使用双特异性抗体消除患者中的造血干细胞/造血祖细胞(HSC/HP)的方法

摘要

所述的发明提供了含有结合人酪氨酸激酶受体FLT3/FLK2受体蛋白和在T‑细胞上表达的CD3受体蛋白的双特异性抗体的组合物，和含有所述双特异性抗体的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于消除患者中的造血干细胞/造血祖细胞(HSC/HP)。

说明书

对相关申请的交叉参考

本申请要求于2019年7月9日提交的美国专利申请No. 16/506,764的优先权，所述申请是2018年10月4日提交的美国专利申请No. 16/091,139的部分继续申请，所述美国专利申请No. 16/091,139是2017年4月4日提交的国际申请No. PCT/US2017/025951的35U.S.C. § 371国家阶段提交，所述国际申请No. PCT/US2017/025951要求标题为“使用双特异性抗体消除患者中的造血干细胞/造血祖细胞(HSC/HP)的方法（Method of EliminatingHematopoietic Stem Cells/Hematopoietic Progenitors (HSC/HP) in a PatientUsing Bi-Specific Antibodies）”的2016年4月4日提交的美国临时申请No. 62/317,906的优先权权益。前述申请的每一项的完整内容整体引入本文作为参考。

序列表

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技术领域

所述的发明一般地涉及造血细胞移植、治疗用抗体制剂和它们的用途。

背景技术

造血干细胞是所有血液细胞的共同祖先。作为多能细胞，它们可以分化成多个细胞谱系，但是不可分化成源自三个胚层的所有谱系。造血干细胞分化产生淋巴样和髓样细胞谱系，即血细胞生成的两个主要分支(Kondo, M. “Lymphoid and myeloid lineagecommitment in multipotent hematopoietic progenitors,”Immunol. Rev. 2010年11月; 238(1): 37-46)。淋巴样谱系细胞包括T、B和天然杀伤(NK)细胞。髓样谱系包括巨核细胞和红细胞(MegE)以及粒细胞的不同子集(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞(GM)，它们属于髓样谱系(上文出处，引用Kondo M, 等人. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications forclinical application. Ann. Rev Immunol. 2003;21:759-806., Weissman IL.Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers andopportunities. Science (New York, NY. 2000年2月25日;287(5457):1442-6；也参见Iwaskaki, H. 和Akashi, K. “Myeloid lineage commitment from the hematopoieticstem cell,”Immunity 26(6) 2007年6月, 726-40)。

HSC具有自我更新潜力和分化成血液谱系的能力；即，当干细胞分裂时，平均而言50%的子细胞被定型为细胞谱系，而剩余的50%不分化。所述过程通过不对称细胞分裂维持相同的干细胞数目，从而使得每个分裂的干细胞产生一个新的干细胞和一个分化的细胞。相对照而言，在对称分裂中，干细胞产生100%的相同干细胞(Gordon, M.

淋巴样和髓样谱系在祖先水平是可分离的。共同淋巴样祖细胞(CLP)可以在生理条件下分化成所有类型的不具有显著髓样潜力的淋巴细胞(Kondo M, Scherer DC,Miyamoto T, King AG, Akashi K, Sugamura K, 等人. Cell-fate conversion oflymphoid-committed progenitors by instructive actions of cytokines. Nature.2000年9月21日; 407(6802):383-6)，尽管一些骨髓相关基因可能在CLP中检测到，这取决于实验条件(Delogu A, Schebesta A, Sun Q, Aschenbrenner K, Perlot T,Busslinger M. Gene repression by Pax5 in B cells is essential for blood cellhomeostasis and is reversed in plasma cells. Immunity. 2006年3月; 24(3):269-81)。

类似地，共同髓样祖细胞(CMP)可以产生所有类别的不具有或具有充分低水平的B-细胞潜力的髓样细胞(Akashi K, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL. Aclonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.Nature. 2000年3月9日; 404(6774):193-7)。另一种细胞类型，树突细胞(DC)，则没有被清楚地归类进淋巴样或髓样谱系中，这是因为DC可以源自CLP或CMP (Manz MG, Traver D,Miyamoto T, Weissman IL, Akashi K. Dendritic cell potentials of earlylymphoid and myeloid progenitors. Blood. 2001年6月1日; 97(11):3333-41, TraverD, Akashi K, Manz M, Merad M, Miyamoto T, Engleman EG, 等人. Development ofCD8alpha-positive dendritic cells from a common myeloid progenitor. Science(New York, NY. 2000年12月15日; 290(5499):2152-4)。CMP可以增殖和分化成巨核细胞-红细胞(MegE)祖先和粒细胞-单核细胞(GM)祖先，它们进一步产生巨核细胞、红细胞、粒细胞、单核细胞和其它细胞(Iwasaki H, Akashi K. Myeloid lineage commitment fromthe hematopoietic stem cell. Immunity. 2007;26:726-740)。

转录因子的表达水平的差异可能决定分化细胞的谱系从属关系（affiliation）。转录因子PU.1和GATA-1已经分别牵涉入髓样和红细胞/巨核细胞谱系分化(Gordon, M.

HSC是未分化的并类似于小淋巴细胞。大部分的HSC是休眠的，处于细胞周期的G0期，这保护它们免于细胞周期依赖性药物的作用。干细胞的休眠状态由转化生长因子-β(TGF-β)维持。TGF-β的活性由p53介导，所述p53是调节细胞增殖并靶向细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的肿瘤抑制基因(Gordon, M.

大部分正常的HSC存在于CD34+/CD38-/CD90+ 骨髓细胞级分中，也在CD34-/Lin-细胞中观察到一些HSC。CD34+/CD38+ 细胞级分含有一些具有短期再生（repopulating）活性的HSC。其它公认的标志物包括与终末分化标志物诸如CD4和CD8的缺乏偶联的酪氨酸激酶受体c-kit (CD117)(Rossi等人, Methods in Molecular Biology (2011) 750(2):47-59)。

可以将造血干细胞库细分成三个主要组：(1)短期HSC，其能够产生分化细胞的克隆仅4-6周；(2)中期HSC，其能够在变得消失之前维持分化细胞后代6-8个月；和(3)长期HSC，其能够无限地维持血细胞生成(Testa U. Annals of Hematology (2011) 90(3):245-271)。

血细胞生成

血细胞生成是一个高度协调的过程，其中HSC分化成由专门调节性微环境支持的成熟血细胞，所述专门调节性微环境由控制干细胞和祖细胞的命运说明（specification）的组分组成，以及通过供给必要的因子而维持它们的发育(“生态位”)。如本文中所使用的术语“骨髓(BM)生态位”指组织良好的构造，其由在不同血细胞谱系的存活、生长和分化中起基本作用的要素(例如，成骨细胞、破骨细胞、骨髓内皮细胞、基质细胞、脂肪细胞和细胞外基质蛋白(ECM))组成。骨髓生态位是重要的出生后微环境，HSC在其中增殖、成熟并产生髓样和淋巴样祖细胞。

骨髓(BM)存在于所有动物骨的髓腔中。它由多种前体和成熟的细胞类型组成，包括造血细胞(成熟的血细胞的前体)和基质细胞(广范围的结缔组织细胞的前体)，它们二者看来似乎都能够分化成其它细胞类型。骨髓的单核级分含有基质细胞、造血前体和内皮前体。

不同于次级淋巴样器官诸如具有独特肉眼可见结构（包括红髓和白髓）的脾，除了含有成骨细胞的骨内膜以外，BM不具有明显的结构特征。骨内膜区域与钙化的硬骨发生接触，并提供对于HSC活性的维持而言必要的特殊微环境(Kondo M, Immunology Reviews(2010) 238(1): 37-46; Sérgio Paulo Bydlowski和Felipe de Lara Janz (2012).Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development, Advances inHematopoietic Stem Cell Research, Dr. Rosana Pelayo (编), ISBN: 978-953-307-930-1)。

在生态位内，据信HSC接受源自几个来源的支持和生长信号，所述来源包括：成纤维细胞、内皮和网状细胞、脂肪细胞、成骨细胞和间充质干细胞(MSC)。生态位的主要功能是集成营养物、氧、旁分泌和自分泌信号的局部变化，和响应于来自体循环的信号而改变HSC休眠、运输和/或扩充(Broner, F.和Carson, M C. Topics in bone biology. Springer.2009; 4: 第2-4页. New York, USA.)。

尽管真MSC的特性仍然被误解，但是最近报道了表达CXC趋化因子配体12(CXCL12)的CD146 MSC是自我更新的祖先，其存在于窦状表面上并为窦状壁结构的组构做出贡献，产生血管生成素（Angiopoietin）-1 (Ang-1)，且能够产生形成骨内膜生态位的成骨细胞(Konopleva, MY, 和Jordan, CT, Biology and Therapeutic Targeting (2011)9(5): 591-599)。这些CXCL12网状细胞可以充当在成骨细胞生态位和血管生态位之间穿梭HSC的传递途径，在此处提供基本的但是不同的维持信号。

相继于变化的局部产生和通过结合细胞因子的糖胺聚糖的作用，由骨髓MSC产生的细胞因子和趋化因子集中在特定生态位中。在这些中，CXCL12/基质细胞衍生因子-1α正调节HSC归巢，而转化生长因子FMS-样酪氨酸激酶3 (Flt3)配体和Ang-1充当休眠因子(参见，例如，Sérgio Paulo Bydlowski和Felipe de Lara Janz (2012). HematopoieticStem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development, Advances in HematopoieticStem Cell Research, Dr. Rosana Pelayo (编), ISBN: 978-953-307-930-1)。在形成集落的祖细胞的个体发育以及存活和增殖中，CXCL12-CXCR4信号传递参与HSC归巢进BM中。CXCR4-选择性的拮抗剂诱导HSC活动进外周血中，这进一步指示CXCL12在保留造血器官内的HSC中的作用。

BM移入涉及通过BMSC产生的复杂细胞外基质实现的随后细胞间相互作用。因而，血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1)或纤连蛋白对于与BM衍生的MSC的黏附而言是关键的。以此方式，造血干细胞增殖动力学的控制对于正确造血细胞产生的调节而言是非常重要的。这些控制机制可以分类为干细胞内在的或外在的，或二者的组合(参见，例如，Sérgio PauloBydlowski和Felipe de Lara Janz (2012). Hematopoietic Stem Cell in AcuteMyeloid Leukemia Development, Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,Dr. Rosana Pelayo (编), ISBN: 978-953-307-930-1)。

HSC自我更新和分化可以由外部因素控制(外在控制)，诸如造血微环境中的细胞-细胞相互作用或细胞因子，诸如SCF (干细胞因子)和它的受体c-kit、Flt-3配体、TGF-β、TNF-α等。细胞因子通过多个信号转导途径的活化而调节多种造血细胞功能。与细胞增殖和分化有关的主要途径是Janus激酶(Jak)/信号转导及转录激活蛋白(STAT)、促分裂原活化蛋白(MAP)激酶和磷脂酰肌醇(PI) 3-激酶途径(Sérgio Paulo Bydlowski和Felipe deLara Janz (2012). Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid LeukemiaDevelopment, Advances in Hematopoietic Stem Cell Research, Dr. Rosana Pelayo(编), ISBN: 978-953-307-930-1)。

另外，已经表明其它转录因子（例如，干细胞性白血病(SCL)造血转录因子; GATA-2；和在细胞周期控制中涉及的基因产物，诸如细胞周期蛋白依赖性的激酶抑制剂(CKI)pl6、p21和p27）的表达对于从最早阶段的造血细胞发育而言是必需的(内在控制) (SérgioPaulo Bydlowski和Felipe de Lara Janz (2012). Hematopoietic Stem Cell in AcuteMyeloid Leukemia Development, Advances in Hematopoietic Stem Cell Research,Dr. Rosana Pelayo (编), ISBN: 978-953-307-930-1)。

Notch-l-Jagged途径可以用于将细胞外信号与细胞内信号传导和细胞周期控制整合。Notch-1是在造血干细胞膜上的表面受体，其结合它的配体，在基质细胞上的Jagged。这导致Notch-1的细胞质部分的切割，其然后可以充当转录因子(Gordon, M.

