一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法

摘要

本发明公开了一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法，首先设计一系列不同浓度梯度的percoll悬液初步将正常密度中性粒细胞及低密度中性粒细胞分离开后，再结合磁珠分选以达到纯化正常密度中性粒细胞和低密度中性粒细胞目的，本发明首次在蜕膜组织中进行不同密度中性粒细胞的分离，快速将蜕膜中的低密度中性粒细胞和正常密度中性粒细胞进行分离纯化，便于研究不同亚群中性粒细胞在早期胚胎发育中的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体是一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法。

背景技术

中性粒细胞是先天免疫系统重要组成部分，约占人类循环白细胞的70％，通过吞噬、产生活性氧、脱颗粒释放杀菌酶以及中性粒细胞胞外诱捕网形成等过程杀灭病原体。在母胎界面，中性粒细胞可以在妊娠前三个月的蜕膜中检测到，妊娠中期逐渐增加。目前有证据证明中性粒细胞有助于受精卵形成和胚胎植入，蜕膜中性粒细胞是妊娠早期和中期组织重塑和胎盘血管形成的关键因素，如异常活化就可能产生很多妊娠并发症，如胚胎种植失败、流产、妊娠期高血压疾病等等。

低密度中性粒细胞，密度低于正常中性粒细胞，具有正常密度中性粒细胞的表型，外周血在密度梯度离心后发现存在于单个核细胞密度层(PBMC)中，是一类异质性很强的细胞。目前对此类细胞的功能也存在争议，部分研究认为低密度中性粒细胞更易活化，可释放更多的炎性细胞因子(TNF-α、INF-γ等)，发挥促炎作用，但另一部分研究确认为这类细胞可抑制T细胞、NK细胞等活性，诱导调节性T细胞生成等发挥免疫抑制作用。

既往文献报道正常密度中性粒细胞及低密度中性粒细胞在早孕期蜕膜就已存在，随着孕周增加，蜕膜免疫细胞中中性粒细胞的含量逐渐增多，但不同中性粒细胞亚群其表面标志物及其作用与外周血中性粒细胞之间是否存在差异尚不清楚，在妊娠中是通过何种方式发挥作用目前也不清楚，通过何种机制导致妊娠并发症也不清楚。故如何成功分离蜕膜中的低密度粒中性细胞及正常密度中性粒细胞，对于我们研究不同密度的中性粒细胞在早期胚胎发育中的行为至关重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法，以至少达到快速分离蜕膜中低密度及正常密度中性粒细胞，以研究不同亚群中性粒细胞在早期胚胎发育中的作用的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法，包括以下步骤：

S1：在术中收集蜕膜组织，在无菌环境下取出蜕膜组织置于添加青链霉素的DMEM高糖培养基中保存；

S2：将所述蜕膜组织置于容器内，使用无菌PBS或生理盐水进行洗涤至所述蜕膜组织无血液残留；

S3：

S31：向所述容器内的蜕膜组织中加入PBS或生理盐水，其后用剪刀将所述蜕膜组织剪碎，其后进行离心处理，并弃上清，得组织碎块；

S32：将所述组织碎块转移至无菌离心管中，并加入含有终浓度为1mg/ml胶原酶Ⅳ和150U/ml DNaseⅠ的DMEM无血清培养基内，其后在37℃水浴震荡条件下消化1h得到细胞悬液；

S33：将所述细胞悬液经细胞筛过滤，其后进行离心处理，并弃上清，得到细胞沉淀A；

S34：若所述细胞沉淀A肉眼可见呈红色，则向所述细胞沉淀A中加入3ml红细胞裂解液吹打，其后置于4℃条件下静置，静置期间吹打混匀两次，其后进行离心处理，并弃上清，得到沉淀细胞B；

S35：使用PBS清洗沉淀细胞B，随后将所述沉淀细胞B置于DMEM培养基中，得到DMEM培养基细胞悬液；

S4：吸管取2ml浓度为60％的Percoll悬液置于离心管的底部，随后取2ml浓度为40％的Percoll悬液铺于浓度为60％的Percoll悬液之上；其后再取2ml浓度为20％的Percoll悬液铺于浓度为40％的Percoll悬液之上；最后取2ml所述DMEM培养基细胞悬液铺于浓度为20％的Percoll悬液之上；

