一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库

摘要

本申请涉及抗体库构建技术领域，尤其涉及一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库，所述方法包括：以CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板，进行第一扩增，分别得到CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；将目的基因片段与第一载体连接，得到第二载体；将所述第二载体进行培养后筛选，得到含有纳米抗体库的目标载体，其中，所述目的基因片段的碱基序列连接关系包括：FR1‑CDR1‑FR2‑CDR2‑FR3‑CDR3‑FR4。通过FR1、FR2、FR3和FR4的抗体骨架与合成部分CDR区域，构建半合成的纳米抗体库，避免了现有纳米抗体需要通过抗原免疫接种获得，可用抗原直接筛选，快速获得人源纳米抗体，节省了成本和时间。

说明书

技术领域

本申请涉及抗体库构建技术领域，尤其涉及一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库。

背景技术

特异性免疫应答是指某一特定抗原刺激可以从免疫系统淋巴细胞库中选择出相应的T细胞或B细胞克隆的反应，淋巴细胞与相应抗原的结合具有高度的特异性；多样性是指T细胞库或B细胞库呈高度的异质性，是许许多多特异性识别抗原细胞克隆的总和，赋予机体具有识别周围环境中数量极大的抗原种类并与之发生反应的能力。B细胞通过V、D、J基因的重排，产生大量的免疫球蛋白基因。体细胞高频突变和类别转换可以进一步增加抗体多样性。每个B淋巴细胞表达一种有功能的重链和轻链，成熟的抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接而成，抗体重链和轻链可变区形成一个抗原结合位点，每个抗体包含两个抗原识别位点。

相对于传统四聚体抗体由两条重链和两条轻链组成的四聚体，骆驼科动物中存在一种由两条链构成的重链抗体，纳米抗体，一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，是一种约115个氨基酸左右的支架蛋白。纳米抗体虽然分子量较小，但其仍然保留了特异性、高亲和力识别抗原的能力。纳米抗体几乎可以识别传统抗体识别的抗原，如蛋白配体、激素、小分子药物和毒素分子等，对于受到结构影响，传统抗体不能识别的隐藏表位，纳米抗体表现出独特的优势。

相对于常规抗体，纳米抗体具有许多独特的优点：(1)分子量约为15kDa，这比传统抗体(～150kDa)及其Fab(～50kDa)和单链抗体(～25kDa)要小得多；(2)可溶性好，通常具有更高的热稳定性，可在细菌宿主中大量表达；(3)由于与人类3型VH结构域(VH3)的氨基酸序列高度同源，具有较高的人源化程度，降低了人类的反应原性；(4)由于其较小的尺寸和对凹形表位的偏好，可以结合常规抗体难以结合的位置。纳米抗体是通常由骆驼免疫产生，然后分离外周血淋巴细胞，扩增抗体的可变区，构建噬菌体展示免疫抗体文库。通过免疫动物构建的抗体库，由于抗体基因来源于体内，经过了抗体亲和力成熟过程，可以获得高亲和力的抗体。

免疫接种是一个耗时的过程，大型动物的饲养也需要昂贵的维护费用。纳米抗体亦可来源于未免疫的动物，相对免疫库，采用未免疫来源的B淋巴细胞构建的天然库，缺少体内的亲和力成熟过程，抗体亲和力相对较低。天然库未经过免疫，可以用于各种类型的抗原筛选，是快速和经济的抗体筛选方案。

发明内容

本申请提供了一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库，以解决现有纳米抗体需要通过抗原免疫接种获得的技术问题。

第一方面，本申请提供了一种半合成纳米抗体库构建方法，所述方法包括以下步骤：

分别得到CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板；

分别得到FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列；

以CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板，进行第一扩增，分别得到CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；

将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；

将目的基因片段与第一载体连接，得到含有所述目的基因片段的第二载体；

将所述第二载体进行培养，以使所述目的基因片段表达为纳米抗体，后筛选，得到含有纳米抗体库的目标载体，其中，所述目的基因片段的碱基序列连接关系包括：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

可选的，所述第一扩增用的第一引物包括：第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对包括第一上游引物F1和第一下游引物R1，用于扩增CDR1；所述第二引物对包括第一上游引物F2和第一下游引物R2，用于扩增CDR2；所述第三引物对包括第一上游引物F3和第一下游引物R3，用于扩增CDR3，F1、R1、F2、R2、F3和R3的碱基序列依次如SE.Q IDNO：1-SEQ ID NO：6所示。

