一种濒危半红树植物莲叶桐愈伤组织的诱导培养基、培养方法及应用

摘要

本发明中公开了一种濒危半红树植物莲叶桐愈伤组织的诱导培养基及其在半红树植物组织培养上的应用。本发明同时公开了一种濒危半红树植物莲叶桐愈伤组织的培养方法及其在半红树植物组织培养上的应用。本发明中的诱导培养基及培养方法可以高效培养半红树植物莲叶桐的愈伤组织，显著提高其愈伤组织培养的存活率，且出愈率高、褐化率低、污染率低，为解决该物种濒危的难题提供了育苗、繁殖的技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及一种濒危半红树植物莲叶桐愈伤组织的诱导培养基、培养方法及应用。

背景技术

莲叶桐是莲叶桐科莲叶桐属的一种半红树植物，常用于防风固沙，是保护海岸重要的组成树种，具有重要的生态防护价值。刘梨萍、吴银生等对莲叶桐树枝和种子成分进行研究分析，发现其中富含木脂素和生物碱等多种抗癌症、肿瘤和白血病等疾病的物质，因此它还有重要的药用价值。但在自然繁殖状态下，野生莲叶桐的繁殖能力极差,存在败育的情况，已经无法正常更替繁衍，人工培育成活率低，在中国范围内临近濒危。

组织培养技术能保持原有品种的固有形状和特性，繁殖速度快。保护现存莲叶桐物种资源的同时利用植物组织培养技术，对莲叶桐的离体器官进行组织培养，是在节省试验材料的同时扩大莲叶桐的繁殖面积和速度相对较快的方法，是实现莲叶桐的开发价值的重要途径。但是由于该植物处于濒危状态，又具有红树植物特殊的特性，传统的植物愈伤组织诱导并不适用于所有植物的愈伤组织培养，目前尚未发现莲叶桐愈伤组织培养的方法。因此，提供一种适合莲叶桐愈伤组织的诱导培养基和培养方法对开展保护和开发物种资源研究具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的传统植物愈伤组织诱导培养基及培养方法不适用于莲叶桐愈伤组织培养，导致莲叶桐愈伤组织培养存活率较低的问题，提供一种濒危半红树植物莲叶桐愈伤组织的诱导培养基、培养方法及应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种濒危半红树植物莲叶桐愈伤组织的诱导培养基，以AA培养基为基础培养基，并添加以下含量组分：0.1～1mg/L 6-BA，0.5mg/LNAA，28g/L蔗糖，6.8g/L琼脂。

优选地，所述AA培养基包含以下含量组分：天冬氨酸266mg/L，谷氨酰胺877mg/L，精氨酸288mg/L。

优选地，所述诱导培养基的pH值为5.8。

本发明同时提供了上述诱导培养基在半红树植物组织培养上的应用。

本发明还提供一种濒危半红树植物莲叶桐愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：

S1、对莲叶桐叶片进行预处理；

S2、将S1中经预处理后的叶片剪去所有叶片边缘、叶片主叶脉及叶片伤口，并剪成方形叶块，制得外植体，再将外植体平铺接种在诱导培养基上；

S3、将S2中接种在诱导培养基上的外植体于温度25～27℃，空气相对湿度70％～80％的光照培养室进行光暗交替培养，获得莲叶桐愈伤组织。

优选地，所述S1中莲叶桐叶片为莲叶桐顶端嫩叶。

优选地，所述S1中对莲叶桐叶片的预处理为：将莲叶桐叶片在流水下冲洗，并浸泡30～60min；然后无菌条件下将叶片置于70％乙醇中浸泡30～45s，无菌水漂洗3次，用0.1％HgCl

进一步优选，所述光暗交替培养为光照12h，黑暗12h，光强强度2000lx。

本发明还提供了上述培养方法在半红树植物组织培养上的应用。

本发明所具有的有益效果：本发明中的诱导培养基及培养方法可以高效培养半红树植物莲叶桐的愈伤组织，显著提高其愈伤组织培养的存活率，且出愈率高、褐化率低、污染率低，为解决该物种濒危的难题提供了育苗、繁殖的技术支持。

附图说明

图1为实施例1中培养14天的莲叶桐愈伤组织图；

图2为实施例2中培养14天的莲叶桐愈伤组织图；

图3为实施例3中培养14天的莲叶桐愈伤组织图；

图4为经实施例1培养后诱导成功的愈伤组织图；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。

基础培养基AA购自Solarbio；莲叶桐叶片采自海南师范大学生态园人工栽培的莲叶桐。

实施例1

(1)制备诱导培养基：按照以下含量组分配置诱导培养基：诱导培养基的具体组成如下：以AA培养基为基础，添加0.1mg/L 6-BA，0.5mg/LNAA，28g/L蔗糖，6.8g/L琼脂；调节pH为5.8。然后在0.1Pa、121℃恒温条件下灭菌20min。