使用骨髓(BM)/造血干细胞(HSC)移植治疗的病症

使用骨髓(BM)/造血干细胞(HSC)移植治疗的病症包括，但不限于，急性髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、周围T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、神经母细胞瘤、非恶性的遗传性和获得性骨髓病症(例如镰状细胞贫血、β-重型地中海贫血、顽固性Diamond-Blackfan贫血、骨髓异常增生综合征、特发性重度再生障碍性贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、单纯红细胞再生障碍、范康尼贫血、巨核细胞缺乏（amegakaryocytosis）或先天性血小板减少症)、多发性骨髓瘤和重度联合免疫缺陷(SCID)。

大多数造血恶性肿瘤包含在功能上异质的细胞，其中仅一个亚群（被称作癌症干细胞）负责肿瘤维持。因为它们具有暗示正常组织干细胞的特性，包括自我更新、延长的存活和产生具有更分化的特征的细胞的能力，所以癌症干细胞因此得名(Jones RJ和Armstrong SA, Biol Blood Marrow Transplant. 2008年1月; 14 (增刊1): 12-16)。

取决于与致癌袭击有关的分化程度，在造血干细胞中的转化事件可以产生几种不同的恶性肿瘤，包括、但不限于，慢性髓细胞样白血病、骨髓异常增生综合征、急性髓性白血病和可能的甚至急性淋巴细胞性白血病(Jones RJ和Armstrong SA, Biol Blood MarrowTransplant. 2008年1月; 14 (增刊1): 12-16)。

癌症干细胞概念是基于以下想法：特定组织的肿瘤经常看来似乎“尝试”重演在起源组织中发现的细胞异质性，且因而在所述肿瘤中存在干细胞样的细胞，从而产生不同的细胞类型。所述假设的根本检验是，肿瘤细胞是否可以分离成具有再生所述肿瘤的能力的细胞，和不具有所述能力的细胞。这种细胞层次最近已经在急性髓细胞性白血病中得到证实，其中一些AML拥有具有独特免疫表型的细胞，其能够在免疫缺陷的小鼠中发起白血病，而大多数细胞不能发起白血病发展。此外，发起白血病的细胞也产生已经丧失肿瘤发起活性且因而重演在原始肿瘤中发现的细胞异质性的细胞(Lapidot T等人, Nature. 1994;367: 645-648; Bonnet D等人, Nat Med. 1997; 3: 730-737)。

急性髓性白血病(AML)是一种克隆病症，其特征在于髓样谱系中的分化停滞偶联未成熟的祖先在骨髓中的积累，从而产生造血衰竭(Pollyea DA等人, British Journalof Haematology (2011) 152(5): 523-542)。在白血病胚细胞（leukemic blasts）的出现中存在广泛的患者间异质性。白血病发起细胞在急性髓性白血病(AML)中的发现开始于下述发现：大多数AML胚细胞不增殖，且仅少数能够形成新集落(Testa U, Annals ofHematology (2011) 90(3): 245-271)。所有AML病例的共同特征是，导致不止20%的胚细胞在骨髓中积累的停滞的异常分化(Gilliland, DG和Tallman MS, Cancer Cell (2002) 1(5): 417-420)。

不止80%的髓样白血病与至少一次染色体重排有关(Pandolfi PP, Oncogene(2001) 20(40): 5726-5735)，并且已经克隆了超过100个不同的染色体易位(Gilliland,DG和Tallman MS, Cancer Cell (2002) 1(5): 417-420)。这些易位经常包含编码转录因子的基因，所述转录因子已经显示在造血谱系发育中起重要作用。因而，转录体系的改变看来似乎是导致停滞的分化的共同机制(Pandolfi PP, Oncogene (2001) 20(40): 5726-5735; Tenen DG, Nature Reviews of Cancer (2003) 3(2): 89-101)。

临床研究和实验动物模型提示，急性白血病的临床表现形式需要至少两个遗传改变。根据Gilliland和Tallman提出的模型(Cancer Cell (2002) 1(5): 417-420)，I类活化突变和诱导分化终止的II类突变之间的协作产生AML。I类突变，诸如受体酪氨酸激酶基因FLT3和KIT、RAS家族成员中的突变以及神经纤维瘤蛋白1的功能丧失，给造血祖细胞赋予增殖和/或存活优点，一般作为信号转导途径的异常活化的后果。II类突变通过干扰转录因子或辅激活物导致分化的停止(Frankfurt O等人, Current Opinion in Oncology (2007)19(6): 635-649)。

尽管白血病干细胞(LSC)看来似乎共有许多以前为HSC鉴别出的细胞表面标志物诸如CD34、CD38、HLA-DR和CD71，但几个研究组已经报道了在两个群体中差别地表达的表面标志物。

例如，已经将CD90或Thy-1描述为LSC区室的潜在特异性的。随着大多数原始干细胞向祖先阶段进展，Thy-1在正常血细胞生成中下调(Hope KJ等人, Archives of MedicalResearch (2003) 34(6): 507-514)。

CXCL12 (基质细胞衍生因子-1α)和它在白血病祖细胞上的受体CXCR4之间的相互作用有助于它们向骨髓微环境的归巢。CXCR4水平在来自具有AML的患者的白血病细胞中显著升高，且CXCR4表达与差的结果有关(Konopleva MY和Jordan CT, Biology andTherapeutic Targeting (2011) 29(5): 591-599)。

在原代人AML干细胞中的核因子κβ(NF-kβ)途径的组成型活化提供了NF-kβ在LSC以及一般AML细胞类型的总存活中起显著作用的证据(Konopleva MY和Jordan CT,Biology and Therapeutic Targeting (2011) 29(5): 591-599)。

FLT3（III类酪氨酸激酶受体家族的一个成员）在正常的造血祖细胞中以及在白血病胚细胞中表达，并且它在细胞增殖、分化和存活中起重要作用。FLT3配体对FLT3受体的活化导致受体二聚化和磷酸化以及下游信号传导途径（包括Janus激酶(JAK) 2信号转导蛋白(JAK2)、信号转导及转录激活蛋白(STAT) 5和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径）的活化。据信在大约40%的具有AML的患者中发现的在FLT3基因中的突变促进它的自磷酸化和组成型活化，从而导致独立于配体的增殖(Frankfurt O等人, Current Opinion in Oncology(2007) 19(6): 635-649)。

淋巴样恶性肿瘤

在大多数组织中的自我更新能力随着细胞进展穿过它们的正常分化阶段而丧失；例如，超过造血干细胞水平的髓样谱系血细胞不再具有自我更新能力。自我更新的分化相关丧失的显著例外是淋巴样系统，其中在记忆淋巴细胞阶段之前保持自我更新能力，以维持终生免疫记忆(Fearon DT等人, Science. 2001; 293: 248-250; Luckey CJ等人,Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103: 3304-3309)。体细胞超突变充当B细胞恶性肿瘤起源的分化阶段的标志物。一般而言，体细胞超突变的存在将肿瘤鉴别为已经起源于生发中心或生发中心后B细胞，而突变的缺乏鉴别生发中心前B细胞。不同于髓样恶性肿瘤，而是与谱系的保持的自我更新能力一致，免疫球蛋白(Ig)突变模式提示，B细胞恶性肿瘤可以起源于贯穿整个B细胞分化阶段的细胞(Lapidot T等人, Nature. 1994; 367: 645-648;Bonnet D和Dick JE, Nat Med. 1997; 3: 730-737; Jones RJ等人, J Natl CancerInst. 2004; 96: 583-585)。

多发性骨髓瘤(MM)通常被视作恶性浆细胞的疾病，具有由浆细胞块（plasma cellbulk）引起的疾病的许多临床后果。但是，正常浆细胞是终末分化的且缺乏自我更新能力，并且超过30年来已经清楚，仅少数来自小鼠和人MM的细胞是产克隆的。这些罕见的产克隆的细胞已经被称作“肿瘤干细胞”(Park CH等人, J Natl Cancer Inst. 1971; 46: 411-422; Hamburger AW和Salmon SE, Science. 1977; 197: 461-463)。MM浆细胞起源于类似于记忆B细胞的自我更新的癌症干细胞的小群体。不仅这些克隆型B细胞在大多数患者中循环，而且它们也耐受许多标准的抗-MM剂，且因而看来似乎负责大多数疾病复发(Matsui WH等人, Blood. 2004; 103: 2332-2336; Kukreja A等人, J Exp Med. 2006; 203: 1859-1865; Jones RJ和Armstrong SA, Biol Blood Marrow Transplant. 2008年1月; 14 (增刊1): 12-16)。

Reed-Sternberg (RS)细胞（何杰金淋巴瘤(HL)的标志）是除浆细胞以外的偶尔表达CD138的唯一血液细胞(Carbone A等人, Blood. 1998; 92: 2220-2228)。已经表明，HL细胞系包括缺乏存在于剩余细胞上的RS标志物CD15和CD30的细胞的小群体，但是表达与记忆B细胞表型一致的标志物(Newcom SR等人, Int J Cell Cloning. 1988; 6: 417-431;Jones RJ等人, Blood. 2006; 108: 470)。表型记忆B细胞的所述小亚群具有在HL细胞系内的所有产克隆的能力。大多数HL患者（包括具有早期疾病的那些）携带循环记忆B细胞，其具有与患者的RS细胞相同的克隆Ig基因重排(Jones RJ等人, Blood. 2006; 108: 470;Jones RJ和Armstrong SA, Biol Blood Marrow Transplant. 2008年1月; 14 (增刊1):12-16)。这些数据提示，这些克隆型记忆B细胞可能代表HL干细胞。