可选的，FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：10所示。

可选的，FR1、FR2、FR3和FR4的对应的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：11-SEQ IDNO：14所示。

可选的，所述第二扩增用的引物包括：第三引物对和/或第四引物对。

可选的，所述第三引物对包括F4和NNNR1，所述F4和NNNR1的碱基序列依次如SEQID NO：15-SEQ ID NO：16所示。

可选的，第四引物对包括F4’和NNNR2，所述F4’和NNNR2的碱基序列依次如SEQ IDNO：17-SEQ ID NO：18所示。

可选的，所述初始载体包括噬菌体。

可选的，所述目标载体保存于保存在宿主菌。

本申请第二方面，提供了第一方面所述的方法得到的纳米抗体库，所述纳米抗体库包括多种高亲和性人源的纳米抗体。

本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本申请实施例提供的该方法，分别得到第一扩增后的CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；将目的基因片段与初始载体连接，得到含有纳米抗体库的目标载体，所述纳米抗体库中的纳米抗体由所述目的基因片段表达而来，所述目的基因片段的碱基序列连接关系包括：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。通过FR1、FR2、FR3和FR4的抗体骨架与合成部分CDR区域，构建半合成的纳米抗体库，避免了现有纳米抗体需要通过抗原免疫接种获得，可以用抗原直接在纳米抗体库中进行筛选，可以快速获得亲和性较高的人源纳米抗体，节省了成本和时间，提高了效率。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的一种半合成纳米抗体库构建方法的流程示意图；

图2为本申请实施例提供的抗体基因CDR1区域扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本申请实施例提供的抗体基因CDR2区域扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图；

图4为本申请实施例提供的抗体基因CDR3区域扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图；

图5为本申请实施例提供的抗体基因CDR3延长12bp的扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图；

图6为本申请实施例提供的人源纳米抗体拼接的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的碱基序列得到的琼脂糖凝胶电泳图；

图7为本申请实施例提供的不同稀释度的含有噬菌体的大肠杆菌培养情况；

图8为本申请实施例提供的不同抗原筛选后的含有人源纳米抗体的噬菌体均能识别对应抗原示意图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。例如，室温可以是指10～35℃区间内的温度。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种半合成纳米抗体库构建方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤：

S1.分别得到CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板；

S2.分别得到FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列；

S3.以CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板，进行第一扩增，分别得到CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；

S4.将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；

S5.将目的基因片段与第一载体连接，得到含有所述目的基因片段的第二载体；

S6.将所述第二载体进行培养，以使所述目的基因片段表达为纳米抗体，后筛选，得到含有纳米抗体库的目标载体，其中，所述目的基因片段的碱基序列连接关系包括：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

具体地，筛选包括但不限于：筛选-淘选-检测，可以用抗原进行筛选。

本申请实施例的方法中，步骤的顺序关系不是恒定不变的，只有进行相应操作时，具有了该操作的原材料即可，如S1、S2、S3和S4的步骤关系可以为：S2、S1、S3和S4，还可以为：S1、S3、S2和S4，这里不进行穷举，依次原理进行即可。

整体地，抗体的目的基因片段全部或者部分来源于基因合成，抗体基因的多样性不受淋巴细胞数量限制，便于构建超大容量的抗体库，用于筛选高亲和力抗体；人的抗体重链CDR3的长度短于羊驼的CDR3，可以通过增加人抗体的CDR3长度，构建半合成的纳米抗体库，该抗体库的容量为约为1.88x10

在一些实施方式中，所述第一扩增用的第一引物包括：第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对包括第一上游引物F1和第一下游引物R1，用于扩增CDR1；所述第二引物对包括第一上游引物F2和第一下游引物R2，用于扩增CDR2；所述第三引物对包括第一上游引物F3和第一下游引物R3，用于扩增CDR3，F1、R1、F2、R2、F3和R3的碱基序列依次如SE.Q ID NO：1-SEQ ID NO：6所示。

在一些实施方式中，FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：7-SEQ IDNO：10所示。

在一些实施方式中，FR1、FR2、FR3和FR4的对应的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：14所示。