(2)叶片预处理：采摘莲叶桐顶端第2、3片嫩叶，在流水下冲洗，并浸泡30s，去除表面脏物；在无菌条件下将叶片置于70％乙醇浸泡30s，无菌水漂洗3次，然后用0.1％HgCl2溶液消毒15min，无菌水漂洗3次，放入装有无菌滤纸的培养皿中，吸收材料表面的液体。

(3)外植体接种

将预处理后的叶片剪去所有叶片叶缘、叶片主叶脉及浸泡过的伤口，并剪成5mm×5mm的方形叶块，制得外植体。将3个外植体平铺接种于培养瓶中的诱导培养基上。

(4)愈伤组织培养

将上述接种于诱导培养基上的外植体于温度25～27℃，空气相对湿度70％的光照培养室进行光暗交替培养；光照12h，黑暗12h，光强强度2000lx。培养14天的莲叶桐愈伤组织如附图1所示。培养4周后，成功获得莲叶桐愈伤组织，如附图4所示，图中A、B、D为诱导4周后获得的莲叶桐愈伤组织；C为诱导培养前的莲叶桐叶片组织。

实施例2

(1)制备诱导培养基：按照以下含量组分配置诱导培养基：诱导培养基的具体组成如下：以AA培养基为基础，添加1mg/L 6-BA，0.5mg/LNAA，28g/L蔗糖，6.8g/L琼脂；调节pH为5.8。然后在0.1Pa、121℃恒温条件下灭菌20min。

(2)叶片预处理：采摘莲叶桐顶端第2、3片嫩叶，在流水下冲洗，并浸泡60s，去除表面脏物；在无菌条件下将叶片置于70％乙醇浸泡45s，无菌水漂洗3次，然后用0.1％HgCl2溶液消毒16min，无菌水漂洗3次，放入装有无菌滤纸的培养皿中，吸收材料表面的液体。

(3)外植体接种

将预处理后的叶片剪去所有叶片叶缘、叶片主叶脉及浸泡过的伤口，并剪成5mm×5mm的方形叶块，制得外植体。将3个外植体平铺接种于培养瓶中的诱导培养基上。

(4)愈伤组织培养

将上述接种于诱导培养基上的外植体于温度25～27℃，空气相对湿度80％的光照培养室进行光暗交替培养；光照12h，黑暗12h，光强强度2000lx。生长4周，获得莲叶桐愈伤组织，培养14天的莲叶桐愈伤组织如附图2所示。

实施例3

(1)制备诱导培养基：按照以下含量组分配置诱导培养基：诱导培养基的具体组成如下：以AA培养基为基础，添加0.5mg/L 6-BA，0.5mg/LNAA，28g/L蔗糖，6.8g/L琼脂；调节pH为5.8。然后在0.1Pa、121℃恒温条件下灭菌20min。

(2)叶片预处理：采摘莲叶桐顶端第2、3片嫩叶，在流水下冲洗，并浸泡50s，去除表面脏物；在无菌条件下将叶片置于70％乙醇浸泡40s，无菌水漂洗3次，然后用0.1％HgCl2溶液消毒20min，无菌水漂洗3次，放入装有无菌滤纸的培养皿中，吸收材料表面的液体。

(3)外植体接种

将预处理后的叶片剪去所有叶片叶缘、叶片主叶脉及浸泡过的伤口，并剪成5mm×5mm的方形叶块，制得外植体。将3个外植体平铺接种于培养瓶中的诱导培养基上。

(4)愈伤组织培养

将上述接种于诱导培养基上的外植体于温度25～27℃，空气相对湿度76％的光照培养室进行光暗交替培养；光照12h，黑暗12h，光强强度2000lx。生长4周，获得莲叶桐愈伤组织，培养14天的莲叶桐愈伤组织如附图3所示。

实施例4莲叶桐愈伤组织培养对比试验

设置3个实验组，每组为20瓶培养瓶，每瓶培养瓶中接种3个外植体；3个实验组分别按照实施例1-3中的诱导培养基及培养方法进行莲叶桐愈伤组织的诱导培养。

设置1个对照组，共20瓶培养瓶，每瓶培养瓶中接种3个外植体；对照组使用目前常用的植物诱导培养基，具体成分如下：以MS为基础培养基，添加1mg/L 6-BA,0.5mg/L 2,4-D,30g/L蔗糖，8g/L琼脂；调节pH为5.8。并采用目前常规的培养方法对莲叶桐进行愈伤组织的诱导培养。

培养结果具体见表1

表1莲叶桐愈伤组织培养对比试验结果

表1数据显示，相比现有常用的诱导培养基和培养方法，本发明的诱导培养基和培养方法可以有效提高莲叶桐愈伤组织的出愈率，降低其褐化率和污染率，可主要应用在包括莲叶桐在内的红树植物的组织培养中。

本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。