利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法

摘要

本发明公开了利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法，该方法步骤为：(1)将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)培养，得到解淀粉芽孢杆菌二级种子；将重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)培养得到重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子；(2)发酵培养：先将重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子发酵4～8h；再接种解淀粉芽孢杆菌的二级种子，发酵100～150h。本发明的方法，重组谷氨酸棒状杆菌合成的脯氨酸可为解淀粉芽孢杆菌合成脂肽提供前体氨基酸，促进脂肽的合成。两菌株互利共生，促进从厨余垃圾中的淀粉或从蔗糖向脂肽转化。

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法

背景技术

脂肽类是一种优良的生物防治制剂，可替代农药进行生物防治，但其高成本和低产量限制了其在农业上的应用。因此，许多人探究了提高脂肽产量的新策略，例如优化培养基，增加脂肪酸和氨基酸前体的供应，加强相关基因的启动子，调节调控因子，以及利用低劣生物质菜籽饼。厨余垃圾是生物垃圾中比例较大的一种，不合理的处理方法会导致各种问题。应用生物技术将厨余垃圾转化为其他增值产品可进一步提高厨余垃圾的经济和生态效益，如甲烷、氢、有机酸等生物燃料和生物肥料。厨余垃圾中的大分子成分淀粉、蛋白质和脂类可以被微生物进一步消化为更小的分子化合物葡萄糖、氨基酸和脂肪酸，这些小分子化合物正是合成脂肽的前体物质。建立共培养体系是从现有的生物质原料生产所需产品的一种策略。虽然共培养在工业生物技术的应用中占有重要地位，但共培养体系中的多菌株较难平衡。目前，关于利用厨余垃圾合成脂肽类物质的研究较少。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法

本发明的技术方案概述如下：

利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养：

将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)在HM618种子培养基中培养后得到一级种子，再将一级种子转接到新鲜的HM618种子培养基中继续培养，得到解淀粉芽孢杆菌的二级种子；将重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)在BHI种子培养基中培养后得到一级种子，再将一级种子转接到谷氨酸棒状杆菌种子培养基中继续培养，得到重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子；

(2)发酵培养：先将重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子按OD

优选地，发酵培养基由下述成分以g/L计组成：蔗糖100或处理后的厨余垃圾110，(NH

本发明优点：

本发明的方法，重组谷氨酸棒状杆菌合成的脯氨酸可以为解淀粉芽孢杆菌合成脂肽提供前体氨基酸，从而促进脂肽的合成。在两菌株共培养体系中，两菌互利共生，构建了一个从厨余垃圾中的淀粉向脂肽转化，或从蔗糖向脂肽转化的人工混菌体系，实现了厨余垃圾的资源化利用以及脂肽的生产方法。

附图说明

图1为实施例6的方法发酵后的脂肽产量(伊枯草菌素58.59mg/L,丰原素37.11mg/L,表面活性素35.51mg/L)。

图2为实施例7的方法发酵后的脂肽产量(伊枯草菌素67.75mg/L,丰原素39.32mg/L,表面活性素37.25mg/L)。

图3为实施例8的方法发酵后的脂肽产量(伊枯草菌素52.05mg/L,丰原素29.96mg/L,表面活性素31.18mg/L)。

图4为含处理后的厨余垃圾的发酵培养基中，重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子发酵6h，再接种解淀粉芽孢杆菌的二级种子发酵后的脂肽产量(伊枯草菌素4.40mg/L,丰原素10.01mg/L,表面活性素120.03mg/L)。

其中，图4中“amy-”表示含处理后的厨余垃圾。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明：

干燥厨余垃圾粉末的来源：

收集天津大学梅园食堂和菊园食堂的厨余垃圾，混合、灭菌、粉碎和干燥，得到均匀的干燥厨余垃圾粉末。

本发明对厨余垃圾的来源不进行限定，其它来源的厨余垃圾也可以用于本发明。

厨余垃圾预处理方法：

取100g干燥厨余垃圾粉末加水至1L，加淀粉酶(商品)使终含量为(400U·L

本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，优选解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HM-618，保藏编号CGMCC 7097，于2013年01月08日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其它的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)也可以用于本发明。

本发明涉及的重组谷氨酸棒状杆菌优选由谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032按照文献[Zhang J,Qian F,Dong F,Wang Q,Yang J,Jiang Y,YangS.De Novo Engineering of Corynebacterium glutamicum for l-ProlineProduction.ACS Synth Biol.2020,9(7):1897-1906.]构建的，简称ZQJY-2。

原始的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032是于2021.4.28于：http://www.cgmcc.net/购买获得。

实施例1

以下各实施例涉及的HM618种子培养基，成分以g/L计：葡萄糖60，蛋白胨10，酵母粉10，牛肉膏10，NaCl 4，115℃蒸汽灭菌15min。

实施例2

以下各实施例涉及的BHI种子培养基成分以g/L计：脑心浸液肉汤70，115℃蒸汽灭菌15min。

实施例3

以下各实施例涉及的谷氨酸棒状杆菌种子培养基成分以g/L计：脑心浸液肉汤40，蔗糖20，(NH4)