具体地，对抗体基因关键位点进行定点突变，获得了结构稳定的抗体骨架，即FR1、FR2、FR3和FR4，具有抗高温，较佳的适配性，以此抗体骨架为基础，通过移植部分人源抗体的CDR区，可以在大肠杆菌中大量表达的，得到了高度人源化的纳米抗体。

在一些实施方式中，所述第二扩增用的引物包括：第三引物对和/或第四引物对。

具体地，每个密码子有每个NNN密码子的反向序列，每个密码子包含一个“NNN”密码子，如丙氨酸＝GCT；半胱氨酸＝TGC；天冬氨酸＝GAT；谷氨酸＝GAA；苯丙氨酸＝TTC；甘氨酸＝GGC；组氨酸＝CAT；异亮氨酸＝ATC；赖氨酸＝AAG；亮氨酸＝CTG；蛋氨酸＝ATG；天冬酰胺＝AAC；脯氨酸＝CCG；谷氨酰月安＝CAG；精氨酸＝CGT；丝氨酸＝TCT；苏氨酸＝ACC；缬氨酸＝GTG；酪氨酸＝TAC。

因此，用第四引物对，即第三引物的关联序列，可以得到更多的扩增产物。

在一些实施方式中，所述第三引物对包括F4和NNNR1，所述F4和NNNR1的碱基序列依次如SEQ ID NO：15-SEQ ID NO：16所示。

具体地，碱基序列如下：NNNR1：

在一些实施方式中，第四引物对包括F4’和NNNR2，所述F4’和NNNR2的碱基序列依次如SEQ ID NO：17-SEQ ID NO：18所示。

具体地，碱基序列如下：F4’：TACGATGTCATTGCGAGTCACGTA

NNNR2：

F4：AGATCAGTGACACTGAGTCGTCGG

第二扩增包括两次扩增的原因在于：密码子包括正向和反向序列，分别用正向序列和反向序列进行扩增，可以得到更加全面和丰富的产品。

在一些实施方式中，所述初始载体包括噬菌体。

具体地，噬菌体(phage)是侵袭细菌的病毒，也是赋予宿主菌生物学性状的遗传物质，是分子生物学研究的常用工具，噬菌体必须在活菌内寄生，有严格的宿主特异性，其取决于噬菌体吸附器官和受体菌表面受体的分子结构和互补性

在一些实施方式中，所述目标载体保存于保存在宿主菌。

具体地，宿主菌包括但不限于大肠杆菌。

下面将结合实施例、对比例及实验数据对本发明的方法进行详细说明。

实施例1

本申请实施例提供了一种半合成纳米抗体库构建方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤：

S1.分别得到CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板；

S2.分别得到FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列；

S3.以CDR1、CDR2和CDR3的cDNA为模板，进行第一扩增，分别得到CDR1、CDR2和CDR3的碱基序列；

S4.将FR1、FR2、FR3和FR4的核苷酸序列与所述CDR1、所述CDR2和所述CDR3的碱基序列连接，并进行第二扩增，得到目的基因片段；

S5.将目的基因片段与第一载体连接，得到含有所述目的基因片段的第二载体；

S6.将所述第二载体进行培养，以使所述目的基因片段表达为纳米抗体，后筛选，得到含有纳米抗体库的目标载体，其中，所述目的基因片段的碱基序列连接关系包括：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

具体如下：

1)扩增CDR1、CDR2和CDR3的片段并连接得到目的基因片段。

用引物F1/R1扩增天然人源抗体库(本实验室保存)CDR1，得到片段1(如图2，大小150bp左右)，用引物F2/R2扩增天然人源抗体库CDR2，得到片段2(如图3，大小200bp左右)，用引物F3/R3扩增天然人源抗体库CDR3，得到片段3(如图4，大小150bp左右)，

CDR1、CDR2和CDR3用的扩增体系：模板加0.5ul，引物各0.5ul，taq酶10xbuffer5ul，dntp 4ul，pfu酶0.5ul，加水到50ul；反应条件94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s扩增25个循环；将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，并切下目的片段，用天根胶回收柱回收目的片段扩增产物。

