一种宫颈鳞癌类器官培养基及其构建方法

摘要

本发明涉及类器官培养技术领域，具体公开了一种宫颈鳞癌类器官培养基及其构建方法。宫颈鳞癌类器官培养基，包括以下组分：基础培养基、HEPES缓冲对、青霉素链霉素溶液、营养添加剂和特异性因子；所述特异性因子包括烟酰胺、N‑乙酰半胱氨酸、Y‑27632、Noggin因子、A83‑01、EGF、FGF10、Forskolin和氢化可的松。本发明针对宫颈鳞癌开发出宫颈鳞癌类器官培养基，提高了宫颈癌类器官的培养成功率及长期维持率，所培养出宫颈鳞癌类器官可维持原肿瘤组织的组织学形态及遗传学特征；开发的宫颈鳞癌类器官培养基有利于为宫颈癌研究提供新的思路。

说明书

技术领域

本发明涉及类器官培养技术领域，尤其是涉及一种宫颈鳞癌类器官培养基及其构建方法。

背景技术

宫颈癌是最常见的妇科肿瘤之一。2021年全球肿瘤统计分析提示，在所有的妇科肿瘤中，宫颈癌的发生率及病死率均占第四位。宫颈癌最常见的病理类型是鳞状细胞癌和腺癌，分别占所有病例的70％和25％。鳞癌起源于宫颈鳞状上皮，腺癌起源于柱状上皮。迄今为止，宫颈癌研究依赖于数量有限的细胞系、异种移植和转基因的小鼠模型。广泛使用的细胞系如hela，siha经过长期的体外培养选择，已经部分失去对临床病人特征的概括，对临床前的研究价值有限。而异种移植及转基因模型，因价格高昂及培养周期较长等原因无法在研究中实现普遍应用。因此，我们建立一种经济简便有病人代表性的模型来进行宫颈癌的研究。

癌症的研究依赖于稳定的细胞供应-可在实验室中培养的正常细胞和癌性细胞。肿瘤类器官是近年来发展的体外3D培养模型，该模型是在体外利用基质胶或水凝胶等材料模拟细胞外基质，给细胞提供三维支架，外源性添加小分子、生长因子等物质形成干细胞生态环境，诱导来源于组织或干细胞自我更新分化形成三维细胞结构，类器官模型与来源组织密切相关，再现源组织的细胞结构和遗传特质。构建患者来源的肿瘤类器官可很好地在体外复现患者肿瘤的遗传异质性和生物学特性，结合下一代测序在类器官上进行高通量药物筛选可指导患者个体化治疗方案。在肿瘤机制研究中，类器官模型可作为细胞实验和体内实验之间的补充，患者来源的类器官也可成为动物模型和人体临床试验间的桥梁。

然而现有技术中现存培养宫颈鳞癌类器官的培养成功率较低，仅有50％的成功率，因此，有必要提出一种培养成功率较高的宫颈鳞癌类器官培养基。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种宫颈鳞癌类器官培养基及其构建方法。针对宫颈鳞癌开发出本发明的宫颈鳞癌类器官培养基可以提高培养宫颈癌类器官的成功率及长期维持率，有利于为宫颈癌研究提供新的思路。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明提供了一种宫颈鳞癌类器官培养基，包括以下组分：

基础培养基、HEPES缓冲对、青霉素链霉素溶液、营养添加剂和特异性因子；

所述特异性因子为烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、Y-27632、Noggin因子、A83-01、EGF、FGF10、Forskolin和氢化可的松。

本发明发明人经过大量研究及试验发现，开发了针对宫颈鳞癌类器官的培养基，提高了宫颈鳞癌类器官的培养成功率及长期维持率，使得宫颈鳞癌类器官培养成功率从50％提高至73％，且较好的维持了宫颈鳞癌类器官的生物活性，其类器官的生长活性和形态不受影响，所培养出宫颈鳞癌类器官可维持原肿瘤组织的组织学形态及遗传学特征。

其中，培养基添加HEPES缓冲对可以促进类器官的生物活性，并且还能防止培养基pH波动对细胞生长不利的影响。加入上述特异性因子可以协同提高宫颈鳞癌类器官的培养成功率。

