(含有SEQ ID NO.5所示序列)、aprE-P240、aprE-P306、aprE-P315、aprE-P344和aprE-L355(含有SEQ ID NO.6所示序列)。

实施例3：碱性蛋白酶突变体的表达菌株的构建

提取突变载体和原始载体的质粒，具体操作过程参考OMEGA的Plasmid Mini KitI试剂盒说明书。将提取好的质粒转化进入地衣芽胞杆菌BL10(CN104630123A，CCTCC NO：M2013400)感受态细胞中，PCR扩增筛选阳性转化子，得到表达突变型碱性蛋白酶的芽胞杆菌菌株，分别为BL10/aprE-L14、BL10/aprE-P87、BL10/aprE-P97、BL10/aprE-P116、BL10/aprE-P125、BL10/aprE-P150、BL10/aprE-P125、BL10/aprE-P150、BL10/aprE-P162、BL10/aprE-P165、BL10/aprE-L199、BL10/aprE-P240、BL10/aprE-P306、BL10/aprE-P315、BL10/aprE-P344和BL10/aprE-L355，以及对照菌株BL10/aprE(pHY-aprE直接转入BL10中)。PCR产物的凝胶电泳如图2所示。

实施例4：突变体的碱性蛋白酶摇瓶发酵检测及筛选

1、菌株活化

将实施例3中获得的表达碱性蛋白酶突变体的菌株与对照菌株划线于四环素抗性平板上，37℃培养12-14h。挑取单菌落接种于5mL(有四环素抗性的)LB培养基中，37℃、220r/min，摇床培养12-14h。随后将培养好的菌液转接到20mL(有四环素抗性的)种子液培养基中，37℃、220r/min，摇床培养12-14h。

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，装液量5mL。

种子液培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L,装液量20mL。

2、发酵培养

将步骤1中得到的种子液，接种到碱性蛋白酶发酵培养基中，37℃、220r/min，摇床培养约48h。

碱性蛋白酶发酵培养基：玉米淀粉40g/L，豆粕45g/L，碳酸钙5g/L，硫酸铵4g/L，pH7.0。

3、酶活检测与分析

将步骤2中发酵结束后培养基，12000rpm高速离心8-10min，取上清液，使用国标法(GBT23527-2009蛋白酶制剂的测定方法)检测碱性蛋白酶活力(具体数据见表1，图3)。

表1

由表1可看出，使用碱性蛋白酶发酵培养基培养48h，本发明构建的密码子替换的突变体的碱性蛋白酶活力有不同程度的上升或下降，说明正如本领域的常规认知，密码子的优化存在不稳定性，并不清楚是否优化后就能提升产量。其中突变菌株BL10/aprE-L14、BL10/aprE-L199和BL10/aprE-L355发酵48h后酶活分别达到28382.18U/mL、28045.54U/mL、27590.10U/mL，相比原始的碱性蛋白酶生产株的酶活提高了13.19％、11.85％、10.03％，上述三个碱性蛋白酶基因序列的第14位、第199位、第355位的亮氨酸密码子CUA替换为CUG。

实施例5：叠加突变菌株构建与酶活力检测

将实施例4中有利突变位点L14、L199、L355(酶活提高已达显著水平，即p<0.05)进行叠加组合，构建得到突变载体aprE-L14-L199、aprE-L14-L355、aprE-L14-L199-L355(含有SEQ ID NO.7所示序列)，将叠加突变载体分别转化入地衣芽胞杆菌BL10中，得到碱性蛋白酶突变菌株BL10/aprE-L14-L199、BL10/aprE-L14-L355、BL10/aprE-L14-L199-L355。将该菌株于对照菌株BL10/aprE和BL10/aprE-L14按照实施例4中方法进行碱性蛋白酶发酵和酶活检测(具体数据见表2，图4)。

表2

其中突变菌株BL10/aprE-L14-L199、BL10/aprE-L14-L355和BL10/aprE-L14-L199-L355发酵48h后酶活分别达到28005.94U/mL、28639.60U/mL、29114.85U/mL，相比原始的碱性蛋白酶生产株的酶活分别提高了14.86％、17.46％、19.41％。其中突变体aprE-L14-L199的酶活力相较aprE-L14有所降低，此结果表明，并非有利突变的叠加均能呈现出更好的突变效果。在最佳叠加突变体的基础上继续叠加其他次有利突变位点P240、P150(酶活提高未达显著水平，即p≥0.05)的效果并不理想(具体数据见表3)。本发明由此获得了摇瓶水平达到29114.85U/mL的碱性蛋白酶高产菌株BL10/aprE-L14-L199-L355。

表3

序列表

<110> 湖北大学

<120> 适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因序列及应用

<160> 43

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagaaac cgttggggaa aattgtcgca agcaccgcac tactcatttc tgttgctttt 60

agttcatcga tcgcatcggc tgctgaagaa gcaaaagaaa aatatttaat tggctttaat 120

gagcaggaag ctgtcagtga gtttgtagaa caagtagagg caaatgacga ggtcgccatt 180

ctctctgagg aagaggaagt cgaaattgaa ttgcttcatg aatttgaaac gattcctgtt 240

ttatccgttg agttaagccc agaagatgtg gacgcgcttg aactcgatcc agcgatttct 300

tatattgaag aggatgcaga agtaacgaca atggcgcaat cagtgccatg gggaattagc 360

cgtgtgcaag ccccagctgc ccataaccgt ggattgacag gttctggtgt aaaagttgct 420

gtcctcgata caggtatttc cactcatcca gacttaaata ttcgtggtgg cgctagcttt 480

gtaccagggg aaccatccac tcaagatggg aatgggcatg gcacacatgt ggccgggacg 540

attgctgctt taaacaattc gattggcgtt cttggcgtag cgccgagcgc ggaactatac 600

gctgttaaag tattaggggc gagcggttca ggttcggtca gctcgattgc ccaaggattg 660

gaatgggcag ggaacaatgg catgcacgtt gctaatttga gtttaggaag cccttcgcca 720

agtgccacac ttgagcaagc tgttaatagc gcgacttcta gaggcgttct tgttgtagcg 780

gcatctggga attcaggtgc aggctcaatc agctatccgg cccgttatgc gaacgcaatg 840

gcagtcggag ctactgacca aaacaacaac cgcgccagct tttcacagta tggcgcaggg 900

cttgacattg tcgcaccagg tgtaaacgtg cagagcacat acccaggttc aacgtatgcc 960

agcttaaacg gtacatcgat ggctactcct catgttgcag gtgcagcagc ccttgttaaa 1020

caaaagaacc catcttggtc caatgtacaa atccgcaatc atctaaagaa tacggcaacg 1080

agcttaggaa gcacgaactt gtatggaagc ggacttgtca atgcagaagc ggcaacacgc 1140

taa 1143

<210> 2

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys

20 25 30

Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe

35 40 45

Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu

50 55 60

Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val

65 70 75 80

Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp

85 90 95

Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala

100 105 110

Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His

115 120 125

Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr

130 135 140

Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe

145 150 155 160

Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His

165 170 175

Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly

180 185 190

Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly

210 215 220

Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro

225 230 235 240

Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val

245 250 255

Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr

260 265 270

Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn

275 280 285

Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val

290 295 300

Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala

305 310 315 320

Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala

325 330 335

Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg

340 345 350

Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr

355 360 365

Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

370 375 380

<210> 3

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120

tttgcgtttt taccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

<210> 4

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaagaaac cgttggggaa aattgtcgca agcaccgcac tgctcatttc tgttgctttt 60