一种草莓茎尖无激素培养方法

摘要

一种草莓茎尖无激素培养方法，按以下步骤进行：（1）配制MT液体培养基溶液，其中蔗糖的质量浓度为7～8%；（2）向培养皿中加入液体培养基溶液，制成液体培养基；（3）剪取4～6cm的草莓匍匐茎顶芽，剥去外层大叶，水洗获得外植体；（4）将外植体先用酒精消毒，再用次氯酸钠溶液消毒，然后用无菌水清洗；（5）剥去无菌外植体外层叶片，切取长度为0.3～0.5mm的茎尖；（6）接种到液体培养基中，然后置于培养箱中进行初代培养；（7）获得培养后茎尖转移至MS固体培养基上，培养至分化出丛生芽和根。本发明的方法不需要受激素浓度的限制；在高糖浓度下茎尖不易褐化，生长速度适中，保证了品种的遗传稳定性。

说明书

技术领域

本发明属于植物培养技术领域，特别涉及一种草莓茎尖无激素培养方法。

背景技术

茎尖培养广泛应用于种苗快速繁殖、脱毒苗生产、品种改良等。茎尖组织培养后植株遗传学稳定，特别适合用于常规繁育有困难的物种、童期长的树木或者需要脱毒的物种。1960年，Morel最早以兰花茎尖繁育兰花，通过茎尖组织培养，获得无病毒植株，从而克服了兰花种子繁殖效率低及品种退化的问题，促进了兰花产业的兴盛。

目前茎尖培养普遍采用MS培养基或略加修改，再补加其它物质如营养成分、生长调节物质等来提高茎尖组织培养的成苗率。MS培养基碳源一般为2～4%葡萄糖或者蔗糖，植物激素的种类及浓度对于不同的植物品种各不相同，生长素用的最多的是NAA，其次是IAA，细胞分裂素在促进不定芽产生上效果显著，常用6-BA、玉米素和KT等；赤霉素有利于茎尖伸长和成活，需要的浓度较低，浓度太高会产生不利影响。

茎尖培养的成活率与茎尖大小呈正相关。快繁可取数毫米大小的茎尖，而脱毒苗培养则要求取小于0.5mm的茎尖生长点，茎尖生长点指带有1～2个叶原基的生长锥。病毒引起的病害不同于真菌及细菌病害，不能采用杀菌剂和抗生素防治，生产上目前无法根治。病毒在植物体内分布不均匀，茎尖生长点因为无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以茎尖生长点几乎不含病毒。茎尖培养脱毒效果好，后代稳定，目前广泛应用。草莓茎尖培养始于20世纪60年代，既可在短期内加速繁殖草莓优良品种以供商品化生产，又可挽救严重感染病毒的草莓优良品种。草莓茎尖培养通常用MS培养基和不同浓度激素组合，但因为不同品种茎尖对激素种类和浓度需求各不相同，导致操作者要不断摸索调整激素种类和浓度用于茎尖培养，费时又费力，不利于大规模推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种草莓茎尖无激素培养方法，采用不添加任何激素的高糖液体培养基，培养草莓茎尖，草莓茎尖培养可直接获得草莓苗。

本发明的方法按以下步骤进行：

（1）配制MT （Murashge and Tucker）液体培养基溶液，其中蔗糖的质量浓度为7～8%，灭菌后分装；

（2）向培养皿中加入液体培养基溶液，制成液体培养基，用封口膜封好备用；

（3）剪取4～6cm的草莓匍匐茎顶芽，剥去外层大叶，水洗获得外植体；

（4）将外植体先用酒精消毒20～30s，再用次氯酸钠溶液消毒15～25min，然后用无菌水清洗，获得无菌外植体；

（5）将体视镜置于超净台中，在体视镜下剥去无菌外植体外层叶片后，用解剖刀切取长度为0.3～0.5mm的茎尖；

（6）将茎尖接种到液体培养基中，然后置于培养箱中进行初代培养2～3周；

（7）初代培养完成后，将获得的培养后茎尖转移至含有MS固体培养基的三角瓶内，然后置于培养箱中培养至分化出丛生芽和根。

上述的步骤（1）中，灭菌后分装按100ml/瓶分装。

上述的步骤（2）中，培养皿为灭菌后的直径60mm玻璃培养皿。

上述的步骤（2）中，向培养皿中加入液体培养基溶液是在超净工作台中向若干个培养皿中加入液体培养基溶液。

上述的步骤（2）中，每个培养皿的加入量为3ml。

上述的步骤（3）中，水洗是指用流水洗净。

上述的步骤（4）中，酒精的质量浓度为70～75%。

上述的步骤（4）中，次氯酸钠溶液的质量浓度为1～1.5%。

上述的步骤（4）中，无菌水清洗次数为4～5次。

上述的步骤（4）中，无菌外植体在进行剥取茎尖生长点之前，放入铺有滤纸的培养皿中待用。

上述的步骤（6）中，培养皿水平放置于培养箱隔板上，培养箱的培养条件为：光照强度1600~2200Lux，24小时之内的16小时的40±0.5℃光照和8小时的30±0.5℃黑暗组成；其中40±0.5℃处理用于钝化病毒。

上述的步骤（7）中，每个100mL三角瓶装内加入30mLMS固体培养基，培养后茎尖基部插入MS固体培养基，使培养后茎尖继续在无菌环境中培养，培养箱的培养条件为：光照强度1600~2200Lux，温度25℃，16小时光照/8小时黑暗条件下培养。

本发明的方法不需要受激素浓度的限制；本发明利用高糖MT培养基，在高糖浓度下，茎尖不易褐化，生长速度适中，也不会产生愈伤组织，40±0.5℃处理用于钝化病毒不影响茎尖生长，保证了品种的遗传稳定性。

