一种重组卡介苗的冻干制剂及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种重组卡介苗冻干制剂，它含有如下各重量份数的组分：重组卡介菌0.05份、右旋糖苷‑40 1～3份、蔗糖2.5～3.5份、谷氨酸钠0.2～0.5份、氯化钾0.2～0.7份、海藻糖3～4份、吐温‑80 0.005～0.015份。本发明提供的重组卡介苗的冻干制剂活菌数量高、性质稳定，易于保存，作为预防结核病的疫苗具有很好的应用价值。

说明书

技术领域

本发明生物制品领域，具体涉及一种重组卡介苗的冻干制剂及其制备方法和用途。

背景技术

卡介菌是法国科学家Calmette和Guerin将一株来自于患结核病的牛的牛型分枝杆菌在含甘油、马铃薯和牛胆汁的培养基上进行培养分离，历经13 年共231次传代，而得到的牛型分枝杆菌减毒株。以该卡介菌培养得到的卡介菌菌体制得的疫苗：卡介苗(BCG)，能够有效预防结核性脑膜炎和粟粒性结核等儿童重症结核病，降低儿童结核病的死亡率。

然而，研究发现，卡介苗对肺结核的免疫保护力从0％～80％不等，保护效果差异显著，保护力不够理想，但其作为一种疫苗，其免疫原性和安全性已经在长达半个多世纪的使用过程中得到验证。因此，重组卡介苗的研究得到了越来越多的关注，重组卡介苗是依赖于以卡介菌作为受体菌，利用基因工程技术导入目的基因，高量表达目的抗原以诱导对多种疾病的体液免疫和细胞免疫的重组菌制备的疫苗，从而增强免疫原性和保护效力。例如申请号为CN201780089047.1的中国专利申请，公开了一种在BCG日本株中高量表达phoPR的重组卡介菌，显著增强了免疫原性和保护效力，且与亲本菌株有相同的安全性。

卡介苗的稳定性对其临床使用的有效性有重要影响，目前多采用冻干的方来进行卡介苗的保存，例如公告号为CN111588859B的专利，公开了一种用含有右旋糖苷、蔗糖、谷氨酸钠、氯化钾和海藻糖的冻干保护剂和卡介菌为BCG D

为了保障重组卡介苗的稳定性和有效性，研发一种稳定性佳、效力高的重组卡介苗冻干制剂具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组卡介苗的冻干保护剂及其用途。

本发明提供了一种重组卡介苗冻干制剂，它含有如下各重量份数的组分：

重组卡介菌0.05份、右旋糖苷-40 1～3份、蔗糖2.5～3.5份、谷氨酸钠 0.2～0.5份、氯化钾0.2～0.7份、海藻糖3～4份、吐温-80 0.005～0.015份。

进一步地，它含有如下各重量份数的组分：重组卡介菌0.05份、右旋糖苷-40 3份、蔗糖3～3.5份、谷氨酸钠0.2～0.5份、氯化钾0.5份、海藻糖3～3.5 份、吐温-80 0.01份；

优选地，它含有如下各重量份数的组分：重组卡介菌0.05份、右旋糖苷 -40 3份、蔗糖3份、谷氨酸钠0.4份、氯化钾0.5份、海藻糖3.5份、吐温-80 0.01份。

更进一步地，它是重组卡介菌与稳定剂混合冻干而成；

所述稳定剂是含有所述右旋糖苷-40、蔗糖、谷氨酸钠、氯化钾、海藻糖和吐温-80的水溶液，所述水溶液的pH值为7.3～7.5。

更进一步地，上述冻干的工艺如下：

(a)预冻：温度-40～-45℃，维持2～3小时；

(b)升华干燥：温度-20～-10℃，真空压力8～10Pa，干燥12～16小时；

(c)解吸干燥：温度32～35℃，真空压力0.5～10Pa，干燥6～12小时。

更进一步地，上述重组卡介菌是过表达PhoP和PhoR蛋白的卡介菌；优选地，所述过表达PhoP和PhoR蛋白的重组卡介菌是如专利申请号为 CN201780089047.1的专利申请中所述的重组卡介菌。

本发明还提供了上述的重组卡介苗冻干制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)右旋糖苷-40、蔗糖、谷氨酸钠、氯化钾、海藻糖和吐温-80加注射用水配制成溶液，其中右旋糖苷的质量浓度为1～3％；

(2)将重组卡介菌加入步骤(1)的溶液中形成均一溶液，

(3)步骤(2)得到的均一溶液进行冻干，冻干工艺为：在温度-40～-45℃，预冻2～3小时；然后在温度-20～-10℃，真空压力8～10Pa，干燥12～16小时；最后在温度34～36℃，真空压力0.5～10Pa，干燥6～12小时。

进一步地，步骤(1)还包括加碱调节溶液pH至7.3～7.5的步骤；优选地，所述碱是氢氧化钠；

和/或步骤(1)还包括将溶液灭菌的步骤；优选地，所述灭菌是在 115～120℃，0.15～0.20MPa条件下灭菌30～60分钟。

进一步地，步骤(2)所述将重组卡介菌加入步骤(1)的溶液中包括先用步骤(1)的溶液稀释重组卡介菌制备原液，再加入步骤(1)的溶液稀释至重组卡介菌质量浓度为0.05％。