造血干细胞(HSC)被用在骨髓移植中用于治疗血液学恶性肿瘤以及非恶性病症(Warner等人, Oncogene (2004) 23(43): 7164-7177)。在研究人员发现哪些细胞组分在骨髓切除的患者中负责供体造血和免疫系统的移入之前，已经将骨髓(BM)作为未分级分离的细胞库移植了许多年(参见，例如，Sérgio Paulo Bydlowski和Felipe de Lara Janz(2012). Hematopoietic Stem Cell in Acute Myeloid Leukemia Development,Advances in Hematopoietic Stem Cell Research, Dr. Rosana Pelayo (编), ISBN:978-953-307-930-1)。

用于骨髓/造血干细胞(BM/HSC)移植的患者的准备或调理是所述程序的关键的要素。它起两个主要作用：(1)它提供患者的适当免疫抑制并在骨髓中为移植的HSC清除足够生态位空间，这允许将移植的细胞移入接受者中；和(2)它经常帮助根除恶性肿瘤的来源。

传统上已经如下实现患者的调理：在有或没有辐射的情况下施用最大耐受剂量的化疗剂的混合物。经常将混合物的组分选择成具有不重叠的毒性。目前在使用中的所有准备方案都是有毒的，且具有可以危及生命的严重副作用。在这些副作用中有粘膜炎、恶心和呕吐、脱发、腹泻、疹、周围神经病、不育、肺毒性和肝毒性。这些副作用中的许多对于老年和患病的患者而言是尤其危险的，且经常在决定患者是否将接受移植时变成决定性组分。

因而，需要在没有这些毒性的情况下准备或调理适合骨髓/造血干细胞(BM/HSC)移植的患者。所述的发明提供了使用双特异性抗体消除患者中的造血干细胞/造血祖细胞(HSC/HP)的组合物和方法，所述双特异性抗体结合人酪氨酸激酶受体FLT3/FLK2受体蛋白和在T-细胞上表达的CD3受体蛋白。

发明内容

根据一个方面，所述的发明提供了一种为造血细胞移植准备或调理有此需要的患者的方法，所述方法包括：提供结合人FLT3和人CD3两者的重组单链双特异性抗体，和给所述患者施用治疗量的包含所述双特异性抗体的药物组合物；其中所述治疗量有效地：使外周血中表达CD45、CD3、FLT3、CD19、CD33中的一种或多种的细胞群体的水平减小至少90%，和减小用于准备或调理所述患者的规程的毒性。

根据一个实施方案，结合FLT3的双特异性抗体的抗原结合部分的重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 1，且结合FLT3的双特异性抗体的抗原结合部分的轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 2。根据另一个实施方案，所述双特异性抗体包含与人CD3的亚基反应的单克隆抗体。根据另一个实施方案，所述双特异性抗体或其抗原结合部分包含选自免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE、IgA和IgD同种型的同种型。

根据一个实施方案，所述有效量包含0.01 mg/kg至10 mg/kg，更好是0.05 mg/kg至2 mg/kg，更好是0.1 mg/kg至0.5 mg/kg，更好是0.1 mg/kg至0.3 mg/kg，更好是0.1 mg/kg。

根据一个实施方案，有此需要的患者遭受急性髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性髓细胞样白血病(CLL)、CML、周围T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、神经母细胞瘤、非恶性的遗传性和获得性骨髓病症、多发性骨髓瘤或SCID。根据另一个实施方案，所述非恶性的遗传性和获得性骨髓病症选自镰状细胞贫血、β-重型地中海贫血、顽固性Diamond-Blackfan贫血、骨髓异常增生综合征、特发性重度再生障碍性贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、单纯红细胞再生障碍、范康尼贫血、巨核细胞缺乏和先天性血小板减少症。

根据一个实施方案，所述组合物进一步包含抗肿瘤剂。

根据一个实施方案，所述双特异性抗体是人源化抗体。

根据另一个方面，所述的发明提供了一种用于制备结合人FLT3和人CD3两者的重组单链双特异性抗体的方法，所述方法包括：将Flt3单克隆抗体的Fab抗原结合片段的C-末端连接至IgG1的CH2结构域，和将与人CD3的亚基(UCHT1)反应的单克隆抗体的单链可变区片段(ScFv)连接至所述IgG1的CH2结构域。

根据另一个方面，所述的发明提供了一种结合人FLT3和人CD3两者的重组单链双特异性抗体，其包含：与IgG1的CH2结构域连接的Flt3单克隆抗体的Fab抗原结合片段的C-末端，和与所述IgG1的CH2结构域连接的、与人CD3的亚基(UCHT1)反应的单克隆抗体的单链可变区片段(ScFv)。

根据一个实施方案，Fab抗原结合片段的重链结合结构域的氨基酸序列是SEQ IDNO: 1 (H3113)，且Fab抗原结合片段的轻链结合结构域的氨基酸序列是SEQ ID NO: 2(L3133)。

根据另一个方面，所述的发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的轻链的氨基酸序列是SEQ IDNO: 5，且结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 7。

根据另一个方面，所述的发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的轻链的氨基酸序列是SEQ IDNO: 9，且结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 11。

根据另一个方面，所述的发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的轻链的氨基酸序列是SEQ IDNO: 13，且结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 15。

根据另一个方面，所述的发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的轻链的氨基酸序列是SEQ IDNO: 17，且结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 19。

根据另一个方面，所述的发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的轻链的氨基酸序列是SEQ IDNO: 21，且结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 23。

根据另一个方面，所述的发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其中结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的轻链的氨基酸序列是SEQ IDNO: 25，且结合人FLT3/FLK2受体蛋白的抗体或其片段的抗原结合部分的重链的氨基酸序列是SEQ ID NO: 27。

根据一些实施方案，所述抗体或其片段的半最大有效浓度(EC

附图说明

图1A、1B、1C. 图1A和1B: 氨基酸诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的天然荧光。图1C: 合成的抗体的纯度的测量。

图2A、2B、2C、2D. 施用双特异性抗体（其结合由HSC/HP表达的FLT3/FLK2和由T-细胞表达的CD3）减小人源化的免疫妥协的小鼠的外周血中的嵌合状态水平。图2A. 在应用CD3-FLT3双特异性抗体以前(对照；上行)和以后3周，人源化的NOG小鼠的外周血的流式细胞术分析的实例。从左至右：人hCD45+ 细胞(总CD45+ 细胞的百分比)、人hCD3+ 细胞(总hCD45+ 细胞的百分比; T-细胞)、人hCD19+ 细胞(总hCD45+ 细胞的百分比; B-细胞)、人hCD33+ 细胞(总hCD45+ 细胞的百分比；髓样细胞)的量的分析。图2B. 双特异性抗体施用对人源化小鼠的外周血中的嵌合状态水平的影响(n=27)。图2C. 双特异性抗体施用对外周血中T-细胞(总hCD45+ 细胞的%hCD3+ 细胞)、B-细胞(总hCD45+ 细胞的%hCD19+ 细胞)和髓样谱系(总hCD45+ 细胞的%hCD33+ 细胞)的水平的影响(n=27)。图2D. 双特异性抗体应用在具有减少的量的人hCD3+ 细胞的人源化的免疫妥协的小鼠(在C中用星号标记)中的减小的效应(n=3)。

图3A和3B. 来自克隆扩充的杂交瘤的培养物上清液的筛选。图3A. 从9个阳性杂交瘤克隆的上清液的流式细胞术分析得到的荧光强度直方图。上清液表现出对由REH (人B细胞前体白血病细胞，从具有第一次复发ALL的15岁女孩的外周血确立)细胞表达的FLT3/FLK2的免疫反应性。图3B. 显示了图3A中的直方图的中位数荧光强度(MFI)的表。所有9个克隆都与表达人FLT3/FLK2受体蛋白的REH细胞反应。

图4A和4B. 来自扩充的杂交瘤的经纯化的单克隆抗体的筛选. 图4A. 由来自9个阳性杂交瘤克隆的经纯化的单克隆抗体的流式细胞术分析所得到的荧光强度直方图。上清液表现出对由SP2/0细胞表达的人FLT3/FLK2受体蛋白的免疫反应性。单克隆抗体与不表达人FLT3/FL2受体蛋白的野生型SP2/0细胞不反应。图4B. 显示了图4A中的直方图的中位数荧光强度(MFI)的表。所有9个克隆都与表达人FLT3/FLK2受体蛋白的SP2/0细胞反应，且不与野生型SP2/0细胞反应。

图5A、5B、5C、5D和5E. 使用流式细胞术通过有效浓度(EC)曲线确定的抗-人FLT3/FLK2抗体的亲和力。图5A. 抗体克隆Ab2-81。图5B. 抗体克隆Ab1-23DA。图5C. 抗体克隆Ab3-16HA。图5D. 抗体克隆Ab0-30A。图5E. 抗体克隆Ab1-18New。

图6. 抗-FLT3/FLK2抗体内化的时程. 对于活的Reh细胞群体，用相对于时间绘图的第二Alexa Fluor 488检测单克隆小鼠抗-人CD135抗体的平均荧光强度(MFI)。与对照细胞平行地在37℃进行内化测定，所述对照细胞在冰上于4℃保持10、30、60和120分钟。于4℃和37℃一式三份地历时2小时，将每种抗体(克隆123D、A281A、330A和316HA)的MFI的变化百分比相对于时间绘图，将在10分钟的MFI设置为100%。

