一种新型乳腺癌骨转移模型造模方式

摘要

本发明公开了一种新型乳腺癌骨转移模型造模方式，第一步以体位倾斜为操作基础；第二步基于体视解剖显微镜下的髂动、静脉暴露；第三步基于体视解剖显微镜下的动静脉分离；第四步为髂动脉注射前准备；第五步为使用胰岛素针头注射肿瘤细胞；第六步为缝合伤口；第七步为术后温度管理。相比较JoVE公开的内髂动脉注射显微骨转移的效率和选择性建模，60％的即时成功率和20％的3天存活率，本发明的乳腺癌骨转移模型造模方法单次给个体BALB/c‑nu裸鼠完成髂动脉注射肿瘤细胞的时间为15‑20min，乳腺癌骨转移模型造模的即时成功率达到100％，3天存活率达到80％，提高注射肿瘤细胞的成功率，减少BALB/c‑nu裸鼠的出血，增加造模的存活率。

说明书

技术领域

本发明涉及骨肿瘤痛模型技术领域，具体为一种新型乳腺癌骨转移模型造模方式。

背景技术

乳腺癌转移是最终致死的主要原因之一，几乎能转移到人体的任何部位，常见的几个转移位点是淋巴结、骨、肝、肺和脑。其中，骨是乳腺癌最常见的转移部位，骨转移与预后不良有关，骨转移患者由于剧烈疼痛、行动不便、高钙血症、骨质溶解和骨折，以及脊髓压迫和骨髓发育不良而导致癌症晚期生活质量极差。

建立小鼠的乳腺癌模型是研究乳腺癌的常见方法，对于研究乳腺癌的病因、发生机制、寻找药物靶点、指导临床治疗具有深远意义。由于骨组织的特殊性，目前小鼠骨转移模型的建立主要有三种方式：尾静脉注射（肿瘤细胞）、左心房注射、髂动脉注射。但是尾静脉注射肿瘤细胞这种方法更易形成肺、肝转移灶，成功建立小鼠乳腺癌骨转移模型的几率不高；左心房注射对于小鼠造成的创伤太大，造模存活率较低，所以一般都采用髂动脉注射肿瘤细胞来建立小鼠乳腺癌骨转移模型。对此，JoVE网站公开了内髂动脉注射显微骨转移的效率和选择性建模，揭示髂动脉作为被注射癌细胞的目标，需要髂静脉和动脉从周围组织中分离，并通过利用GFP标记乳腺癌细胞同时进行D-荧光素标记，实现髂内后动脉肿瘤细胞定位的观测，但JoVE髂动脉参考文件当中需要使用直角钳插入血管下方进行分离，而静脉和动脉广泛相互接触，与静脉血管壁薄，操作不当容易断裂，因而需要设计一种全新更加安全的造模方式，满足更省时间和精力的注射需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型乳腺癌骨转移模型造模方式，在分离出裸鼠模型髂动脉的过程中，通过利用倾斜体位、远心端悬吊动静脉、温度管理等方法增加髂动脉的血流量以达到增加髂动脉直径的目的，便于进一步注射肿瘤细胞，提高注射的成功率，减少BALB/c-nu裸鼠的出血，增加造模的存活率，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种新型乳腺癌骨转移模型造模方式，其特征在于：

