一种高倍率光学放大成像流式细胞仪

摘要

本发明涉及一种高倍率光学放大成像流式细胞仪，包括提供照亮样本观测区域的明场照明单元；控制样本在观测区域内的位置和流动速度所需的样本控制单元；捕获样本观测区域内的样本图像并放大的图像放大采集单元；接收图像放大采集单元获取的图像进行图像处理与分类的成像分析单元；其中，图像放大采集单元包括位于样本观测区域一侧且沿同一轴线布置的成像物镜、第一套筒透镜、胶合透镜、第二套筒透镜和图像采集模块。通过选取不同放大倍数的成像物镜以及不同焦距的套筒透镜和胶合透镜形成组合，以多级放大的方式解决目前的成像流式细胞仪成像倍数局限于较低倍率放大的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分析技术领域，具体为一种高倍率光学放大成像流式细胞仪。

背景技术

本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

流式细胞仪是一种用于测量细胞特征的仪器设备，能够检测包括细胞大小、细胞数量、细胞周期等细胞特征信息，也可以提供单个细胞的高度特异性信息。传统流式细胞仪的检测信息通常主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号，从而得到细胞大小、细胞数量、细胞周期等定量信息，是一种零分辨率的仪器，不能鉴别和检测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少；同时，传统的流式细胞仪对细胞信息的检测需要荧光染色，用一定功率的激光激发后才能够收集所需信息(荧光标记)，进行荧光标记的步骤复杂繁琐，而且标记所用试剂的成本也较高，对细胞进行染色的操作也会对细胞的结构功能有一定损害或干扰，从而影响最终获取到的细胞特征信息。

而成像流式细胞仪在传统流式细胞仪基础上增加了成像的功能，在结构中增加高速相机，从而对检测样本进行成像。一般情况下，成像流式细胞仪可进行明场和荧光的成像。荧光成像仍需对样本进行荧光标记，荧光标记存在的问题已在前文提及不再赘述。

而在明场成像的情况下，由于具有高放大倍率的物镜一般为油浸物镜或水浸物镜，工作距离极短，需要进入样本进行观察，难以应用到流式系统中，因此现今的成像流式细胞仪的明场成像局限于较低倍数的放大(多为60倍)，难以达到更高倍数的放大。

发明内容

为了解决上述背景技术中存在的技术问题，本发明提供一种高倍率光学放大成像流式细胞仪，通过选取不同放大倍数的成像物镜以及不同焦距的套筒透镜和胶合透镜形成组合，以多级放大的方式解决目前的成像流式细胞仪成像倍数局限于较低倍率放大的问题，能够达到100倍以上的光学放大。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面提供一种高倍率光学放大成像流式细胞仪，包括：

明场照明单元，提供照亮样本观测区域的明场；

样本控制单元，控制样本在观测区域内的位置和流动速度；

图像放大采集单元，捕获样本观测区域内的样本图像并放大；

成像分析单元，接收图像放大采集单元获取的图像进行图像处理与分类；

其中，图像放大采集单元包括位于样本观测区域一侧且沿同一轴线布置的成像物镜、第一套筒透镜、胶合透镜、第二套筒透镜和图像采集模块。

明场照明单元包括与明场光源和聚焦物镜；明场光源开启后提供发散的明场光，明场光通过聚焦物镜聚焦后照射于样本观测区域。

样本控制单元包括连接在三轴位移台上的鞘流器，鞘流器的鞘液入口和样本液入口分别连接注射泵，样本观测区域位于鞘流器中心。

图像采集模块为CMOS探测器。

第一套筒透镜与胶合透镜之间的距离为两者的焦距之和。

第二套筒透镜与图像采集模块之间的距离为第二套筒透镜的焦距。

样本被明场照亮后的图像被距离样本最近的成像物镜检测收集，依次经第一套筒物镜、胶合透镜和第二套筒透镜放大后传输给图像采集模块。

成像物镜和第一套筒透镜形成对样本图像的一次放大，胶合透镜与第二套筒透镜组成的透镜对形成对放大后图像的二次放大。

与现有技术相比，以上一个或多个技术方案存在以下有益效果：

1、通过选取不同放大倍数的成像物镜以及不同焦距的套筒透镜和胶合透镜形成组合，以多级放大的方式解决目前的成像流式细胞仪成像倍数局限于较低倍率放大的问题。

2、采有模块化架构，可以根据需求调节模块构成，进而得到不同放大倍数的明场样本图像。

3、采用鞘流方法，样本液可以快速并依序通过检测区域，便于样本信号检测和成像。

4、能够支持无标记的方式，不需要对细胞进行染色的处理即可获得图像信息，能够快速得到未受侵入的样本的原图信息。

5、获取的图像能够利用机器学习的方法对无标记细胞的高倍率放大流式图像进行识别分类，具有自动处理的优势。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明一个或多个实施例提供的流式成像细胞仪整体结构示意图；