本发明对红颜、甜查理、奶油三个草莓品种均能获得再生苗，显著提高了植物茎尖培养的效率，说明该培养基适用于多个草莓品种，未来可在不同草莓品种上广泛应用。

本发明的主要优点在于：

（一）不需要受激素浓度的限制：

草莓茎尖培养通常用MS培养基和不同浓度激素组合，但因为不同品种茎尖对激素种类和浓度需求各不相同，导致操作者要不断摸索调整激素种类和浓度用于茎尖培养，费时又费力，不利于大规模推广；本发明利用高糖MT培养基，在高糖浓度下，茎尖不易褐化，生长速度适中，也不会产生愈伤组织，保证了品种的遗传稳定性；

（二）在茎尖培养同时也可钝化病毒，显著节省生产成本：

前人研究对带毒草莓进行脱毒处理是先选择无明显病班、品种纯正的健壮植株,栽于盆中,置于人工气候箱内40℃处理16 h、35℃处理8 h、变温处理4周；再在新生嫩枝上进行茎尖剥离和茎尖培养，人工气候室热处理这一步骤因处理植株数量较大，需消耗大量能源，成本代价较高；本方法对草莓茎尖培养同时开展高温病毒钝化处理，切取0.5mm以下草莓茎尖放置于60mm培养皿，所用液体培养基仅需3ml，热处理在普通培养箱中进行，一个200L容量培养箱可以同时处理几百个不同样品，这种方式将节省大量电能，消耗培养基量少，大量节约硬件设施购置和运行成本，更符合当前节能减排的环保要求；

（三）应用前景：

目前对草莓茎尖培养普遍采用的MS培养基+植物激素，对于不同品种激素种类和浓度不尽相同，需要操作者花费很大精力进行实验摸索针对不同品种的激素配方；本发明采用高糖MT培养基分别对红颜、甜查理、奶油三个草莓品种进行茎尖培养，不使用激素，均能高效获得再生苗，显著提高草莓茎尖培养效率；我们在茎尖培养同时采用昼夜交替高温处理钝化病毒，免去了草莓组培苗生产单位购置人工气候室并节约大量电能消耗；该方法显著节本节能增效，有利于草莓组织培养的规模化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中的茎尖和初代培养15天后的培养后茎尖外观照片图；图中，左图为茎尖生长点，右图为初代培养15天后的培养后茎尖；

图2为本发明实施例1中的培养至分化出丛生芽和根的再生草莓苗外观照片图。

具体实施方式

本发明实施例中采用的草莓的品种为红颜、甜查理和奶油。

本发明实施例中培养成活率95%以上。

实施例1

配制MT液体培养基溶液，其中蔗糖的质量浓度为7%，灭菌后按100ml/瓶分装；

在超净工作台中向若干个培养皿中加入液体培养基溶液，每个培养皿的加入量为3ml，制成液体培养基，用封口膜封好备用；培养皿为灭菌后的直径60mm玻璃培养皿；

剪取5cm的草莓匍匐茎顶芽，剥去外层大叶，用流水洗净获得外植体；

将外植体先用酒精消毒25s，再用次氯酸钠溶液消毒20min，然后用无菌水清洗，获得无菌外植体；酒精的质量浓度为73%；次氯酸钠溶液的质量浓度为1.3%；无菌水清洗次数为5次；放入铺有滤纸的培养皿中待用；

将体视镜置于超净台中，在体视镜下剥去无菌外植体外层叶片后，在体视镜下用解剖刀切取长度为0.5mm的茎尖；

将茎尖接种到液体培养基中，然后置于培养箱中进行初代培养15天；培养箱的培养条件为：光照强度2000Lux，24小时之内的16小时的40±0.5℃光照和8小时的30±0.5℃黑暗组成；其中40±0.5℃处理用于钝化病毒；

茎尖和培养后茎尖外观照片如图1所示；

将获得的培养后茎尖转移至含有MS固体培养基的三角瓶内，培养至分化出丛生芽和根；培养条件为：光照强度2000Lux，24小时之内的16小时的25±0.5℃光照和8小时的25±0.5℃黑暗组成；获得的再生草莓苗外观照片如图2所示。

实施例2

方法同实施例1，不同点在于：

（1）MT液体培养基溶液中蔗糖的质量浓度为8%；

（2）剪取4cm的草莓匍匐茎顶芽；

（3）将外植体先用酒精消毒20s，再用次氯酸钠溶液消毒15min，然后用无菌水清洗，获得无菌外植体；酒精的质量浓度为75%；次氯酸钠溶液的质量浓度为1.5%；无菌水清洗次数为4次；

（4）切取长度为0.4mm的茎尖；

（5）置于培养箱中进行初代培养2周；培养箱的光照强度1600Lux；

（6）培养至分化出丛生芽和根时培养箱的光照强度1600Lux。

实施例3

方法同实施例1，不同点在于：

（1）MT液体培养基溶液中蔗糖的质量浓度为7.5%；

（2）剪取6cm的草莓匍匐茎顶芽；

（3）将外植体先用酒精消毒30s，再用次氯酸钠溶液消毒25min，然后用无菌水清洗，获得无菌外植体；酒精的质量浓度为70%；次氯酸钠溶液的质量浓度为1%；无菌水清洗次数为4次；

（4）切取长度为0.3mm的茎尖；

（5）置于培养箱中进行初代培养3周；培养箱的光照强度2200Lux；

（6）培养至分化出丛生芽和根时培养箱的光照强度2200Lux。