实施例4

发酵培养基由下述成分以g/L计组成：蔗糖100，(NH

实施例5

发酵培养基由下述成分以g/L计组成：处理后的厨余垃圾110，(NH

实施例6

利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法，包括如下步骤：

(1)种子培养：

将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)HM-618，保藏编号CGMCC7097，在HM618种子培养基中，在38℃，转速200rpm，培养20h，得到一级种子，再将一级种子转接到新鲜的HM618种子培养基中，在38℃，转速200rpm，继续培养20h，得到解淀粉芽孢杆菌的二级种子；

将重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)简称ZQJY-2，在BHI种子培养基中在32℃，转速180rpm，培养24h得到一级种子，再将一级种子转接到谷氨酸棒状杆菌种子培养基中，32℃，转速180rpm，继续培养24h，得到重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子；

(2)发酵培养：先将步骤(1)获得的重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子按OD

发酵结束后，将发酵液经过离心、酸沉、真空冷冻干燥、萃取，粗提发酵液中的脂肽，三种脂肽(伊枯草菌素、丰原素和表面活性素)的产量如图1所示。结果表明在菌株C.glutamicum ZQJY-2培养4h后接种解淀粉芽孢杆菌HM618，继续发酵，共培养体系中的总脂肽产量有所提高，达到131.21mg/L，是解淀粉芽孢杆菌菌株HM618纯培养的2.07倍。

(解淀粉芽孢杆菌菌株HM618纯培养：在实施例4的发酵培养基中接种OD

用高效液相色谱系统(HPLC)对脂肽进行定量测定。

测定伊枯草菌素的色谱柱为BETASIL C18反相柱(4.6mm×250mm)，流动相为55％A相和45％B相组成，A相为体积浓度0.035％甲酸水溶液，B相为乙腈，紫外检测波长为220nm，柱温箱为37℃。

丰原素的测定采用C18反相色谱柱(4.6mm×150mm)，流动相为50％A相和50％B相组成，A相为乙腈，B相为体积浓度为1％的三氟乙酸水溶液；测定条件为210nm和33℃。

表面活性素的测定采用C18反相色谱柱(4.6mm×250mm)，流动相为90％A相和10％B相组成，A相为甲醇，B相为体积浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液；测定条件为205nm和35℃。除fengycin测定的流速为0.8mL/min，其余脂肽的HPLC测定流速均为1mL/min。

实施例7

利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法，包括如下步骤：

(1)同实施例6步骤(1)；

(2)发酵培养：先将步骤(1)获得的重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子按OD

发酵结束后，将发酵液经过离心、酸沉、真空冷冻干燥、萃取，粗提发酵液中的脂肽，三种脂肽(伊枯草菌素、丰原素和表面活性素)的产量如图2所示。结果表明在菌株C.glutamicum ZQJY-2培养6h后接种解淀粉芽孢杆菌HM618，继续发酵，共培养体系中的总脂肽产量有所提高，达到144.33mg/L，是解淀粉芽孢杆菌菌株HM618纯培养的2.28倍。

实施例8

利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法，包括如下步骤：

(1)同实施例6步骤(1)；

(2)发酵培养：先将步骤(1)获得的重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子按OD

发酵结束后，将发酵液经过离心、酸沉、真空冷冻干燥、萃取，粗提发酵液中的脂肽，三种脂肽(伊枯草菌素、丰原素和表面活性素)的产量如图3所示。结果表明在菌株C.glutamicum ZQJY-2培养8h后接种解淀粉芽孢杆菌HM618，继续发酵，共培养体系中的总脂肽产量有所提高，达到113.19mg/L，是解淀粉芽孢杆菌纯培养的1.79倍。

实施例9

利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法，包括如下步骤：

(1)同实施例6步骤(1)；

(2)发酵培养：先将步骤(1)获得的重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子按OD

粗提发酵液中的脂肽，三种脂肽(伊枯草菌素、丰原素和表面活性素)的产量如图4所示。结果表明用实施例5的培养基，菌株C.glutamicum ZQJY-2培养4h后接种解淀粉芽孢杆菌HM618，继续发酵120h，共培养体系中的总脂肽产量有所提高，达到134.45mg/L，比解淀粉芽孢杆菌菌株HM618纯培养增加了5.41倍。

(解淀粉芽孢杆菌菌株HM618纯培养：在实施例5的发酵培养基中接种OD

实施例10

利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法，包括如下步骤：

(1)同实施例6步骤(1)；

(2)发酵培养：先将步骤(1)获得的重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子按OD

粗提发酵液中的脂肽，结果与实施例9的产量相似，共培养体系中的总脂肽产量比解淀粉芽孢杆菌菌株HM618纯培养有所提高。

实施例11

利用重组谷氨酸棒状杆菌共培养提高解淀粉芽孢杆菌脂肽产量的方法，包括如下步骤：

(1)同实施例6步骤(1)；

(2)发酵培养：先将步骤(1)获得的重组谷氨酸棒状杆菌的二级种子按OD

粗提发酵液中的脂肽，结果与实施例9的产量相似，共培养体系中的总脂肽产量比解淀粉芽孢杆菌菌株HM618纯培养有所提高。