CDR1、CDR2和CDR3具体序列内容如下表所示，有6组。

扩增片段3用mlyi酶切，用天根回收试剂盒回收酶切产物，将10pmol的NNNR1混合(A＝3％，D＝6％，E＝3％，F＝3％，G＝15％，H＝2％，I＝3％，K＝3％，L＝4％，N＝3％，P＝3％，Q＝3％，R＝6％，S＝15％，T＝3％，V＝3％，W＝4％，Y＝18％)连接到3.3pmol的酶切好的片段3上，反应体积为20μl。将连接产物1000稀释，使用引物F4/R3和高保真聚合酶(Pfu)100μ1PCR扩增。使用天根DNA纯化试剂盒对PCR产物进行回收。将得到的DNA重悬在30μl的水中，取25μl产物，用10个单位的快速消化MlyI在50μl的反应体积中消化，然后热灭活。然后使用下一组引物(周期2的NNNR2引物等，即序列NNNR3和F5，NNNR3的序列为NNN(RC)AGATGGACTCCCTAAGTGCCTGTTTTTTAACAGGCACTTAGGGA

GTCCATCTNNN；F5的碱基序列为TAACAGGCACTTAGGGAGTCCATCT)重复该过程，除了在连接阶段，来自前一个周期的5μl的mlyi限制性DNA(估计为3.3pmol的DNA)取代了之前的受体。一直拼接添加4个长度的氨基酸(如图5，大小150bp左右)，然后将添加好4个长度的片段分别连接片段1和片段2(如图6，大小400bp左右)，使用高保真聚合酶(Pfu)100μlPCR扩增，将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，并切下目的片段，用天根胶回收柱回收目的片段扩增产物备用。

2)用Sfi I和Not I双酶切pCANTAB5E载体和目标抗体基因。

用1.5％的琼脂糖胶切上述得到的目的基因片段扩增产物，用天根DNA回收试剂盒回收目的片段，分装后于-20℃冻存待用；配制反应体系，将抗体基因连入酶切后的pCANTAB5E载体。按下列体系配制连接体系：载体1.5ug，抗体0.5ug，T4连接酶2μL，10xbuffer 10μL，加水至100μL，在PCR仪上16℃连接过夜。

TG1划线接种到Minimal培养板37℃培养过夜；接种TG1单菌落至5mL2YT培养液中于37℃振荡培养过夜；次日将接种过夜培养的菌液5mL加至300mL的2YT培养液中，振荡培养至OD600达到0.4-0.5。将菌液冰浴30min后，在预冷的离心机中于4℃以4000g离心15min；用300mL预冷的灭菌去离子水于冰水中轻柔重悬沉淀，至沉淀细胞完全均匀地分散于水中；在预冷的离心机中于4℃以4 000g离心15min；再依次用150mL预冷的灭菌去离子水和30mL预冷的10％的甘油(用灭菌去离子水配制)如上所述重悬细胞两次；最后将细胞重悬于1mL预冷的10％的甘油中，置于冰上立即使用或分装；冻存于-80℃中待用；向100uL感受态中加入5uL连接产物，放于冰上预冷，转入预冷后的电转杯中；调节电转仪电压2.5KV电击时间5ms，电击后，迅速加入0.9ml 2YT培养基，37℃振荡培养2小时；取10uL梯度稀释，涂布于SOBAG平板上，计算库容，剩余菌液涂布于10个SOBAG平板上，37℃培养过夜。

对梯度稀释的菌落计数，计算出本次建成的抗体库的库容；从SOBAG平板上随机挑取20个克隆，用菌落PCR检测抗体基因插入载体的效率；将随机挑选的20个克隆送测序分析，检测抗体库容，抗体基因的完整性及多样性。

实施例2拯救噬菌体表面展示纳米抗体库

将实施例1构建好的纳米抗体库以噬菌粒的形式保存在宿主菌中，在淘选过程开始前，应当先拯救文库，使其成为噬菌体展示的纳米抗体库。具体方法如下：

纳米抗体库库容测定：电转后的大肠杆菌，复苏一小时后，取20μL依次稀释到180μL 2YT培养基中，获得10

实施例3抗体筛选

1)利用His Bind Resin结合抗原蛋白，从实施例2得到噬菌体展示的纳米抗体库中淘选抗体，具体过程如下：活化His Bind Resin：取200μL His Bind Resin于1.5mL离心管中，1000g离心1min，去掉保存溶液；加入200μL的ddH