图2(a)-图2(b)为采用本发明一个或多个实施例提供的流式成像细胞仪进行静态标定实验中的采集的图像；

图3(a)-图3(b)为采用本发明一个或多个实施例提供的流式成像细胞仪进行3.89μm和4.19μm聚苯乙烯小球高倍率流式实验的视频截图；

图4(a)-图4(b)为采用本发明一个或多个实施例提供的流式成像细胞仪进行正常髓系细胞和k562细胞的高倍率流式实验的视频截图；

图5(a)-图5(b)为采用本发明一个或多个实施例提供的流式成像细胞仪进行训练后对新图像进行预测的正常髓系细胞和k562细胞的预测结果示意图；

图中：1、明场光源，2、聚焦物镜，3、鞘流器，4、成像物镜，5、第一套筒透镜，6、胶合透镜，7、第二套筒透镜，8、CMOS探测器，9、三轴位移台，10、第一注射泵，11、第二注射泵，12、数据分析系统。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

成像流式细胞仪，利用高速相机对流动的细胞样本进行成像，通过视频或图像的方式获取细胞样本的特征信息。

正如背景技术中所描述的，成像流式细胞仪可进行明场和荧光的成像。荧光成像仍需对样本进行荧光标记，需要对细胞样本进行荧光染色，再使用一定功率的激光激发后才能够收集所需的细胞特征信息；荧光标记的步骤复杂繁琐，标记所用试剂的成本也较高，而且对细胞进行染色的操作也会对细胞的结构功能有一定损害或干扰，从而影响最终获取到的细胞特征信息；

而在明场成像的情况下，由于具有高放大倍率的物镜一般为油浸物镜或水浸物镜，工作距离极短，需要进入样本进行观察，难以应用到流式系统中，因此现今的成像流式细胞仪的明场成像局限于较低倍数的放大(多为60倍)，难以达到更高倍数的放大。

因此以下实施例给出一种高倍率放大流式成像细胞仪，通过在成像通路中利用距离样本最近的成像物镜与套筒透镜组合形成一级放大，再经胶合透镜与套筒透镜组成的透镜对形成二级放大，获取最后的放大图像能够实现不侵入流式系统，且能够高于100倍的高倍率放大成像，并应用于细胞的流式成像。

实施例一：

一种高倍率放大流式成像细胞仪，包括：

明场照明单元，提供照亮样本观测区域的明场；

样本控制单元，控制样本在观测区域内的位置和流动速度；

图像放大采集单元，捕获样本观测区域内的样本图像并放大；

成像分析单元，接收图像放大采集单元获取的图像进行图像处理与分类；

其中，图像放大采集单元包括位于样本观测区域一侧且沿同一轴线布置的成像物镜、第一套筒透镜、胶合透镜、第二套筒透镜和图像采集模块。

明场照明单元包括与明场光源和聚焦物镜；明场光源开启后提供发散的明场光，明场光通过聚焦物镜聚焦后照射于样本观测区域。

样本控制单元包括连接在三轴位移台上的鞘流器，鞘流器的鞘液入口和样本液入口分别连接注射泵，鞘流器的出口位于样本观测区域。

图像采集模块为CMOS探测器。

样本被明场照亮后的图像被距离样本最近的成像物镜检测收集，依次经第一套筒物镜、胶合透镜和第二套筒透镜放大后传输给图像采集模块。

成像物镜和第一套筒透镜形成对样本图像的一次放大，胶合透镜与第二套筒透镜组成的透镜对形成对放大后图像的二次放大。

具体如下：

如图1所示，明场照明单元提供照亮样本观测区域的明场，样本控制单元控制样本位置以及样本速度，图像放大与采集单元捕获样本图像并放大，最终图像送到成像分析单元进行图像处理与分类。

明场照明单元包括明场光源1、聚焦物镜2。明场光源开启后提供发散的明场光，明场光通过聚焦物镜2聚焦后照射于样本观测区域。本实施选用汞灯作为明场光源，可以产生0-100范围内的明场光强。

样本控制单元包括鞘流器3、两组注射泵和三轴位移台9。鞘流器3用于承载样本并实现鞘流。两个注射泵(第一注射泵10和第二注射泵11)分别用于控制样本液速度与鞘液速度。鞘流器3固定于三轴位移台9，三轴位移台可以控制鞘流器在x轴，y轴以及z轴移动。