具体实施方式

术语汇编

术语“活化”或“淋巴细胞活化”指特异性抗原、非特异性促分裂原或同种异体细胞对淋巴细胞的刺激，从而导致RNA、蛋白和DNA的合成以及淋巴因子的产生；其继之以各种效应细胞和记忆细胞的增殖和分化。例如，成熟的B细胞可以通过遇到抗原而活化，所述抗原表达被它的细胞表面免疫球蛋白Ig）识别的表位。所述活化过程可以是直接的过程，其依赖于抗原对膜Ig分子的交联(交联依赖性的B细胞活化)，或是间接的过程，其在与辅助性T细胞的亲密相互作用的背景下更有效地发生(“关联辅助过程（cognate help process）”)。T-细胞活化依赖于TCR/CD3复合物与它的关联配体（结合在I类或II类MHC分子的沟中的肽）的相互作用。通过受体接合开动的分子事件是复杂的。最早的步骤看来似乎是酪氨酸激酶的活化，从而导致一组控制几个信号传导途径的底物的酪氨酸磷酸化。这些包括一组将TCR连接至ras途径的衔接蛋白，磷脂酶Cγ1，其酪氨酸磷酸化增加它的催化活性和接合肌醇磷脂代谢途径，从而导致细胞内游离钙浓度的升高和蛋白激酶C的活化，和一系列控制细胞的生长和分化的其它酶。除了受体接合以外，T细胞的完全应答性要求辅助细胞递送的共刺激活性，例如，在抗原呈递细胞(APC)上的CD80和/或CD86对T细胞上的CD28的接合。活化的B淋巴细胞的可溶性产物是免疫球蛋白(抗体)。活化的T淋巴细胞的可溶性产物是淋巴因子。

如本文所用的术语“施用”意指给予或应用。如本文所用的术语“施用”及其各种语法形式包括体内施用，以及先体外后体内直接施用至组织。

抗体：

抗体是这样的血清蛋白，其分子具有与在它们的靶上的小化学基团互补的它们的表面的小区域。每个抗体分子存在至少2个，且在一些类型的抗体分子中存在10个、8个，或在一些物种中存在多达12个的这些互补区域(被称作抗体结合部位或抗原结合部位)可以与在抗原上的它们的对应互补区域(抗原决定簇或表位)反应以将多价抗原的几个分子连接在一起以形成网格。

完整抗体分子的基础结构单元由4个多肽链组成：2个相同的轻(L)链(每个含有约220个氨基酸)和2个相同的重(H)链(每个通常含有约440个氨基酸)。所述2个重链和2个轻链通过非共价键和共价键(二硫键)的组合而保持在一起。所述分子由2个相同的半部组成，每个半部具有相同的由轻链的N-末端区域和重链的N-末端区域组成的抗原结合部位。轻链和重链两者通常协作以形成抗原结合表面。

人抗体表现出两类轻链κ和λ；单一免疫球蛋白分子通常是仅一种或另一种。在正常血清中，已经发现60%的分子具有κ决定簇和30%的λ。已经发现许多其它物种表现出两类轻链，但是它们的比例不同。例如，在小鼠和大鼠中，λ链占总数的几个百分比；在狗和猫中，κ链是非常低的；马看来似乎不具有任何κ链；兔可能具有5-40%λ，取决于品系和b-基因座同种异型；且鸡轻链与λ比与κ更同源。

在哺乳动物中，存在5个抗体类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，每一类都具有它自己的重链类别- α(对于IgA)、δ(对于IgD)、ε(对于IgE)、γ(对于IgG)和 μ(对于IgM)。另外，存在4个分别具有γ1、γ2、γ3和γ4重链的IgG免疫球蛋白亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在它的分泌形式中，IgM是由5个4-链单元组成的五聚体，从而给它提供总计10个抗原结合部位。每个五聚体含有J链的一个拷贝，其共价地插入在2个邻近的尾巴区域之间。

所有5个免疫球蛋白类别与其它血清蛋白的差别在于，它们表现出宽范围的电泳迁移率且不是同质的。所述异质性–单个IgG分子，例如，在净电荷上彼此不同–是免疫球蛋白的内在性质。

“抗原决定簇”或“表位”是在分子上的抗原部位。顺序抗原决定簇/表位基本上是直链的。在有序结构诸如螺旋聚合物或蛋白中，抗原决定簇/表位基本上是在所述结构的表面内或表面上的有限区域或小块，其包含来自可彼此接近的分子的不同部分的氨基酸侧链。这些是构象决定簇。

经常与钥匙在锁中的配合相比的互补性的原理涉及相对弱的结合力(疏水和氢键、范德瓦尔斯力和离子相互作用)，其仅在以下情况时能够有效地起作用：两个反应分子可以彼此非常近地接近，且实际上，如此接近以致于一个分子的伸出的组分原子或原子基团可以配合进另一个分子的互补凹陷或凹处。抗原-抗体相互作用表现出高度的特异性，这在许多水平表现出来。降低至分子水平，“特异性”意指抗体与抗原的结合部位具有互补性，其一点也不类似于无关抗原的抗原决定簇。每当2种不同抗原的抗原决定簇具有某种结构相似性时，就可能发生一种决定簇向对于另一种决定簇的一些抗体的结合部位中的某种程度的配合，并且所述现象产生交叉反应。交叉反应在理解抗原-抗体反应的互补性或特异性时具有重大重要性。免疫学特异性或互补性使得可能检测抗原中的少量杂质/污染。

可以如下产生“单克隆抗体”(mAb)：使来自免疫接种的供体的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合，以产生确立的小鼠杂交瘤克隆，其在选择性培养基中生长。“杂交瘤细胞”是无限增殖化的杂交细胞，其源自分泌抗体的B细胞与骨髓瘤细胞的体外融合。“体外免疫接种”（其指培养的抗原特异性B细胞的初次活化）是另一种非常确定的生产小鼠单克隆抗体的方式。

通过聚合酶链反应(PCR)扩增，也可以扩增来自外周血淋巴细胞的免疫球蛋白重(VH)和轻(Vκ和Vλ)链V基因的不同文库。通过使用PCR随机地组合重链和轻链V-基因，可以制备编码单个多肽链的基因，在所述多肽链中，重链和轻链可变结构域通过多肽间隔区相连(单链Fv或scFv)。然后可以克隆组合文库用于通过融合至在所述噬菌体的顶端的小外壳蛋白展示在丝状噬菌体的表面上。

指导的选择的技术基于用啮齿类动物免疫球蛋白V基因改组人免疫球蛋白V基因。所述方法需要：(i)用与感兴趣的抗原反应的小鼠单克隆抗体的重链可变区(VH)结构域改组人λ轻链谱；(ii)在所述抗原上选择半-人Fab；(iii)使用选择的λ轻链基因作为在第二次改组中的人重链文库的“入坞结构域（docking domains）”，以分离具有人轻链基因的克隆Fab片段；(v)通过用含有所述基因的哺乳动物细胞表达载体电穿孔，转染小鼠骨髓瘤细胞；和(vi)在小鼠骨髓瘤中表达可与所述抗原反应的Fab的V基因作为完整IgG1, λ抗体分子。

当与细胞表面结合的抗体与天然杀伤(NK)细胞上的Fc受体相互作用时，触发如本文中所使用的术语“依赖抗体的细胞毒性(ADCC)”。NK细胞表达受体FcγRIII (CD16)，其识别IgG1和IgG3亚类。杀伤机制类似于细胞毒性T细胞的杀伤机制，涉及含有穿孔蛋白和粒酶的细胞质颗粒的释放(参见下文)。

CD3 (TCR复合物)是由4个不同链组成的蛋白复合物。在哺乳动物中，所述复合物含有CD3γ链、CD3δ链和2个CD3ε链，它们与T细胞受体(TCR)和ζ-链结合以在T淋巴细胞中产生活化信号。TCR、ζ-链和CD3分子一起构成TCR复合物。CD3分子的细胞内尾含有被称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的保守基序，它是TCR的信号传导能力所必需的。在ITAM的磷酸化时，CD3链可以结合ZAP70 (ζ相关蛋白)，即在T细胞的信号级联放大中涉及的激酶。

术语“结合”及其各种语法形式意指化学物质之间的持久吸引。结合特异性包括与具体配偶体的结合和不与其他分子的结合。功能上重要的结合可能在从低到高的亲和力范围内发生，并且设计要素可能抑制不期望的交叉相互作用。翻译后修饰也可以改变相互作用的化学和结构。“混杂结合”可能涉及结构可塑性的程度，这可能导致残基的不同亚群对于与不同配偶体的结合是重要的。“相对结合特异性”是这样的特征，借此在生化系统中，分子与其靶或配偶体有差异地相互作用，从而依赖于个别靶或配偶体的身份有区别地对它们产生影响。

如本文所用的术语“接触”及其各种语法形式指接触或紧接或局部接近的状态或状况。使组合物与靶目标如但不限于器官、组织或细胞接触可以通过本领域技术人员已知的任何施用方式发生。

如本文所用的术语“半最大有效浓度”(EC

术语“造血细胞移植”(HCT)在本文中用于指血液和骨髓移植(BMT)，包括输注细胞(造血干细胞；也称为造血祖细胞)以重构患者的造血系统的程序。

术语“淋巴细胞”指在遍布整个身体的淋巴组织中形成的小白细胞，且在正常的成年人中占在循环血液中的白细胞的总数的约22-28%，其在防御身体免于疾病中起重要作用。各种淋巴细胞是专门化的，因为它们被定型为对结构上相关的抗原的有限集合做出应答。所述定型（其在免疫系统与给定抗原的第一次接触之前存在）通过对抗原上的决定簇(表位)特异性的受体在淋巴细胞的表面膜上的存在来表达。每种淋巴细胞具有一群受体，它们都具有相同的结合部位。淋巴细胞的一个集合或克隆与另一个克隆的差别在于它的受体的结合区域的结构，且因而差别在于它可以识别的表位。淋巴细胞彼此的差别不仅在于它们的受体的特异性，而且在于它们的功能。

识别出了两大类淋巴细胞：B-淋巴细胞(B-细胞)，它们是分泌抗体的细胞的前体；和T-淋巴细胞(T-细胞)。

B淋巴细胞

B-淋巴细胞衍生自骨髓的造血细胞。成熟的B-细胞可以用抗原活化，所述抗原表达被它的细胞表面识别的表位。所述活化过程可以是直接的，依赖于抗原对膜Ig分子的交联(交联依赖性的B-细胞活化)；或间接的，经由与辅助性T-细胞的相互作用，在被称作关联辅助的过程中。在许多生理学情形中，受体交联刺激和关联辅助协同作用以产生更强劲的B-细胞应答(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编, Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia (1999))。

交联依赖性的B-细胞活化要求所述抗原表达与细胞表面受体的结合位点互补的表位的多个拷贝，这是因为每个B-细胞表达具有相同可变区的Ig分子。这样的要求由具有重复表位的其它抗原（诸如微生物的荚膜多糖或病毒包膜蛋白）实现。交联依赖性的B-细胞活化是针对这些微生物确立的主要保护性免疫应答(Paul, W. E., “Chapter 1: Theimmune system: an introduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编,Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。