2)淘选识别目的蛋白的纳米抗体

取纯化后的PG1蛋白35μL(约10μg)，加入165μL PBS中，混匀后加入装有活化后的树脂的EP管中，旋转混匀1h，1000g离心1min，去掉上清；加入200μL漂洗缓冲液，重悬树脂，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复一次。取拯救后的噬菌体展示抗体库溶液300μL，加入0.3μL Triton X-100，用微量移液器轻轻混匀；加入40μL未活化的树脂，轻微旋转反应1h；1000g离心1min，取上清加入40μL已包被抗原蛋白的树脂，轻微旋转反应2h；1000g离心1min，去掉上清；加入500μL漂洗缓冲液(含0.1％Triton X-100)，重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复5次；加入500uL漂洗缓冲液含(0.1％Tween-20)，重悬树脂，轻微振荡漂洗5min，1000g离心1min，去掉上清，此步骤重复5次；最后一次漂洗后，将树脂转移到新的EP管中，1000g离心1min，去掉上清；加入200μL洗脱缓冲液，轻微旋转洗脱20min；1000g离心1min，取上清，加入5mL TG1菌液中，37℃感染1h；将感染的菌液涂布SOBAG平板，30℃倒置培养过夜；次日，用2YT-AG培养基刮下平板上的菌落，并拯救成噬菌体进行下一轮淘选。

3)淘选后phage检测

第三轮淘选后感染TG1，复苏一小时后，取10μL菌接入1ml 2YT-AG培养基，加入M13K07后，更换2YT-AK培养基，37℃培养过夜；10000rpm 10min，取上清备用，将抗原蛋白加入到ELISA板中，4℃包被过夜；倾掉包被液后，以PBS洗3次，4％PBSM(PBS含4％脱脂牛奶)封闭1h；以PBS洗1次后，每孔加入50μL噬菌体培养基上清和50μL 4％PBSM，于37℃反应1h；用PBS和PBST各洗3次后，每孔加入100μL anti-M13/HRP conjugation(以4％PBSM按1∶5000稀释)，37℃保温1h；用PBST和PBS洗涤三次，加入100μL TMB底物溶液，避光反应15min，加入25μL 2mol/L H

选择15个抗原筛选测试抗体库筛选效率，是对实施例2得到抗体库进行筛选，还是用利用His Bind Resin结合抗原蛋白和纯化后的PG1蛋白筛选后的抗体库来进行15个抗原筛选。15个抗原具体为ACTB、EGFR、PD-L1、AFB1、皮素酸、辣椒浆、孔雀石绿、PG1、PG2、PCT、IL-6、CG419MY、SEMA4d、MMP3-134Ay和N，其中，ACTB(cytoplasmic 1)细胞质肌动蛋白1；EGFR(Epidermal growth factor receptor)表皮生长因子受体；PD-L1(Programmed celldeath 1 ligand 1)细胞程序性死亡配体1；AFB1(Aflatoxin B1)黄曲霉毒素B1；PG1(Pepsinogen 1)胃蛋白酶原1；PG2(Pepsinogen 2)胃蛋白酶原2；PCT(Procalcitonin)降钙素原；IL-6(Interleukin-6)白介素6；CG419MY(Lutropin-choriogonadotropic hormonereceptor)绒毛膜促性腺激素受体419位点突变；SEMA4d(Semaphofin-4D)；MMP3-134Ay(Stromelysin-1)基质金属蛋白酶3134位点突变；N为新冠N蛋白抗原。

抗体库验证：建库的抗体库制备噬菌体经三轮筛选结束后，按照实例3制备辅助噬菌体，用ELISA检测抗原，其结果如图8所示，所有抗原筛选后的噬菌体均能识别对应抗原，分别得到低抗原性和高亲和性人源纳米抗体，如MMP3-134Ay抗原得到的高亲和性人源纳米抗体的具体序列如SEQ ID NO19-37所示，该纳米抗体中的氨基酸序列也具有此连接关系：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

附图2-8的详细说明：

如图3所示，为实施例1提供的抗体基因CDR1区域扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图，说明得到了CDR1基因片段。

如图4所示，为实施例1提供的抗体基因CDR2区域扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图，说明得到了CDR2基因片段。

如图4所示，为实施例1提供的抗体基因CDR3区域扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图，说明得到了CDR3基因片段。