图像放大采集单元包括成像物镜4、胶合透镜6、套筒透镜和CMOS探测器8。一级放大通过距离样本最近的成像物镜4与第一套筒透镜5组合，从而达到选择物镜的放大倍数，后经胶合透镜6与第二套筒透镜7组成的透镜对的二级放大得到进一步的放大图像，最终通过CMOS探测器8采集到样本的图像。

透镜具有方向与距离要求，在搭建仪器的过程中需进行设置与调整。其中，成像物镜4与聚焦物镜2的前端均朝向鞘流器3，第一套筒透镜5的聚焦方向朝成像物镜4，胶合透镜6的焦距方向朝向第一套筒透镜5，第二套筒透镜7的聚焦方向朝CMOS探测器8；

第一套筒透镜5与成像物镜4的距离在第一套筒透镜5的工作距离范围内，第一套筒透镜5与胶合透镜6的距离为两者的焦距之和，第二套筒透镜7与CMOS探测器8的距离为第二套筒透镜7的焦距。

成像分析单元包括搭载了数据分析系统12的计算机，具有特征提取、支持向量机分类以及信息预测三部分。特征提取提取捕获样本的明场图像特征参数，支持向量机根据该特征参数训练分类模型，信息预测将新进入的图像放入训练过后的模型预测其分类类型。

具体包括以下过程：

明场光源1发出的明场光经过聚焦物镜2聚焦照射在鞘流器3的检测区域，从而照亮待测样本。鞘流器3固定在三轴位移台9上，通过三轴位移台9控制检测区域处于成像物镜4的正中心。鞘流器3的鞘液口和样本液口各连接一注射泵10和11，分别控制样本液和鞘液的流入。

样本被明场照亮以后，图像被成像物镜4检测收集，并通过套筒物镜5得到一次放大图像，再通过胶合透镜6与第二套筒透镜7所组合的透镜对将其进行二次放大，CMOS探测器8捕获图像，记录的图像数据传送到分析系统12进行数据分析。

上述流式成像细胞仪的工作过程包括以下步骤：

(1)清洁鞘流器，将鞘流器固定在三轴位移台上。

(2)配置样本液和鞘液，将鞘流器样本进液口和鞘流器鞘液口分别连接注射泵，利用注射泵将配置好的样本液和鞘液分别泵入鞘流器。

(3)控制三轴位移台移动样本，使待测区域处于成像物镜的中心，并且调节光路，保证图像放大采集单元的各元件中心处于同一轴线，对样本进行粗调聚焦。

(4)启动明场光源，校准光路，确定明场光从聚焦物镜中心射入并聚焦到样本待测区域，且保证CMOS探测器所得图像取自检测区域中心，然后进一步调节样本聚焦以得到聚焦图像。

(5)启动注射泵，样本流动形成稳定鞘流后进入检测状态。

(6)启动CMOS探测器进行图像采集。调节CMOS探测器的曝光时间，采集得到高倍率放大的流式图像。

(7)将CMOS探测器捕获的图像输入分析系统中进行图像分析。

具体的：

1、标定实验：

使用上述装置实现一定倍率的放大倍数标定与该放大倍数下的静态图像获取。本实例中聚焦物镜2使用4X物镜，聚焦增强明场照明。成像物镜4使用20X物镜，两个套筒透镜选取180mm焦距的进行使用，胶合透镜6选取焦距为30mm的进行使用。20X的成像物镜4与第一套筒透镜5组合做20倍的1级放大，30mm胶合透镜6与180mm第二套筒透镜7组合达成6倍的2级放大，整体成像和放大模块的两级放大计算为120倍的放大倍数。

首先进行标定验证放大倍数，然后使用标定后的实验装置采集静态下的细胞图像证明可以得到达到此放大倍数的清晰图像。

具体操作步骤：

(1)将实验仪器上的鞘流管更换成正同心环分划板。

(2)打开明场光源，校准光路，保证明场光源中心与平面保持平行，并经过各光学元件中心直到CMOS中心。调整正同心环分划板位置，保证成像物镜中心位于同心环中心十字。最后调节焦距使成像清晰，获得图像，如图2(a)所示。

(3)获取成像分析。正同心环分划板中心十字线条为10μm的标准宽。CMOS单像素大小为5.3μm，扫描获取图像中线条宽度的像素数，进行计算，计算得到的宽度为1192.5μm，因此放大倍数为119.25倍，误差为0.625％。