关联辅助允许B-细胞确立针对不可交联受体的抗原的应答，且同时，提供从灭活中拯救B细胞的共刺激信号（当它们被弱交联事件刺激时）。关联辅助依赖于B-细胞的膜免疫球蛋白(Ig)对抗原的结合、所述抗原的胞吞作用和它在细胞的胞内体/溶酶体区室中向肽的片段化。一些作为结果而产生的肽被加载进细胞表面蛋白（被称作II类主要组织相容性复合体(MHC)分子）的专门集合中的沟中。作为结果而产生的II类/肽复合物在细胞表面上表达，并充当一组被命名为CD4+ T-细胞的T-细胞的抗原特异性受体的配体。CD4+ T-细胞在它们的表面上带有对B-细胞的II类/肽复合物特异性的受体。B-细胞活化不仅依赖于T细胞通过它的T细胞受体(TCR)的结合，而且所述相互作用也允许在T-细胞上的活化配体(CD40配体)结合它在B-细胞上的受体(CD40)，从而发出B-细胞活化信号。另外，T辅助细胞分泌几种细胞因子，它们通过结合B细胞上的细胞因子受体而调节受刺激的B-细胞的生长和分化(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编, Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia (1999))。

在抗体产生的关联辅助过程中，CD40配体在活化的CD4+ T辅助细胞上瞬时表达，并且它结合抗原特异性的B细胞上的CD40，由此转导第二共刺激信号。后一种信号对于B细胞生长和分化以及对于记忆B细胞的产生（通过阻止已经遇到抗原的生发中心B细胞的凋亡）而言是必需的。在B和T细胞中的CD40配体的超表达（hyperexpression）牵涉入人SLE患者中的病原性自身抗体产生(Desai-Mehta, A. 等人, “Hyperexpression of CD40ligand by B and T cells in human lupus and its role in pathogenicautoantibody production,”J. Clin. Invest., 97(9): 2063-2073 (1996))。

T-淋巴细胞

T-淋巴细胞衍生自造血组织中的前体，在胸腺中经历分化，且然后被接种至周围淋巴组织和淋巴细胞的再循环库。T-淋巴细胞或T细胞介导宽范围的免疫学功能。这些包括辅助B细胞发育成抗体生成细胞的能力，增加单核细胞/巨噬细胞的杀微生物作用的能力，某些类型的免疫应答的抑制，靶细胞的直接杀伤，和炎症应答的动员。这些效应依赖于它们的特定细胞表面分子的表达和细胞因子的分泌(Paul, W. E., “Chapter 1: The immunesystem: an introduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编,Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。

T细胞与B细胞的差别在于它们的抗原识别机制。免疫球蛋白（B细胞的受体）结合在可溶性分子上或在颗粒表面上的各种表位。B-细胞受体遭遇在天然分子的表面上表达的表位。抗体和B-细胞受体进化为结合和保护免于细胞外流体中的微生物。相对照而言，T细胞识别在其它细胞的表面上的抗原，并通过与这些抗原呈递细胞(APC)相互作用和改变这些抗原呈递细胞(APC)的行为而介导它们的功能。在周围淋巴器官中存在三种主要的可以活化T细胞的抗原呈递细胞类型：树突细胞、巨噬细胞和B细胞。这些中最有效的是树突细胞，其唯一功能是将外来抗原呈递给T细胞。未成熟的树突细胞位于遍布整个身体的组织中，包括皮肤、肠道和呼吸道。当它们在这些部位遇到入侵微生物时，它们内吞病原体和它们的产物，并将它们经由淋巴携带至局部淋巴结或肠道相关性淋巴器官。与病原体的相遇诱导树突细胞从抗原捕获细胞成熟为可以活化T细胞的抗原呈递细胞(APC)。APC在它们的表面上展示三类蛋白分子，它们在活化T细胞以变成效应细胞中起作用：(1) MHC蛋白，其将外来抗原呈递给T细胞受体；(2)共刺激蛋白，其结合在T细胞表面上的互补受体；和(3)细胞-细胞黏附分子，其使T细胞能够结合抗原呈递细胞(APC)足够变得活化的时间长度(“Chapter 24: The adaptive immune system,”Molecular Biology of the Cell,Alberts, B. 等人, Garland Science, NY, 2002)。

基于它们表达的细胞表面受体，将T-细胞细分成两个不同类别。大部分的T细胞表达由α和β链组成的T细胞受体(TCR)。小的T细胞组表达由γ和δ链组成的受体。在α/β T细胞中存在两个重要的亚谱系：表达共同受体分子CD4的那些(CD4+ T细胞)；和表达CD8的那些(CD8+ T细胞)。这些细胞的差别在于它们如何识别抗原和它们的效应子功能和调节功能。

CD4+ T细胞是免疫系统的主要调节细胞。它们的调节功能依赖于它们的细胞表面分子（诸如CD40配体，在T细胞被活化时诱导其表达）的表达和它们当被活化时分泌的大批的细胞因子。

T细胞也介导重要的效应子功能，其中的一些由它们分泌的细胞因子的模式决定。所述细胞因子可以是对靶细胞直接有毒的，且可以动员有效的炎症机制。

另外，T细胞、特别是CD8+ T细胞可以发育成细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)，其能够有效地裂解表达被所述CTL识别的抗原的靶细胞(Paul, W. E., “Chapter 1: The immunesystem: an introduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编,Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。

T细胞受体(TCR)识别由肽组成的复合物，所述肽衍生自与II类或I类MHC蛋白的专门沟结合的抗原的蛋白酶解。CD4+ T细胞仅识别肽/II类复合物，而CD8+ T细胞识别肽/I类复合物(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编, Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia (1999))。

TCR的配体(即，肽/MHC蛋白复合物)在抗原呈递细胞(APC)内产生。一般而言，II类MHC分子结合从蛋白衍生出的肽，所述蛋白已经通过胞吞过程被APC摄入。这些加载肽的II类分子然后在细胞表面上表达，在此处它们可供具有TCR的CD4+ T细胞结合，所述TCR能够识别表达的细胞表面复合物。因而，CD4+ T细胞被专门化成与衍生自细胞外来源的抗原反应(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: an introduction,”FundamentalImmunology, 第4版, Paul, W. E.编, Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia(1999))。

相对照而言，I类MHC分子主要加载从内部合成的蛋白（诸如病毒蛋白）衍生出的肽。这些肽通过蛋白体的蛋白酶解而从胞质蛋白产生，并转运进粗面内质网中。这样的肽（通常是9个氨基酸的长度）结合进I类MHC分子且到达细胞表面，在此处它们可以被表达适当受体的CD8+ T细胞识别。这赋予T细胞系统，特别是CD8+ T细胞，检测表达蛋白的细胞的能力，所述蛋白不同于所述生物的其它部分的细胞的那些蛋白（例如，病毒抗原）或突变抗原（诸如活跃的癌基因产物）或以比其大得多的量产生，即使处于它们的完整形式的这些蛋白既不在细胞表面上表达也不分泌(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: anintroduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编, Lippicott-RavenPublishers, Philadelphia (1999))。

还可以基于它们作为以下细胞的功能将T细胞分类：辅助性T细胞；与诱导细胞免疫有关的T细胞；抑制性T细胞；和细胞毒性T细胞。

辅助性T细胞

辅助性T细胞是刺激B细胞以产生对蛋白和其它T细胞依赖性抗原的抗体应答的T细胞。T细胞依赖性抗原是免疫原，其中各个表位出现仅一次或有限次数，从而使得它们不能或效率低地交联B细胞的膜免疫球蛋白(Ig)。B细胞通过它们的膜Ig结合抗原，且所述复合物经历胞吞作用。在胞内体和溶酶体区室内，所述抗原被蛋白水解酶片段化为肽，且一个或多个产生的肽被加载进II类MHC分子中，其通过所述囊状区室运输。然后将所得到的肽/II类MHC复合物输出至B-细胞表面膜。具有对肽/II类分子复合物特异性的受体的T细胞识别在B-细胞表面上的所述复合物(Paul, W. E., “Chapter 1: The immune system: anintroduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编, Lippicott-RavenPublishers, Philadelphia (1999))。

B-细胞活化依赖于T细胞通过它的TCR的结合以及T-细胞CD40配体(CD40L)与B细胞上的CD40的相互作用两者。T细胞不组成型地表达CD40L。相反，作为与APC的相互作用的结果而诱导CD40L表达，所述APC表达被T细胞的TCR识别的关联抗原和CD80或CD86两者。CD80/CD86通常由活化的而不是静息的B细胞表达，从而使得涉及活化的B细胞和T细胞的辅助相互作用可以导致有效的抗体产生。但是，在许多情况下，在T细胞上的CD40L的初始诱导依赖于它们对组成型地表达CD80/86的APC（诸如树突细胞）的表面上的抗原的识别。这样的活化的辅助性T细胞然后可以与B细胞有效地相互作用并辅助B细胞。在B细胞上的膜Ig的交联（即使是效率低的）可能与CD40L/CD40相互作用协作以产生强劲的B-细胞活化。在B-细胞应答中的后来的事件，包括增殖、Ig分泌和(表达的Ig类别的)类别转换依赖于T细胞-衍生的细胞因子的作用或者被所述作用增强(Paul, W. E., “Chapter 1: The immunesystem: an introduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编,Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。

CD4+ T细胞倾向于分化成主要分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-10的细胞(TH2细胞)，或分化成主要产生IL-2、IFN-γ和淋巴毒素的细胞(TH1细胞)。TH2细胞非常有效地辅助B-细胞发育成抗体生成细胞，而TH1细胞是细胞免疫应答的有效诱导物，涉及单核细胞和巨噬细胞的杀微生物活性的增强以及随之发生的增加的在细胞内囊状区室中裂解微生物的效率。尽管具有TH2细胞的表型(即，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)的CD4+ T细胞是有效的辅助细胞，但是TH1细胞也具有成为辅助细胞的能力。(Paul, W. E., “Chapter 1: Theimmune system: an introduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编,Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。

与诱导细胞免疫有关的T细胞

T细胞也可以起作用来增强单核细胞和巨噬细胞的破坏细胞内微生物的能力。具体地，由辅助性T细胞产生的干扰素-γ(IFN-□)增强几种机制（单核吞噬细胞通过所述机制破坏细胞内细菌和寄生现象），包括氧化氮的产生和肿瘤坏死因子(TNF)产生的诱导。TH1细胞有效地增强杀微生物作用，这是因为它们产生IFN-γ。相比之下，由TH2细胞产生的两种主要细胞因子IL-4和IL-10阻断这些活性。(Paul, W. E., “Chapter 1: The immunesystem: an introduction,”Fundamental Immunology, 第4版, Paul, W. E.编,Lippicott-Raven Publishers, Philadelphia (1999))。