进一步地，步骤(3)所述均一溶液灌装在西林瓶中进行冻干。

本发明还提供了上述的重组卡介苗冻干制剂在预防结核病的药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种过表达PhoP和PhoR蛋白的重组卡介菌制备的重组卡介苗冻干制剂，所用的稳定剂能够有效减轻或防止冷冻干燥过程对重组卡介菌造成损害，从而有效保证重组卡介菌活力和生物活性，重组卡介苗活菌数量高、分散性、稳定性好，具有很好的临床应用价值。

本发明的术语：“卡介菌”指减毒牛型分枝杆菌，包括其经培养基培养、传代得到的菌体。

“卡介苗”是由减毒牛型分枝杆菌制成的活菌苗，具有增强巨噬细胞活性，活化T淋巴细胞，增强机体细胞免疫的功能。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明重组卡介菌的来源：重组卡介菌为专利申请201780089047.1公开的重组卡介菌(BCG-Japan/PhoPR)，其原始种子(BCG-3株)从加拿大多伦多大学引进。主种子批和工作种子批由成都安永鼎业生物技术有限公司制备。

实施例1、本发明重组卡介苗冻干制剂的制备

(一)、稳定剂的制备：注射用水中加入如下质量分数的组分：右旋糖苷 -403.0％、蔗糖3.0％、谷氨酸钠0.2％、氯化钾0.5％、海藻糖3.5％、吐温-80 0.01％，然后用10％氢氧化钠溶液调节pH值为7.3～7.5，于116℃、0.16MPa 条件下，灭菌50分钟。

(二)、生产菌种传代

1.工作种子复苏：重组卡介菌工作种子，接种罗氏培养基，于38℃培养 2-3周。

2.传代苏通培养基：罗氏菌种接种于苏通培养基，于适宜温度(38℃)，适宜时间(2-3周)培养。

(三)、原液制备

1.生产菌膜培养：用生产菌种以适宜接种量2次传代苏通培养基，在适宜温度下(38℃)培养适宜时间(8-10天)后，得到苏通培养基菌膜用于原液制备。

2.原液制备：收集培养的菌膜，在低温振荡器上进行研磨；再用稳定剂稀释至一定浓度，即为重组卡介苗原液。

(四)、半成品配制

用稳定剂将原液稀释成浓度为0.5mg/mL，即为重组卡介苗半成品。

(五)、灌装、冻干

1.采用西林瓶包装，灌装量：0.5ml/瓶。

2.冻干

重组卡介苗冻干工艺：

a预冻：最低温度-40-45℃，达到最低温度后维持2～3小时；

b升华干燥：最终温度-20～-10℃，运行时间为12～16小时，真空压力控制在8～10Pa；

c解吸干燥：最终温度32～35℃，真空压力控制在0.5～10Pa，运行6～12小时。

实施例2、重组卡介苗冻干制剂的制备

稳定剂的制备：注射用水中加入如下质量分数的组分：右旋糖苷-40 2.0％、蔗糖3.5％、谷氨酸钠0.4％、氯化钾0.5％、海藻糖3.5％、吐温-80 0.01％，然后用10％氢氧化钠溶液调节pH值为7.3～7.5，于116℃、0.16MPa条件下，灭菌50分钟。

其余方法步骤同实施例1。

对比例1、

不含吐温的稳定剂的制备：注射用水中加入如下质量分数的组分：右旋糖苷-403.0％、蔗糖3.0％、谷氨酸钠0.2％、氯化钾0.5％、海藻糖3.5％；然后用10％氢氧化钠溶液调节pH值为7.3～7.5，于116℃、0.16MPa条件下，灭菌50分钟。

其余方法步骤同实施例1。

对比例2、

注射用水中加入如下质量分数的组分：右旋糖苷-40 2.0％、蔗糖5.5％、谷氨酸钠0.2％、氯化钾0.5％、海藻糖2.0％；然后用10％氢氧化钠溶液调节 pH值为7.3～7.5，于116℃、0.16MPa条件下，灭菌50分钟。

其余方法步骤同实施例1。

对比例3、

注射用水中加入如下质量分数的组分：右旋糖苷-40 1.0％、蔗糖6.5％、谷氨酸钠0.2％、氯化钾0.5％、海藻糖2.0％；然后用10％氢氧化钠溶液调节 pH值为7.3～7.5，于116℃、0.16MPa条件下，灭菌50分钟。

其余方法步骤同实施例1。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、本发明制剂的质量评价

对实施例和对比例制剂冻干前后的活菌数、物理外观和水分、热稳定性等性能进行了评价和比较，结果如表1所示。

表1

从表中的结果可以看出，添加本发明特定组成的稳定剂的重组卡介苗冻干制剂(实施例1、2)冻干后活菌率达到15-25％，成品活菌数不低于 30×10

上述结果证明，只有在本发明特定的稳定剂组分和用量下，才能够制得分散效果好、活菌数量高、性质稳定、易于保存的重组卡介苗冻干制剂。

综上，本发明提供了一种重组卡介苗的冻干制剂，该制剂活菌数量高、性质稳定，易于保存，作为预防结核病的疫苗具有很好的应用价值。