(4)取一滴k562细胞样本液，将其滴于载玻片，放置盖玻片使液滴散开，固定后，制成细胞的静态样本。

(6)更换鞘流器为细胞静态样本，调节三轴位移台来调整细胞样本位置，使细胞样本聚焦，取得细胞120倍静态放大图像，如图2(b)所示。

2、聚苯乙烯小球成像实验：

为证明上述装置在流式情况下可用，本实例使用两种大小分别为3.89μm和4.19μm的聚苯乙烯小球，在流动情况下进行实验，使其产生稳定鞘流并获得清晰图像。

鞘流：指利用一毛细管对准小孔管，细胞混悬液从毛细管喷出。同时与四周流出的鞘液一起流过敏感区，保证细胞混悬液在中间形成单个排列的细胞流，四周被鞘液围绕。

具体实现：

(1)准备3.89μm和4.19μm的聚苯乙烯小球溶液，使用纯水将其进行一定的稀释，用针管取得小球溶液并与样本液入口相连。然后取足量的纯水与鞘流液入口相连。

(2)同标定实验，选取相同的光学元件，整个系统的放大倍数设定为120倍，开启明场光源并校准整个光路。

(3)分别开启两个鞘流器，控制位移台改变样本位置，使样本在视野中清晰可见，然后聚焦。

(4)调节鞘流器的速度配比与CMOS拍摄的曝光时间，使鞘流稳定、拍摄亮度适宜、拍摄图像不具有拖尾现象。最终确定在样本液流速与鞘液流速比值为1比80、曝光时间60μs的时候，可以得到稳定鞘流，所得图像清晰，3.87μm小球和4.19μm小球截取图像分别如图3(a)和图3(b)所示。

(5)根据所得小球流式图像的像素数进行尺寸计算，可以计算得到3.87μm小球的大小约为3.93μm，有1.6％的误差。4.19μm小球的大小约为4.42μm，有5.4％的误差。

3、髓系淋巴细胞实验：

对人体正常髓系淋巴细胞和人慢性髓系淋巴细胞进行了成像、分类与预测。本实例使用了两种细胞系：人体正常髓系细胞细胞系和人体慢性髓系白血病细胞系(k562细胞系：源自一个53岁的女性慢性髓性白血病爆发期病人的淋巴母细胞)。对正常髓系细胞样本与k562细胞进行图像采样，每类随机采集60个实验结果，对获得的120个样本进行特征参数提取并用支持向量机(SVM)的方法对两类细胞分类。并且对新进入的细胞图像进行预测，以证明该系统的实用性。

具体实现：

(1)准备正常髓系细胞样本和k562细胞样本，用PBS缓冲液配置成细胞溶液，用针管取得细胞溶液并放置于注射泵上，与样本液入口相连，再取足量纯净的PBS缓冲液与鞘流液入口相连。

(2)同标定实验，选取相同的光学元件，整个系统的放大倍数设定为120倍，开启明场光源并校准整个光路。

(3)分别开启两个鞘流器，并将速度比设定为1比80，CMOS曝光时间设置为45μs，控制位移台使样本位置调整至聚焦，并得到细胞的流式放大图像，正常髓系细胞和k562细胞流式截图分别如图4(a)和图4(b)所示。

(4)算法提取图像的特征参数。此处提取方向梯度直方图(HOG)和灰度共生矩阵(GLCM)特征，并将两个特征合并作为最终特征。

(5)执行SVM算法(支持向量机)。将120个数据样本按照7:3的比例随机分成训练集和测试集，以函数的混淆矩阵计算正确率，可以得到模型的正确率为86.1％，模型具体准确率表格如表1所示。

(6)随机选取新的未进行训练的编号为121、122的样本图像，放入支持向量机算法训练好的模型做预测，得到预测效果，如图5(a)和5(b)所示。

表1：模型准确率

经过实验，能够证明上述装置通过选取不同放大倍数的成像物镜以及不同焦距的套筒透镜和胶合透镜形成组合，能够达到100倍以上的高倍率放大，以多级放大的方式解决目前的成像流式细胞仪由于物镜工作距离的原因，成像倍数局限于较低倍率放大。

采有模块化架构，可以根据需求调节模块构成，进而得到不同放大倍数的明场样本图像。

采用鞘流方法，样本液可以快速并依序通过检测区域，便于样本信号检测和成像。

使用了无标记的方式，未对细胞进行染色的处理，能够快速得到未受侵入的样本的原图信息。

使用人工智能的方式对无标记细胞进行识别分类，具有自动处理的优势。

不局限于无标记细胞，并可以应用于其他情况下的明场放大和成像，具有普遍适应性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。