抑制性或调节T (Treg)细胞

免疫应答的起始和下调之间的受控平衡对于维持免疫体内稳态是重要的。凋亡和T细胞无反应性(一种耐受机制，其中T细胞在遇到抗原后内在地在功能上灭活(Scwartz,R. H., “T cell anergy,”Annu. Rev. Immunol., 21: 305-334 (2003))两者是有助于免疫应答下调的重要机制。第三种机制由抑制性或调节CD4+ T (Treg)细胞对活化的T细胞的活跃抑制提供(综述在Kronenberg, M. 等人, “Regulation of immunity by self-reactive T cells,”Nature 435: 598-604 (2005)中)。组成型地表达IL-2受体α(IL-2R□)链的CD4+ Treg (CD4+ CD25+)是无反应性的和抑制性的天然存在的T细胞亚群(Taams,L. S. 等人, “Human anergic/suppressive CD4+CD25+ T cells: a highlydifferentiated and apoptosis-prone population,”Eur. J. Immunol., 31: 1122-1131 (2001))。CD4+CD25+ Treg的排除在小鼠中导致产生全身性自身免疫病。此外，这些Treg的转移阻止自身免疫病的发展。人CD4+CD25+ Treg（类似于它们的鼠对应物）在胸腺中产生，且特征在于通过细胞-细胞接触依赖性机制抑制应答T细胞（responder T cell）的增殖的能力、不能产生IL-2和体外无反应性表型。根据CD25表达水平，可以将人CD4+CD25+ T细胞分成抑制性的(CD25高)和非抑制性的(CD25低)细胞。已经表明forkhead转录因子家族的成员FOXP3在鼠和人CD4+CD25+ Treg中表达，且看来似乎是控制CD4+CD25+ Treg发育的主导基因(Battaglia, M. 等人, “Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+Foxp3+ regulator T cells of both healthy subjects and type 1 diabeticpatients,”J. Immunol., 177: 8338-8347 (200))。

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)

识别来自在靶细胞内产生的蛋白的肽的CD8+ T细胞具有细胞毒性的性质，这是因为它们导致靶细胞的裂解。CTL-诱导的裂解的机制涉及由CTL产生穿孔蛋白，一种可以插入靶细胞的膜中并促进所述细胞的裂解的分子。由活化的CTL产生的一系列酶（被称作粒酶）增强穿孔蛋白介导的裂解。许多活跃的CTL也在它们的表面上表达大量fas配体。在CTL的表面上的fas配体与在靶细胞的表面上的fas的相互作用起始所述靶细胞中的凋亡，从而导致这些细胞的死亡。CTL-介导的裂解看来似乎是病毒感染的细胞的破坏的主要机制。

致敏

如本文中所使用的术语“未致敏细胞”(也被称作处女型、幼稚或无经验的细胞)指这样的T细胞和B细胞，其已经产生具有特定特异性的抗原受体(对于T细胞而言为TCR，对于B细胞而言为BCR)，但是还从未遇到所述抗原。如本文中所使用的术语“致敏”指由此T细胞和B细胞前体遇到它们对其特异性的抗原的过程。

例如，在辅助性T细胞和B细胞可以相互作用以产生特异性抗体之前，必须使抗原特异性的T细胞前体致敏。致敏包括几个步骤：抗原呈递细胞的抗原摄取、处理和与II类MHC分子结合的细胞表面表达，淋巴组织中辅助性T细胞前体的再循环和抗原特异性诱捕，以及T细胞增殖和分化。Janeway, CA, Jr., “The priming of helper T cells, Semin.Immunol. 1(1): 13-20 (1989)。辅助性T细胞表达CD4，但是并非所有的CD4 T细胞都是辅助细胞。上文出处。辅助性T细胞的克隆扩充所需的信号不同于其它CD4 T细胞所需的那些信号。对于辅助性T细胞致敏而言关键性的抗原呈递细胞看来似乎是巨噬细胞；且对于辅助性T细胞生长而言的关键性第二信号是巨噬细胞产物白细胞介素1 (IL-1)。上文出处。如果致敏的T细胞和/或B细胞接收到第二共刺激信号，那么它们变成活化的T细胞或B细胞。

如本文中所使用的术语“移植”指将细胞、组织或器官从一个部分或个体取出并转移至另一个。

根据一个方面，所述的发明提供了结合人Flt3和人CD3两者的重组双特异性抗体。根据一些实施方案，所述Flt3抗体结合FLT3/FLK2受体蛋白。根据一些实施方案，所述FLT3/FLK2受体蛋白是哺乳动物蛋白。根据一些实施方案，所述FLT3/FLK2受体蛋白是人蛋白。根据一些实施方案，所述FLT3/FLK2受体蛋白是天然的。根据一些实施方案，所述FLT3/FLK2受体蛋白处于修饰形式。根据一些实施方案，所述FLT3/FLK2受体蛋白处于变性形式。根据一些实施方案，所述FLT3/FLK2受体蛋白处于未修饰形式。根据一些实施方案，所述Flt3抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段和合成抗体模仿物。根据一些实施方案，所述Flt3抗体是单克隆抗体。根据一些实施方案，所述FLt3单克隆抗体选自合成抗体和人工改造的抗体。根据一些实施方案，所述合成抗体是重组抗体。根据一些实施方案，所述重组抗体是单链可变区片段(scFv)抗体。根据一些实施方案，所述单链抗体包含与IgG1的CH2结构域连接的Flt3抗体的Fab片段的C末端。根据一些实施方案，所述IgG1的CH2结构域连接至与人CD3的亚基反应的抗体的单链可变区片段(ScFv)。根据一些实施方案，所述单链可变区片段是单克隆抗体。根据一些实施方案，所述人CD3的亚基是UCHT1。根据一些实施方案，所述人工改造的抗体是嵌合抗体。根据一些实施方案，所述人工改造的抗体是人源化抗体。

根据一些实施方案，所述结合Flt3的FLT3抗体有效地阻断FLT3配体与FLT3/FLK2受体蛋白的结合。根据一些实施方案，所述结合细胞上的Flt3的FLT3抗体对于所述细胞内化结合的抗体而言是有效的。

根据一些实施方案，所述Flt3抗体具有在约1 ng/mL (6.25 pM)和约2,000 ng/mL(12.5 nM)之间的半最大有效浓度(EC

根据另一个方面，用于制备结合人FLT3和人CD3两者的重组单链双特异性抗体的方法包括将Flt3单克隆抗体的Fab片段的C-末端连接至IgG1的CH2结构域，和将与人CD3的亚基(UCHT1)反应的单克隆抗体的单链可变区片段(ScFv)连接至所述IgG1的CH2结构域。

根据另一个方面，所述的发明提供了在有此需要的患者中消除造血干细胞/造血祖细胞(HSC/HP)的方法。根据一些实施方案，所述方法包括给所述患者施用特异性地结合HSC/HP和T-细胞的双特异性抗体。具体地，所述双特异性抗体结合由HSC/HP表达的人FLT3和由T细胞表达的人CD3。所述抗体的同时结合使T-细胞改变方向为特异性地消除患者的HSC/HP。

所述方法也提供了有效量的特异性抗体向所述患者的施用。有效量是0.01 mg/kg至10 mg/kg，更好是0.05 mg/kg至2mg/kg，更好是0.1mg/kg至0.5mg/kg，更好是0.1mg/kg至0.3mg/kg，更好是0.1mg/kg。

根据一些实施方案，所述结合灵长类动物和人CD3的双特异性抗体是人源化抗体。

根据一些实施方案，所述双特异性抗体或其抗原结合部分包含FLT3抗体的氨基酸序列。

根据一些实施方案，所述双特异性抗体或其抗原结合部分包含CD3抗体的氨基酸序列。

根据一些实施方案，所述双特异性抗体或其抗原结合部分包含选自免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE、IgA或IgD同种型的同种型。

根据另一个方面，本发明还提供了在有此需要的患者中消除HSC/HP的方法，其中所述HSC/HP表达FLT3。所述方法包括选择需要消除HSC/HP的患者，和给所述患者施用治疗有效量的包含双特异性抗体的药物组合物，所述双特异性抗体特异性地结合由HSC/HP表达的人FLT3和由T-细胞表达的人CD3，其中所述双特异性抗体使T-细胞改变方向为杀伤所述患者的HSC/HP。

需要消除HSC/HP的患者是这样的患者，其遭受急性髓性白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、周围T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非血液学恶性肿瘤如神经母细胞瘤、非恶性的遗传性和获得性骨髓病症(例如镰状细胞贫血、β-重型地中海贫血、顽固性Diamond-Blackfan贫血、骨髓异常增生综合征、特发性重度再生障碍性贫血、阵发性夜间血红蛋白尿、单纯红细胞再生障碍、范康尼贫血、巨核细胞缺乏或先天性血小板减少症)、多发性骨髓瘤、重度联合免疫缺陷(SCID)和使用骨髓(BM)/造血干细胞(HSC)移植治疗的其它病症。

所述药物组合物包含所述抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。所述载体选自例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。药学上可接受的载体可以进一步包含小量的辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强所述结合蛋白的贮存期限或有效性。如本领域众所周知的，可以配制所述药物组合物，从而在施用后提供活性成分的快速、持续或延迟释放(Mishra, M. K. (2016).