S5：

S51：将所述离心管进行离心操作，吸取位于40％及60％的percoll悬液中的细胞，并移液至新的离心管A中，其后用PBS进行清洗；

S52：将所述离心管内剩余的液体完全吸取，并向所述离心管内添加1ml PBS吹打所述离心管底的细胞沉淀，其后将所述离心管内的细胞悬液转移至新的离心管B中，并用PBS将所述离心管B中液体定容至10ml，其后将所述离心管B进行离心处理，并弃上清，向得到的沉淀中加入1ml含有FBS和青链霉素的完全DMEM培养基重悬细胞，冷藏备用；所述DMEM培养基中含常规工作浓度的青链霉素及10％FBS；

S6：

S61：将所述离心管A中的细胞采用CD14磁珠阴性分选，其后再采用CD15磁珠阳性分选，得到纯化蜕膜低密度中性粒细胞；

S62：将所述离心管B中的细胞采用CD14磁珠阴性分选，再采用CD15磁珠阳性分选，得到纯化蜕膜正常密度中性粒细胞。

进一步的，步骤S3中第一次离心条件为4℃下1700rpm离心6min，离心机升降速均为9；第二次离心条件为4℃下1700rpm离心8min，离心机升降速均为9。

进一步的，步骤S1中，将所述蜕膜组织剪碎至体积为1mm

进一步的，步骤S33中细胞筛过滤时，依次按100μm、70μm、40μm的顺序经细胞筛过滤。

进一步的，步骤S34中离心条件为4℃下1700rpm离心6min，离心机升降速均为9。

进一步的，步骤S51中离心条件为25℃下2500rpm离心20min，调节离心机升速4降速3。

进一步的，步骤S52中离心条件为4℃下1700rpm离心6min，离心机升降速均为9。

本发明的有益效果是：本发明经过对Percoll悬液浓度梯度的设计，使得不同梯度的Percoll悬液配合不同组合离心条件将蜕膜中的低密度中性粒细胞和正常密度中性粒细胞进行分离(100％、60％、40％、20％的Percoll悬液密度分别为1.1294g/ml、1.077g/ml、1.056g/ml、1.031g/ml；中性粒细胞密度为1.080-1.085g/ml，单个核细胞的密度为1.056-1.077g/ml，蜕膜基质细胞及滋养细胞密度低于1.056g/ml)，再进一步结合磁珠筛选，即可达到分离蜕膜中的低密度中性粒细胞和正常密度中性粒细胞的目的，且步骤简单。传统percoll非连续密度梯度离心法仅能在外周血中提纯正常密度中性粒细胞，无法提纯低密度中性粒细胞；因组织中细胞类型多且复杂，如果仅以percoll非连续密度梯度离心法分离得到的细胞组分为同一密度间的多种细胞的混合物，无法达到分离提纯的目的。在上述有益效果的基础上，本发明的分离方法获得的两种中性粒细胞以CD15+CD14-标记，流式细胞术鉴定的结果，纯度可以稳定在95％以上；用激光共聚焦显微镜检测也可见不同密度中性粒细胞细胞核的形态，证明分离办法准确可行。

附图说明

图1为不同浓度的Percoll悬液在离心管中的分层示意图；

图2为装有不同浓度的Percoll悬液的离心管离心蜕膜细胞后的分层示意图；

图3为流式细胞术鉴定分离纯度结果图；

图4为不同密度中性粒细胞DAPI染色后激光共聚焦显微镜成像图。

具体实施方式

下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例

一种分离蜕膜低密度中性粒细胞及正常密度中性粒细胞的方法，包括以下步骤：

S1：在术中使用无菌人流瓶收集蜕膜组织，在无菌环境下取出蜕膜组织置于添加青霉素的DMEM高糖培养基中保存，并快速带回实验室进行分离；

S2：在实验室中，将所述DMEM高糖培养基中的蜕膜组织置于无菌烧杯中内，使用无菌PBS或生理盐水进行洗涤至所述虹膜组织无明显血液残留；

S3：

S31：向所述烧杯内的蜕膜组织中加入少量PBS或生理盐水，其后用无菌剪刀将所述蜕膜组织剪碎至1mm

S32：将所述组织碎块转移至离心管中，并加入含有终浓度为1mg/ml胶原酶Ⅳ和150U/ml DNaseⅠ的DMEM无血清培养基内(DMEM无血清培养基体积为组织碎块体积的3-4倍)，其后在37℃水浴震荡条件下消化1h得到细胞悬液；

S33：将所述细胞悬液按100μm、70μm、40μm的顺序进行细胞筛过滤，其后进行离心处理，并弃上清，得到细胞沉淀A；所述离心处理为在4℃下1700rpm离心8min，离心机升降速均为9；