第一步以体位倾斜为操作基础；

第二步基于体视解剖显微镜下的髂动、静脉暴露；

第三步基于体视解剖显微镜下的动静脉分离；

第四步为髂动脉注射前准备；

第五步为使用胰岛素针头注射肿瘤细胞；

第六步为缝合伤口；

第七步为术后温度管理；

上述乳腺癌骨转移模型造模的即时成功率达到100％，3天存活率达到80％。

优选的，乳腺癌骨转移模型造模方式，具体造模方法如下：

S1、体位倾斜，将麻醉后的BALB/c-nu裸鼠四肢固定于调节装置面板上，对调节装置进行角度调节；

S2、暴露髂动、静脉，位于BALB/c-nu裸鼠右下腹的第4和第5个乳头区域使用碘伏消毒，使用无菌剪刀在消毒区域的皮肤上剪开切口，切口长度处于1.0—1.2厘米，使用无菌手术布遮挡除切口以外BALB/c-nu裸鼠的部位；使用拉钩固定切口两侧，另取一把无菌剪刀剪切皮下筋膜，此时可以看见髂动、静脉、神经三者混合一起；在体视解剖显微镜下使用竖直精密镊子突破血管和神经之间的结缔组织，髂动、静脉与结缔组织实现分离；

S3、分离动静脉，使用弯曲精密镊子将4-0非吸收性外科缝线穿过髂动、静脉底部，在近心端处提起4-0非吸收性外科缝线，使得髂动、静脉间的空隙张力增大，使用竖直精密镊子平行于血管的方向轻柔地戳破空隙处的结缔组织，从而实现髂动、静脉的完全分离；髂动、静脉完全分离后，将4-0非吸收性外科缝线放下，非抽出操作，以便后续继续使用；

S4、髂动脉注射前准备，使用经过水浴加热的棉签按压髂动脉，使髂动脉处温度增高，将血管底部的4-0非吸收性外科缝线移至远心端，悬吊4-0非吸收性外科缝线，此时髂动脉明显增粗；

S5 、注射肿瘤细胞，采用针头直径0.25mm的U40（32G）无菌胰岛素注射器，吸取0.2ml的细胞悬液，将针头方向与血管方向平行摆放，慢慢推入血管，在显微镜下将针头扎入血管后，注射时期间观察注射器，注射完立即将无菌棉签头按在针头上方，拔针后立刻将棉签按在血管上从而达到压迫止血的目的，减少流血量；

抽出悬吊的4-0非吸收性外科缝线；

S6 、缝合伤口，BALB/c-nu裸鼠完全止血后，利用4-0可吸收性外科缝线的针头，皮下筋膜一层缝合，皮肤一层缝合；

S7、术后温度管理，由于BALB/c-nu裸鼠处于麻醉状态，体温调节功能弱，在调节装置面板上设置热毯以防温度太低而造成BALB/c-nu裸鼠死亡，热毯直至BALB/c-nu裸鼠从麻醉中完全苏醒方可关闭热毯电源；

S8、将完全复苏的BALB/c-nu裸鼠放进笼盒中饲养。

优选的，上述乳腺癌骨转移模型造模方法单次给个体BALB/c-nu裸鼠完成髂动脉注射肿瘤细胞的时间为15-20min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

相比较JoVE公开的内髂动脉注射显微骨转移的效率和选择性建模，60％的即时成功率和20％的3天存活率，本发明的乳腺癌骨转移模型造模方法单次给个体BALB/c-nu裸鼠完成髂动脉注射肿瘤细胞的时间为15-20min，乳腺癌骨转移模型造模的即时成功率达到100％，3天存活率达到80％。

本发明分离裸鼠模型髂动脉的过程中，通过利用倾斜体位、远心端悬吊动静脉、温度管理等方法增加髂动脉的血流量以达到增加髂动脉直径的目的，便于进一步注射肿瘤细胞，提高注射肿瘤细胞的成功率，减少BALB/c-nu裸鼠的出血，增加造模的存活率。

附图说明

图1为本发明基于体视解剖显微镜的乳腺癌骨转移造模与JOVE骨转移造模的动静脉分离比较；

图2为本发明乳腺癌骨转移造模与JOVE骨转移造模的活体成像观察心内注射动物骨转移情况对比图；

图3为本发明乳腺癌骨转移造模与JOVE骨转移造模的髂动脉注射肿瘤细胞消耗时间比较；

图4为本发明乳腺癌骨转移造模存活率与JOVE骨转移造模存活率比较。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案，一种新型乳腺癌骨转移模型造模方式，第一步以体位倾斜为操作基础；第二步基于体视解剖显微镜下的髂动、静脉暴露；第三步基于体视解剖显微镜下的动静脉分离；第四步为髂动脉注射前准备；第五步为使用胰岛素针头注射肿瘤细胞；第六步为缝合伤口；第七步为术后温度管理。