所述药物组合物可以进一步包含另一种组分诸如T-细胞或抗肿瘤剂。与所述抗体一起施用的抗肿瘤剂包括破坏或损伤肿瘤或恶性细胞的任何药剂。

所述抗肿瘤剂选自本领域技术人员已知的合适抗癌剂，且包括蒽环类(例如柔红霉素和阿霉素)、 奥瑞他汀（auristatin）、甲氨蝶呤(MTX)、长春地辛、新制癌菌素、顺铂、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、5-氟尿苷、美法仑、蓖麻毒蛋白和加利车霉素，包括联合化学疗法诸如与阿霉素、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪(ABVD)、BEACOPP或增强剂量BEACOPP（escalatedBEACOPP） (博来霉素、依托泊苷、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)和Stanford V (阿霉素、长春碱、氮芥、长春新碱、博来霉素、依托泊苷和泼尼松)一起。所述抗肿瘤剂还可以是免疫治疗(例如抗-CD20抗体利妥昔单抗（rituximab）)、免疫毒素(例如本妥昔单抗（Brentuximab vedotin）(SGN-35)是由与抗微管蛋白剂单甲基奥瑞他汀E (MMAE)连接的CD-30定向抗体组成的免疫毒素)、过继免疫治疗(细胞毒性T淋巴细胞)、程序性死亡1 (PD-1)阻断(例如，纳武单抗（nivolumab）、派姆单抗（pembrolizumab）)。

根据另一个方面，本发明进一步提供了在体内动物模型中试验双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体使T-细胞改变方向为杀伤HSC/HP，其中所述动物模型是具有嵌合的小鼠-人造血系统的免疫妥协的人源化小鼠，其中所述人源化小鼠如下产生：向所述严重骨髓抑制的（myeloablated）免疫妥协的小鼠中移植人HSC/HP或移植人出生后成血内皮细胞。

根据在整体引入本文作为参考的Durben等人(Molecular Therapy, 第23卷, 第4期，2015年4月)中描述的方法，已经合成了本发明的双特异性抗体。

使用的FLT3抗体序列描述在也整体引入本文作为参考的Grosse-Hovest等人的美国专利No. 9,023,996中。

应当理解，尽管结合其优选实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员知道可以在不背离本发明的精神的情况下做出其它实施方案。

在提供值范围的场合，应理解，除非上下文另有明确指示，否则在所述范围的上限和下限之间的每个以下限单位的十分之一为基准的中间值和在所述规定范围内的任何其它规定值或中间值都包括在本发明内。根据规定范围中任何具体排除的限值，这些较小范围的上限和下限也包括在本发明中，其可以独立地包括在所述较小范围内。在规定范围包括一个或两个限值的场合，排除那些包括的限值中的任一或两者的范围也包括在本发明中。

除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可以用于实践或试验所述的发明，但是已经描述了示例性的方法和材料。在本文中提及的所有出版物都引入本文作为参考以公开和描述引用的出版物与其相关的方法和/或材料。

必须指出的是，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个（a）”、“一种（an）”和“该/所述（the）”包括复数对象，除非上下文另有明确指示。

实施例

提出下述实施例以便给本领域普通技术人员提供如何制备和使用所述的发明的完全公开和描述，且既不意图限制发明人所以为的其发明的范围，也不意图表示下文的实验是所执行的全部或唯一实验。已努力确保关于所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应计及一些实验误差和偏差。除非另外指出，份是重量份，分子量是重均分子量，温度是以摄氏度为单位，且压力是处于或接近大气压。

为了更好地举例说明本发明，给出以下实施例。

背景信息

Fabsc是一种重组双特异性抗体形式。靶向FLT3 (使用4G8克隆)和CD3 (使用UCHT1抗体序列，也被称作huxCD3v1)的双特异性抗体的Fabsc形式如下：Flt3 mAb的Fab片段的C-末端将连接至IgG1的CH2结构域，继之以UCHT1的ScFv。

分别从整体引入本文作为参考的专利No. US 9,023,996 B2和专利No. 6,054,297得到4G8克隆和UCHT1的序列。

实验的范围

基于在背景中描述的形式的4G8和UCHT1可变重链和轻链序列的基因合成。

IgG表达载体的分子构建。

在HEK293细胞中的0.1升高质量（premium）瞬时生产。

定制纯化(KappaSelect和蛋白L（protein L）-柱和在pH 2.3洗脱)。

通过SE-HPLC的蛋白聚集分析。

目标可交付物（Target Deliverables）

来自0.1升生产的所有纯化的蛋白。

研究报告包括：分析证书，CE-SDS分析，SE-HPLC分析报告。

取决于在表达和纯化以后得到的收率，客户将决定生产的抗体是否用于以下分析步骤：

试验纯度，单体含量，和通过SE-HPLC分析聚集(0.1 mg)。

通过ForeBio Octet QKe (0.2 mg)进行使用不同浓度的抗原的缔合和解离以及kD的计算。

结果

将Fabsc抗体克隆进高表达哺乳动物载体系统中，并在HEK293细胞中完成小规模(0.1升)高质量瞬时生产。通过蛋白L纯化来纯化蛋白，并得到20.17 mg蛋白。报告收率，且客户证实应当执行SE-HPLC。通过SE-HPLC确定所述抗体是92%未聚集的单体。

表达载体的分子构建

合成DNA Studio基因并将程序化的序列克隆进高表达哺乳动物载体之一中。在进行到转染前，将完成的构建体进行序列确认。

表A

小规模瞬时转染

在转染前1天将HEK293细胞接种在摇瓶中，并使用无血清化学成分确知培养基培养。使用用于瞬时转染的标准操作程序，将DNA表达构建体瞬时转染进0.1升的悬浮HEK293细胞中。20小时以后，将细胞取样以得到生存力和活细胞计数，并测量滴度(Octet QKe,ForteBio)。在第5天收获培养物，并做另外的读出。

蛋白L亲和纯化

将Fabsc的条件培养基收获，并通过离心和过滤从瞬时转染生产过程澄清。将上清液在蛋白L柱上运行并用低pH缓冲液洗脱。在等分试样之前使用0.2µm膜滤器执行过滤。纯化和过滤以后，从OD280和消光系数计算蛋白浓度。关于收率和等分试样的概括说明，参见表1。执行CE-SDS分析(LabChip GXII, Perkin Elmer)并绘制电泳图谱且显示在图1A和1B中。

SE-HPLC分析

以0.2 mL/min的流速将5µL纯化的抗体注射进MAbPac SEC-1, 5µm, 4 x 300 mm柱中达25分钟。在预期的时间洗脱蛋白，92%呈它的非聚集形式。可以在图1C中观察SE-HPLC的层析谱和说明。

关于聚集水平的概括说明，参见表1。

表1. 最终的收率和等分试样

项目概括说明

将Fabsc抗体克隆进LakePharma的高表达哺乳动物载体系统中，并在HEK293细胞中完成小规模(0.1升)高质量瞬时生产。通过蛋白L纯化来纯化蛋白，并得到20.17 mg蛋白，并递送19.07 mg。通过SE-HPLC确定所述抗体是92%未聚集的。关于收率和等分试样的概括说明，参见表1。

蛋白纯化结果

过程概括说明和说明

蛋白L亲和层析

0.2 μm无菌过滤

表2

表3

方法

表4

表5

实施例2：用于骨髓/造血干细胞(BM/HSC)移植的患者的准备或调理.

用于骨髓/造血干细胞(BM/HSC)移植的患者的准备或调理是所述程序的关键的要素。它起两个主要作用：(1)它提供患者的适当免疫抑制并在骨髓中为移植的HSC清除足够生态位空间。这允许将移植的细胞移入接受者中；和(2)它经常帮助根除恶性肿瘤的来源。

传统上已经如下实现患者的调理：在有或没有辐射的情况下施用最大耐受剂量的化疗剂的混合物。经常将混合物的组分选择成具有不重叠的毒性。目前在使用中的所有准备方案都是有毒的，且具有可以危及生命的严重副作用。在这些副作用中有粘膜炎、恶心和呕吐、脱发、腹泻、疹、周围神经病、不育、肺和肝毒性。这些副作用中的许多对于老年和患病的患者而言是尤其危险的，且经常在决定患者是否将接受移植时变成决定性组分。

为了消除用于调理经历BM/HSC移植的患者的化疗剂的使用，我们开发了使用改变方向的T-细胞杀伤选择性地消除造血干细胞/造血祖细胞(HSC/HP)的方法。所述方法是基于双特异性抗体的应用，所述双特异性抗体结合HSC/HP的表面上的靶(FLT3)，并且也结合T-细胞的表面上的靶(CD3)，从而募集针对HSC/HP的T-细胞。

作为开发的方法可用于消除HSC/HP的原理的证据，我们试验了双特异性的(FLT3xCD3)抗体，其被设计成杀伤急性髓性白血病(AML)患者的原代外周血单核细胞中的白血病胚细胞(Durben, Schmiedel等人. 2015)。

将雌性免疫妥协的NOG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)小鼠(4-6周龄)用于从脐带血(CB)移植人CD34+ HSC/HP。使用菲可帕克（Ficoll-Paque）(GEHealthcare Life Sciences)通过梯度密度离心分离CB的单核的细胞级分。简而言之，将用抗凝剂处理过的CB与磷酸缓冲盐水(PBS)以1:1比例混合，并覆盖(35ml混合物)在50ml圆锥形离心管内的菲可帕克层(10ml)上。然后将管于400 x g的速度旋转。小心地取出单核细胞淋巴细胞层，并将从所述层得到的细胞用PBS洗涤2次。

用血小板排除（platelet depletion）(Stemcell Technologies)通过负选择来分离CD34+ HSC/HP。靶向不需要的细胞，用于用识别CD2、CD3、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD61、CD66b、血型糖蛋白A和葡聚糖包被的磁性颗粒的四聚体抗体复合物除去。在不使用柱的情况下使用EasySep™磁体将标记的细胞分离。

将CD34+ HSC/HP以10,000-50,000个细胞/200µl重悬浮于PBS中用于移植进严重骨髓抑制的NOG小鼠中。

在移植前24小时，经由腹膜内注射使用白消安(10 mg/kg)将小鼠严重骨髓抑制。通过尾静脉注射200µl细胞悬浮液(n=52)，移植CD34

还针对人B-细胞(hCD19

插入片段的蛋白序列

信号肽

可变重

可变轻。

插入片段的DNA序列

用表达人FT3/FLK2受体蛋白的完全编码序列和嘌呤霉素抗性的选择标记的慢病毒转导来自鼠骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞。在体外在有嘌呤霉素的情况下选择转导的细胞。将经过选择并针对人FLT3/FLK2蛋白细胞的表达验证过的细胞(SP2/0-Hu-FLT3)用作抗原。

将8周龄Balb/c小鼠通过每5天腹膜内注射用107 SP2/0-Hu-FLT3细胞免疫3次，以产生对FLT3/FLK2蛋白特异性的抗体。通过使用流式细胞术针对FLT3/FLK2抗原的结合筛选免疫的小鼠的血清，试验抗体的发展。

第一次免疫以后大约3周，收集免疫的小鼠的脾，并用于分离脾细胞。将分离的脾细胞与SP2/0细胞融合，并针对杂交表型(杂交瘤)进行选择。将杂交瘤在体外培养，并通过流式细胞术针对抗-FLT3/FLK2抗体的存在筛选来自杂交瘤培养物的上清液(图3A和3B)。9个杂交瘤克隆表现出抗-FLT3/FLK2抗体的生产。扩充这些杂交瘤克隆用于分离单克隆抗体。将分离的单克隆抗-FLT3/FLK2抗体纯化并针对它们的选择性进行试验(图4 A和4B)。