作为本发明所述宫颈鳞癌类器官培养基的优选实施方式，宫颈鳞癌类器官培养基包括以下组分：

基础培养基、HEPES缓冲对10～12mM、青霉素链霉素溶液1％～2％、营养添加剂1％～3％、烟酰胺10～12mmol/L、N-乙酰半胱氨酸1～1.5mmol/L、Y-27632 2～10μM、Noggin因子80～120ng/ml、A83-01 450～550nmol/L、EGF5～10ng/ml、FGF10 80～120ng/ml、Forskolin 8～12μM和氢化可的松400～600ng/ml。

作为本发明所述宫颈鳞癌类器官培养基的优选实施方式，宫颈鳞癌类器官培养基包括以下组分：

基础培养基、HEPES缓冲对10mM、青霉素链霉素溶液1％、营养添加剂3％、烟酰胺10mmol/L、N-乙酰半胱氨酸1.25mmol/L、Y-27632 10μM、Noggin因子100ng/ml、A83-01500nmol/L、EGF 5ng/ml、FGF10 100ng/ml、Forskolin10μM和氢化可的松500ng/ml。

作为本发明所述宫颈鳞癌类器官培养基的优选实施方式，所述基础培养基为advanced DMEM/F12；营养添加剂为Glutamax、B27和N2中的至少一种。更优选地，营养添加剂为Glutamax、B27和N2的复配。营养剂的添加有助于宫颈鳞癌类器官的培养，使得宫颈鳞癌类器官生长形态更佳。

作为本发明所述宫颈鳞癌类器官培养基的优选实施方式，所述营养添加剂和特异性因子的体积比为10：(0.5～1.5)。更优选地，营养添加剂和特异性因子的体积比为10：0.8。

本发明的营养添加剂和特异性因子以特定体积比复配时，可以提高宫颈鳞癌类器官的培养效果。

第二目的，本发明提供了一种宫颈鳞癌类器官模型的构建方法，包括以下步骤：

1)获得宫颈癌组织，机械及酶解消化宫颈癌组织，过滤离心，保留细胞沉淀，去除红细胞，得细胞团块；

2)将细胞团块重悬于基质胶中，接种，固定；然后置于上述宫颈鳞癌类器官培养基中培养，每2-3天观察换液，每7-21天进行传代。

作为本发明所述宫颈鳞癌类器官模型的构建方法的优选实施方式，步骤1)中，采用浓度为0.5mg/ml的胶原酶II消化宫颈癌组织。

作为本发明所述宫颈鳞癌类器官模型的构建方法的优选实施方式，步骤2)中，将细胞团块以1万细胞/10μl的密度重悬于基质胶中。

第三目的，本发明提供了上述培养基在培养宫颈鳞癌类器官中的用途。

与现有技术相比，本发明包括以下有益效果：

本发明针对宫颈鳞癌开发出宫颈鳞癌类器官培养基，提高了宫颈癌类器官的培养成功率及传代后维持率，所培养出宫颈鳞癌类器官可维持原肿瘤组织的组织学形态及遗传学特征；开发的宫颈鳞癌类器官培养基有利于为宫颈癌研究提供新的思路。

附图说明

图1为经过实施例1的宫颈鳞癌类器官培养基培养后获得的宫颈鳞癌类器官的光学显微镜图；

图2为经过实施例2的宫颈鳞癌类器官培养基培养后获得的宫颈鳞癌类器官的光学显微镜图；

图3为实施例2与对比例1-12的宫颈鳞癌类器官培养基对宫颈鳞癌类器官尺寸影响的对比统计图；

图4为经过对比例13的宫颈鳞癌类器官培养基培养后获得的宫颈鳞癌类器官的光学显微镜图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例和对比例中，营养添加剂包括Glutamax、B27和N2；特异性因子为烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、Y-27632、Noggin因子、A83-01、EGF、FGF10、Forskolin和氢化可的松。

在以下实施例和对比例中，青霉素链霉素溶液(100×青霉素链霉素混合液)、Hepes缓冲对、Glutamax、B27、N2均购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；烟酰胺(nicotinamide)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)、Forskolin、A83-01购自Sigma-Aldrich公司；Noggin因子、EGF、FGF10、R-spondin 1、CHIR99021购自PeproTech公司；Y-27632、氢化可的松(Hydrocortisone)购自stem cell公司。