S34：若所述细胞沉淀A肉眼可见呈红色，则向所述重悬细胞中加入3ml红细胞裂解液吹打，其后置于4℃条件下静置15min，静置期间吹打混匀两次，其后进行离心处理，并弃上清，得到沉淀细胞B；所述离心处理为在4℃下1700rpm离心6min，升降速均为9；

S35：使用PBS清洗沉淀细胞B1-2次，随后将所述沉淀细胞置于2ml DMEM培养基中，得到DMEM培养基细胞悬液；

S4：使用巴氏吸管取复温至室温的2ml浓度为60％的Percoll悬液置于离心管的底部，随后取2ml浓度为40％的Percoll悬液铺于浓度为60％的Percoll悬液之上；其后再取2ml浓度为20％的Percoll悬液铺于浓度为40％的Percoll悬液之上；最后取2ml所述DMEM培养基细胞悬液铺于浓度为20％的Percoll悬液之上；因Percoll溶液无色，应倾斜离心管，沿着管壁缓慢、轻柔加入不同浓度的Percoll梯度溶液；

S5：

S51：将所述离心管进行离心操作，离心后离心管内自上至下的分层为培养基层、细胞层、20％Percoll悬液、细胞层(蜕膜基质细胞及滋养细胞)、40％Percoll悬液、细胞层(蜕膜免疫细胞)、60％Percoll悬液及管底细胞沉淀；吸取位于40％及60％的percoll悬液中的细胞沉淀(蜕膜免疫细胞(DICs)，蜕膜低密度中性粒细胞所在层)，并移液至新的离心管A中，其后用PBS进行清洗2次；所述离心操作为在25℃下2500rpm离心20min，调节离心机升速4降速3；

S52：将所述离心管内剩余的液体完全吸取，并向所述离心管内添加1ml PBS吹打所述离心管底的细胞(正常密度中性粒细胞所在层)，其后将所述离心管内的细胞悬液转移至新的离心管B中，并用PBS将所述离心管B中液体定容至10ml，其后将所述离心管B进行离心处理，并弃上清，向得到的沉淀中加入1ml含有FBS和青链霉素的完全DMEM培养基重悬细胞，置入4°冰箱备用；所述DMEM培养基含常规工作浓度的青链霉素及10％FBS；所述离心操作为在4℃下1700rpm离心6min，离心机升降速均为9。；

S6：

S61：将所述离心管A中的细胞采用CD14磁珠阴性分选，其后再采用CD15磁珠阳性分选，得到纯化蜕膜低密度中性粒细胞；

S62：将所述离心管B中的细胞采用CD14磁珠阴性分选，再采用CD15磁珠阳性分选，得到纯化蜕膜正常密度中性粒细胞。

用流式细胞术鉴定本发明对不同密度中性粒细胞的分离纯度，取适量分离纯化的蜕膜低密度中性粒细胞及蜕膜正常密度中性粒细胞，设空白对照组，加入1ml StainBuffer重悬细胞，1700rpm离心8min，倒去上清，加入CD14和CD15流式抗体各5μl，震荡混匀，空白管不加抗体，4℃避光孵育30min，加入1ml Stain Buffer重悬细胞，1700rpm离心8min，倒去上清，加入200μl Stain Buffer震荡混匀、重悬细胞，上机检测，检测结果见图3。

以CD15+CD14-标记中性粒细胞，由图3可见，蜕膜低密度中性粒细胞及蜕膜正常密度中性粒细胞纯度均可稳定在95％以上。

将本发明分离纯化的不同密度中性粒细胞固定后DAPI染色后激光共聚焦显微镜成像(见图4)，可见蜕膜低密度中性粒细胞核成棒状、杆状或者幼稚核型，而蜕膜正常密度中性粒细胞核较低密度中性粒细胞成熟，可见分叶状核。

实施例中使用的不同浓度Percoll悬液配制数据如表1所示；所述胶原酶Ⅳ需要现配现用，需要在超净台内配制，在冰上进行操作，所述胶原酶Ⅳ终浓度1mg/ml，由15mg胶原酶粉剂和15mL DMEM组成；DNase I溶液同样需要在超净台内配制，在冰上进行操作，配制为2000U/mL母液，分装至EP管中，-20℃存放，使用时稀释至150U/mL，所述母液由0.25mg的DNaseI和1mL的0.15M NaCl组成，实施例中使用的药品或仪器的厂家/型号如表2所示。

表1：

表2：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。