通过评价它们对FLT3/FLK2抗原的亲和力，确定单克隆抗体的特异性。为了确定抗-人FLT3/FLK2抗体的亲和力，使用流式细胞术建立有效浓度(EC)曲线。将9个单克隆抗体克隆用于染色内源性地表达人FLT3/FLK2的人REH细胞。所述克隆的浓度范围从1 ng/ml(6.25 pM)一直到10,000 ng/ml (62.5 nM)。选择5个具有范围从约70 ng/ml (437.5 pM)一直到1566 ng/ml (9.79 nM)的EC

MHC1692 - 1-23DA序列：

MHC1693 - 3-16HA序列：

MHC1695 - 3-3OA序列：

MHC1696 - 2-8IA序列：

MHC2279 - 1B11.E7序列：

MHC1694 - 1-18BA序列：

表6

通过内化测定来定量针对FLT3/FLK2的单克隆抗体(实施例3)的内化。

简而言之，针对抗体281A、330A、316HA和123DA，在染色缓冲液（含有2%小牛血清（BCS）的1x磷酸缓冲盐水（PBS））中在冰上制备抗体的2X (4µg/ml)工作原液。将4µg/ml的抗-人CD135 (FLT3/FLK2)抗体的原液(BioLegend #313302, 克隆BV10A4H2)和4µg/ml同种型对照(BioLegend #400102, 克隆MOPC-21)分别制备为阳性和阴性CD135染色对照。将Reh细胞（表达CD135的人细胞系）洗涤，并以2x10

以60µl/分钟的样品流速，在Beckman Coulter Cytoflex上通过流式细胞术分析染色的细胞。为每个孔捕获10,000个事件，并使用FloJo软件第10版评价FCS文件。针对活细胞群体计算Alexa 488的平均荧光强度(MFI)，并在4℃和37℃相对于时间绘制每种抗体的MFI中的变化。

如在图6中所示的，所有克隆都表现出内化，其中克隆330A和123DA表现出最快速的内化(图6)。在不受理论限制的情况下，假定抗-FLT3/FLK2抗体(克隆330A、123DA、316HA和281A)的内化性质使得它们作为运载体有效(例如，抗体-药物-缀合物- ADC)以将药物/毒素递送到靶向的细胞内。

尽管已经参考其具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，可以在不脱离本发明的真实精神和范的情况下做出多种变化且可以替换等同方案。另外，可以做出许多修改来按照本发明的客观精神和范围采用特定情形、材料、物质的组合物、方法、一个或多个方法步骤。所有这样的修改都意图在本文所附的权利要求的范围内。

序列表

<110> HEMOGENYX LLC

<120> 使用双特异性抗体消除患者中的造血干细胞/造血祖细胞(HSC/HP)的方法

<130> 128557-00119

<140>

<141>

<150> US 16/506,764

<151> 2019-07-09

<150> US 16/091,139

<151> 2018-10-04

<150> PCT/US2017/025951

<151> 2017-04-04

<150> US 62/317,906

<151> 2016-04-04

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 613

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Asp Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ile Thr Thr Thr Pro Phe Asp Phe Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Gly Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gln Leu Pro Ser Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly

355 360 365

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

370 375 380

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

385 390 395 400

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

405 410 415

Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val

420 425 430

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

435 440 445

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

450 455 460

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

465 470 475 480

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

485 490 495

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser

500 505 510

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

515 520 525

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

530 535 540

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu

545 550 555 560

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr

565 570 575

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

580 585 590

Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys

595 600 605

Val Glu Ile Lys Arg

610

<210> 2

<211> 234

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Val Thr Pro Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Ile Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn

85 90 95

Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn

100 105 110

Thr Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 3

<211> 1842

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactcccag 60

gtgcagctgc agcagcctgg tgccgagctc gtgaaacctg gcgcctccct gaagctgtcc 120

tgcaagtcct ccggctacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgcg acagaggcct 180

ggccacggac tggaatggat cggcgagatc gacccctccg actcctacaa ggactacaac 240

cagaagttca aggacaaggc caccctgacc gtggacagat cctccaacac cgcctacatg 300

cacctgtcct ccctgacctc cgacgactcc gccgtgtact actgcgccag agccatcaca 360

accaccccct tcgatttctg gggccagggc accacactga cagtgtcctc cgcttccacc 420

aagggcccct ccgtgtttcc tctggcccct tccagcaagt ccacctctgg cggaacagcc 480

gctctgggct gcctcgtgaa ggactacttc cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 540

ggcgctctga catccggcgt gcacaccttc cctgctgtgc tgcagtctag cggcctgtac 600

tccctgtcca gcgtcgtgac cgtgccttcc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 660

aacgtgaacc acaagccttc caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagtcctgc 720

gacaagaccc acaccagccc tccaagccct gctcctcctg tggctggccc tagcgtgttc 780

ctgttccctc caaagcccaa ggataccctg atgatctccc ggacccccga agtgacctgc 840

gtggtcgtgg gagtgtctca cgaggaccct gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 900

gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agtaccagtc cacctaccgg 960

gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc 1020

aaggtgtcca acaagcagct gcccagcccc atcgaaaaga ccatctccaa ggctaagggc 1080

ggaggcggag ctggtggtgg cggagaagtg cagctggtgg aatctggcgg cggactggtg 1140

cagcctggcg gatctctgag actgtcttgt gccgccagcg gctactcttt caccggctat 1200

accatgaatt gggtgcgcca ggcccctgga aagggcctgg aatgggtggc cctgatcaac 1260

ccctacaagg gcgtgaccac ctacgccgac tccgtgaagg gccggttcac catctccgtg 1320

gacaagtcca agaataccgc ttacctgcag atgaactccc tgcgggccga ggacaccgct 1380

gtgtattact gtgctagatc cggctactac ggcgacagcg attggtactt cgacgtgtgg 1440

ggacagggaa ccctcgtgac tgtgtcatca ggcggcggtg gttctggcgg agggggatct 1500

gggggcggtg gatccgatat ccagatgacc cagtccccca gctccctgtc tgcctctgtg 1560

ggcgacagag tgaccatcac ctgtcgggcc tctcaggaca tccggaacta cctgaactgg 1620

tatcagcaga agcccggcaa ggcccccaag ctgctgatct actacacctc ccggctggaa 1680

agcggcgtgc cctccagatt ctccggctct ggctctggaa ccgactatac cctgaccatc 1740

tctagcctgc agcccgagga cttcgccacc tactactgcc agcagggcaa caccctgccc 1800

tggacctttg gccagggaac aaaggtggaa atcaagcggt ga 1842

<210> 4

<211> 705

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60

gacatcgtgc tgacccagtc tcccgccacc ctgtctgtga cccctggcga ctctgtgtcc 120

ctgtcctgca gagcctccca gtccatctcc aacaacctgc actggtatca gcagaagtcc 180

cacgagagcc ctcggctgct gattaagtac gccagccagt ctatctccgg catcccctcc 240

agattctccg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctgt ccatcaactc cgtggaaacc 300

gaggacttcg gcgtgtactt ctgccagcag tccaacacct ggccctacac ctttggcgga 360

ggcaccaagc tggaaatcaa gcggaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccctccc 420

agcgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 480

ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 540

gagagcgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600

ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccaggga 660

ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gctaa 705

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg

100 105

<210> 6

<211> 321

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 6

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60

ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca 120

gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gcatccactt tacattctgg tgtcccaaaa 180

aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tactctctca ccatcagcag gcttgagtct 240

gaagatgttg cagactatta ctgtctacaa tatgctagtt atccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataag a 321

<210> 7

<211> 123

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Thr Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Leu His Ile Leu Trp Asn Asp Ser Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Val Tyr Tyr Ser Thr Tyr Val Gly Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 369

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 8

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttctctgagc acttctacta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg ttacacattt tgtggaatga tagtaagtat 180

tataacccag ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctacaa caagcaggta 240

ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaata 300

gtttactact ctacctacgt cgggtacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 9

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 333

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 10

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggttc 120

caacagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatg ctgtatccaa ccaaggatcc 180

ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240

cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 11

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Ile Thr Met Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Gly Asn Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 12

<211> 348

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 12

gaggttcagc tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctt agtcaagttg 60

tcctgcaaag gttctggctt caacattaaa gactactata tacactgggt gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg agaatgatat tactatgtat 180

gacccgaagt tccagggcaa ggccagtata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240

ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagaaatggt 300

aatttctttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asn Ser Gly Val Pro Arg Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 321

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 14

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60

ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca 120

gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gcatccactt taaattctgg tgtcccaaga 180

aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240

gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tatgctagtt atccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataaa a 321

<210> 15

<211> 124

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 15

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

His Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Leu His Ile Leu Trp Asn Asp Ser Val Tyr Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Val Tyr Tyr Gly Ile Ser Tyr Val Gly Tyr Phe Asp

100 105 110

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 372

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 16

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctcaca tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg ttacacattt tgtggaatga tagtgtgtac 180

tataacccag ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctacaa caagcaggta 240

ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaata 300

gtttactacg gtattagtta cgtcgggtac ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 17

Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Gly Phe Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Asn Ser Val Glu Thr

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 18

<211> 321

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 18

gatactgtgc taactcaatc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60

ctttcctgca gggccagcca aagtattagc aacaacctac actggtatca acaaaaatca 120

catgagtctc caaggcttct catcaagtat ggtttccagt ccatctctgg gatcccctcc 180

aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca gaatcaacag tgtggagact 240

gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag actaacagct ggccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 19

<211> 115

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 19

Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Tyr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Asn Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 345

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 20

gagatccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaaggta 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcatt gactacaaca tgtactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatggtgg tactagcaac 180

aaccagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240

atgcatctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagaggtact 300

acgggtgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345

<210> 21

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 21

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 333

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 22

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggttc 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180

ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240

cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333

<210> 23

<211> 119

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Met Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Ser Lys Arg Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 357

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 24

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgatgc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180

aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatcagcc 300

tactatagta aaagggatga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg

100 105

<210> 26

<211> 321

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 26

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt 60

ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca 120

gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc gcatccactt tacattctgg tgtcccaaaa 180

aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tactctctca ccatcagcag gcttgagtct 240

gaagatgttg cagactatta ctgtctacaa tatgctagtt atccattcac gttcggctcg 300

gggacaaagt tggaaataag a 321

<210> 27

<211> 123

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 27

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Thr Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Leu His Ile Leu Trp Asn Asp Ser Lys Tyr Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Tyr Asn Lys Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Val Tyr Tyr Ser Thr Tyr Val Gly Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 369

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 28

caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60

acttgttctt tctctgggtt ttctctgagc acttctacta tgggtgtagg ctggattcgt 120

cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg ttacacattt tgtggaatga tagtaagtat 180

tataacccag ccctgaagag ccggctcaca atctccaagg atacctacaa caagcaggta 240

ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcgaata 300

gtttactact ctacctacgt cgggtacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360

gtctcctca 369