实施例1、宫颈鳞癌类器官培养基

本实施例提供了一种宫颈鳞癌类器官培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、12mM Hepes缓冲对、2％青霉素链霉素溶液、1％Glutamax、1％B27、1％N2、12mmol/L烟酰胺(nicotinamide)、1.25mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)、2μM Y-27632、100ng/ml Noggin因子、500nmol/L A83-01、10ng/ml EGF、100ng/ml FGF10、10μMForskolin和500ng/ml氢化可的松。特异性因子各组分的浓度以其在宫颈鳞癌类器官培养基中的浓度为准。

其中，营养添加剂和特异性因子的体积比为10：0.8。

实施例2、宫颈鳞癌类器官培养基

本实施例提供了一种宫颈鳞癌类器官培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、10mM Hepes缓冲对、1％青霉素链霉素溶液、1％Glutamax、1％B27、1％N2、10mmol/L烟酰胺(nicotinamide)、1.25mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)、10μM Y-27632、100ng/ml Noggin因子、500nmol/L A83-01、5ng/ml EGF、100ng/ml FGF10、10μM Forskolin和500ng/ml氢化可的松。特异性因子各组分的浓度以其在宫颈鳞癌类器官培养基中的浓度为准。

其中，营养添加剂和特异性因子的体积比为10：0.5。

实施例3、宫颈鳞癌类器官培养基

本实施例提供了一种宫颈鳞癌类器官培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、10mM Hepes缓冲对、1％青霉素链霉素溶液、0.3％Glutamax、0.3％B27、0.4％N2、10mmol/L烟酰胺(nicotinamide)、1.0mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)、5μMY-27632、80ng/ml Noggin因子、450nmol/L A83-01、5ng/ml EGF、80ng/ml FGF10、8μMForskolin和400ng/ml氢化可的松。特异性因子各组分的浓度以其在宫颈鳞癌类器官培养基中的浓度为准。

其中，营养添加剂和特异性因子的体积比为10：1.5。

实施例4、宫颈鳞癌类器官培养基

本实施例提供了一种宫颈鳞癌类器官培养基，包括基础培养基Advanced DMEM/F12、10mM Hepes缓冲对、1％青霉素链霉素溶液、1％Glutamax、1％B27、1％N2、10mmol/L烟酰胺(nicotinamide)、1.5mmol/L N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)、10μM Y-27632、120ng/ml Noggin因子、550nmol/L A83-01、10ng/ml EGF、120ng/ml FGF10、12μMForskolin和600ng/ml氢化可的松。特异性因子各组分的浓度以其在宫颈鳞癌类器官培养基中的浓度为准。

其中，营养添加剂和特异性因子的体积比为10：0.8。

实施例5、一种宫颈鳞癌类器官模型的构建方法

一种宫颈鳞癌类器官模型的构建方法，包括以下步骤：

1)样本预处理：将刚切除/活检得到的宫颈癌组织标本用生理盐水冲洗3-5次除去表面杂质，装进含浓度为2％双抗及两性霉素B的Advanced DMEM/F12培养基中保存，冰上运输；

2)样本消化：在生物安全柜中，将样本转移至10cm无菌培养皿中加入1ml0.5mg/ml胶原酶II(消化液，基底：含2％双抗及两性霉素B的Advanced DMEM/F12培养基)，用灭菌眼科剪将组织剪碎至1-5mm

3)样本解离：用同体积的PBS终止消化，将消化后的组织悬液用100μm的细胞筛过滤，收集细胞筛上未过滤组织碎片于50ml离心管中，加入3ml tryple(依碎片多少加减)，37度，120rpm震荡消化10mins；

4)细胞过滤：用同体积的PBS终止消化，将消化后的组织悬液再次用100μm的细胞筛过滤，收集两次过滤的滤液，4度600g离心5min，保留细胞沉淀去除上清；

5)裂解红细胞(可选)：肉眼可见细胞沉淀内混有红细胞，加入1-2ml红细胞裂解液，重悬细胞，室温裂解2min；

6)细胞清洗：用10mlPBS终止裂解，4度600g离心5min，保留细胞沉淀去除上清，重复两次；

7)接种：取类器官培养基及基质胶(体积比例为1:2)以1万细胞/10μl的密度重悬细胞沉淀，以30μl/孔接种至48孔板中，小心将孔板倒置，于37度培养箱中固定30mins，待胶凝固后加入200ul培养基覆盖胶滴；