如图5所示，为实施例1提供的抗体基因CDR3延长12bp的扩增得到的琼脂糖凝胶电泳图，说明得到了CDR3延长12bp的基因片段。

如图6所示，为实施例1提供的目的基因片段FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的碱基序列得到的琼脂糖凝胶电泳图，说明得到了FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的碱基序列。

如图7所示，为实施例2提供的不同稀释度的含有噬菌体的大肠杆菌培养情况；图中5，6，7，8分别对应10

如图8所示，为实施例2提供的不同抗原筛选后的含有人源纳米抗体的噬菌体均能识别对应抗原示意图，说明不同的抗原通过合成的纳米抗体库可以直接筛选出对应的抗体。

需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 武汉华美生物工程有限公司

<120> 一种半合成纳米抗体库构建方法和纳米抗体库

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agctgctgga gagcggc 47

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggggcctg gcggaaccag ctcat 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagctggt tccgccaggc ccccg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acagtagtac acggcggtgt cctcg 25

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaggacaccg ccgtgtacta ctgtgctgca 30

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcacctgcg gccgcgctgc tcacggtcac ctgggtgccc tgaccccagt a 51

<210> 7

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60

agctgcgccg ccagc 75

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgagctggt tccgccaggc ccccggcaag gagcgtgagt tcgtgagcgc catc 54

<210> 9

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tactacgccg acagcgtgaa gggccgcttc accatcagcc gcgacaacag caagaacacc 60

ctgtacctgc agatgaacaa cctgcgcgcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgt 114

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggggtcagg gcacccaggt gaccgtgagc agc 33

<210> 11

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tactacgccg acagcgtgaa gggccgcttc accatcagcc gcgacaacag caagaacacc 60

ctgtacctgc agatgaacaa cctgcgcgcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgt 114

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ser

1 5 10 15

Ala Ile

<210> 13

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tacgtgactc gcaatgacat cgtattttta cgatgtcatt gcgagtcacg tannn 55

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tacgatgtca ttgcgagtca cgta 24

<210> 17

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccgacgactc agtgtcactg atctttttag atcagtgaca ctgagtcgtc ggnnn 55

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agatcagtga cactgagtcg tcgg 24

<210> 19

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Lys Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Tyr Tyr Pro Tyr Gly Tyr Leu Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Asn Val Glu Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Pro Asn Tyr Asn Tyr Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 21

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Arg Ser Gly Ser Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Ser Tyr Tyr Arg Tyr Asn Ser Tyr Gly Tyr Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Tyr Arg Ser Tyr Arg Arg Pro Ser Pro Tyr Arg Tyr Gly Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Arg Pro Asp Leu Tyr Ser Tyr Gly

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Arg Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Ser Asn Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Arg

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Arg Gly Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Leu Arg Leu Arg Tyr Tyr Arg Leu Arg Tyr Gly Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Arg Phe Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Arg Thr Thr Asn Ser Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Leu Ala Gly Ala Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Asn

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Leu Ser Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ser Gly Arg Leu Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Gly Gly Gly Ser Val Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln

65 70 75 80

Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys His Ala

85 90 95

Leu Ala Arg Arg Thr Ala Leu Arg Asn Pro Asn Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 29

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Leu Arg Gln Ala Asp Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Ser Thr Asp Gly Ser Arg Val His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Tyr Asp Arg Leu Arg Arg Ala Tyr Tyr Gly Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 30

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Pro Arg Phe Asn Val Met

20 25 30

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val Gly Met

35 40 45

Ile Pro Arg Ser Ala Tyr Lys Val Phe Tyr Ala Asp Ser Leu Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

85 90 95

Gly Leu Ser Leu Asn Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Asn Ser Gly Lys Glu Val Asp Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Leu Tyr Pro Ser Tyr Ser Arg Tyr Asp Tyr Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Thr Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Ala Tyr Ser Tyr Arg Arg Tyr Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ile Asn

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Lys Ile Thr Gly Pro Pro Thr Arg Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Asp Arg Tyr Gly Leu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Ser Ile Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Ser Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Gly Leu Asp Arg Ser Gly Asp Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Arg Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Ser Tyr Tyr Leu Arg Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Ser Ser Gly Ser Ile Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Tyr Arg Leu Tyr Arg Asp Tyr Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 37

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Ser Ser Ser Ile Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Tyr Arg Gly Arg Asp Ala Arg Ser Tyr Gly Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120