本发明的乳腺癌骨转移模型造模方式，涉及的具体造模方法如下：

S1、体位倾斜，将麻醉后的BALB/c-nu裸鼠四肢固定于调节装置面板上，对调节装置进行角度调节；

S2、暴露髂动、静脉，位于BALB/c-nu裸鼠右下腹的第4和第5个乳头区域使用碘伏消毒，使用无菌剪刀在消毒区域的皮肤上剪开切口，切口长度处于1.0—1.2厘米，使用无菌手术布遮挡除切口以外BALB/c-nu裸鼠的部位；使用拉钩固定切口两侧，另取一把无菌剪刀剪切皮下筋膜，此时可以看见髂动、静脉、神经三者混合在一起；

在体视解剖显微镜下使用竖直精密镊子突破血管和神经之间的结缔组织，或者使用棉签轻轻摩擦髂动、静脉，将髂动、静脉从周围的神经、结缔组织分离出来；

S3、分离动静脉，使用弯曲精密镊子将4-0非吸收性外科缝线穿过髂动、静脉底部，随后在近心端处提起4-0非吸收性外科缝线，使得髂动、静脉间的空隙张力增大，便于分离；在张力变大的髂动、静脉的空隙处，使用竖直精密镊子平行于血管的方向轻柔地戳破空隙处的结缔组织，从而实现髂动、静脉的完全分离；髂动、静脉完全分离后，将4-0非吸收性外科缝线放下，非抽出操作，以便后续继续使用；

S4、髂动脉注射前准备，使用经过水浴加热的棉签按压髂动脉，使髂动脉处温度增高，从而实现增大髂动脉血流量，将血管底部的4-0非吸收性外科缝线移至远心端，悬吊4-0非吸收性外科缝线，此时髂动脉明显增粗；

S5 、注射肿瘤细胞，采用针头直径0.25mm的U40（32G）无菌胰岛素注射器，吸取0.2ml的细胞悬液，将针头方向与血管方向平行摆放，慢慢推入血管；期间，操作者在显微镜下将针头扎入血管后，注射期间让助理人员时刻观察注射器，注射完即喊操作者停止注射，同时助理人员将无菌棉签头按在针头上方，操作者拔针后，助理人员立刻将棉签按在血管上从而达到压迫止血的目的，减少BALB/c-nu裸鼠流血量；抽出悬吊的4-0非吸收性外科缝线；

S6 、缝合伤口，BALB/c-nu裸鼠完全止血后，利用4-0可吸收性外科缝线的针头，皮下筋膜一层缝合，皮肤一层缝合；

S7、术后温度管理，由于BALB/c-nu裸鼠处于麻醉状态，体温调节功能弱，在调节装置面板上设置热毯以防温度太低而造成BALB/c-nu裸鼠死亡，热毯直至BALB/c-nu裸鼠从麻醉中完全苏醒方可关闭热毯电源；

S8、将完全复苏的BALB/c-nu裸鼠放进笼盒中饲养。

上述乳腺癌骨转移模型造模方法单次给个体BALB/c-nu裸鼠完成髂动脉注射肿瘤细胞的时间为15-20min；上述乳腺癌骨转移模型造模的即时成功率达到100％，3天存活率达到80％。

值得注意的是，本发明注射的肿瘤细胞带有荧光染料，在注射肿瘤细胞2-3天后，向裸鼠腹腔注射荧光显色剂，然后进行裸鼠活体荧光成像，髂骨部分肿瘤细胞的密度是可观的，说明本发明的乳腺癌骨转移模型造模方式有效的将肿瘤细胞注射进髂动脉。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。