8)培养：于上述实施例1-4中宫颈鳞癌类器官培养基下培养，培养条件为37℃、5％CO

按照实施例5的构建方法，通过在上述实施例1-2宫颈鳞癌类器官培养基培养后获得的宫颈鳞癌类器官在倒置的光学显微镜下观察如图1-2所示。经过实施例3-4宫颈鳞癌类器官培养基培养后获得的宫颈鳞癌类器官在倒置的光学显微镜下的形态与图1-2类似，故不再阐述。

对比例1-12

在实施例2的基础上，对比例1-12为分别减去或添加如表1的特异性因子构成的宫颈鳞癌类器官培养基，然后再按照实施例5宫颈鳞癌类器官模型的构建方法培养宫颈鳞癌类器官7天后，在倒置显微镜下随机挑选5个视野进行类器官的直径测定。

表1

对比例1-12的宫颈鳞癌类器官培养基对宫颈鳞癌类器官形成的影响如图3所示，其中图3中“-”代表较实施例2培养基减去对应因子，“+”代表较实施例2培养基添加对应因子。

结果显示，经过对比例1-12宫颈鳞癌类器官培养基培养后的宫颈鳞癌类器官直径不及实施例2宫颈鳞癌类器官培养基培养效果，其中对比例1-3、5-10分别去掉Noggin、A83-01、EGF、FGF7、FGF10、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、氢化可的松、Forskolin、Y-27632中的一种，宫颈鳞癌类器官培养效果不及实施例2，说明Noggin、A83-01、EGF、FGF7、FGF10、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、氢化可的松、Forskolin和Y-27632相互协同促进宫颈鳞癌类器官培养效果，提高培养宫颈癌类器官的成功率。对比例4的培养基添加FGF7因子，对比例11的培养基添加R-spondin 1，对比例12的培养基添加R-spondin 1和CHIR99021，这三种培养基培养后的宫颈鳞癌类器官大小不及实施例2，说明不是任意特异性因子的添加就能获得本发明的技术效果。

同时观察各例培养基中类器官的传代后维持率(将类器官重新消化成单细胞悬液种于基质胶中，单细胞若再长成类器官则定义为传代成功，长期维持定义为：类器官培养超过10代)，发现除实施例1-4及对比例12外，其余所有对比例均无法传过3代。

本发明人经过大量实验验证，最终获得本发明宫颈鳞癌类器官培养基，即包括以下组分：基础培养基、Hepes缓冲对缓冲对10～12mM、青霉素链霉素溶液1％～2％、营养添加剂1％～3％、烟酰胺10～12mmol/L、N-乙酰半胱氨酸1～1.5mmol/L、Y-27632 0～10μM、Noggin因子80～120ng/ml、A83-01 450～550nmol/L、EGF 5～10ng/ml、FGF10 80～120ng/ml、Forskolin 8～12μM和氢化可的松400～600ng/ml。

对比例13

与实施例2相比，营养添加剂和特异性因子的体积比为10：3，其余组分及浓度与实施例2相同，参考图4。

试验例、宫颈鳞癌类器官培养基对宫颈鳞癌培养成功率的影响

本试验例各组别(实施例1-4、对比例11-13)分别纳入60例宫颈鳞癌类器官样本，按照实施例5的构建方法，检测经过上述实施例1-4、对比例11-13宫颈鳞癌类器官培养基培养后获得的宫颈鳞癌类器官的活性，各组培养宫颈癌类器官的成功率如表2所示，其中，培养成功是指在特定的培养条件下消化后的肿瘤细胞或细胞团能在体外形成立体结构即类器官培养成功。

表2

根据上述结果可知，采用实施例2的宫颈鳞癌类器官培养基培养后获得的宫颈鳞癌类器官有44例可以获得成功，其成功率可以提高至73％(44/60)，实施例1、3-4提高宫颈鳞癌类器官成功培养的效果与实施例2类似。

对比例11-12中的培养基新添加了其他特异性因子，其培养宫颈鳞癌类器官的效果不及实施例2，说明特异性因子不是随意可以添加的，有些特异性因子的加入反而会影响类器官培养的效果。

对比例13的培养基改变了营养添加剂和特异性因子的体积比，宫颈鳞癌类器官培养成功率不及实施例2，说明营养添加剂和特异性因子以特定的体积比搭配，可以提高培养宫颈鳞癌类器官的成功率。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。