一种高效液相色谱法检测仑布雷生中间体及其对映体杂质的方法

摘要

本发明涉及一种高效液相色谱法检测仑布雷生中间体及其对映体杂质的方法，该方法色谱柱为大赛璐IE 250*4.6mm，5um或大赛璐IC 250*4.6mm，5um；流动相及比例为正己烷：乙醇：异丙醇=85:(0~15):(0~15)；检测波长为205~230nm；柱温为20～30℃；流动相流速为0.5~1.5ml/min；本发明提供的高效液相色谱法检测仑布雷生中间体及其对映体杂质的方法可实现仑布雷生中间体主成分与其对映体杂质分离度R≥2.0，6份供试品溶液测得对映体杂质含量RSD≤2.0%，重复性良好，方法耐用性好，可用于仑布雷生中间体的质量控制。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种高效液相色谱法检测仑布雷生中间体及其对映体杂质的方法。

背景技术

仑布雷生（Lemborexant）是由卫材R&D管理有限公司研发的一种治疗失眠症的药物，其药理作用机制为双重食欲素 OX1R 和 OX2R 受体抑制剂，用于入睡或睡眠维持困难的治疗，与传统安眠药比较，食欲素受体拮抗剂被学术界认为具有能够抑制觉醒而不妨碍外部唤醒刺激的功能。

((1R,2S)-2-(3-氟苯基)-2-((甲苯磺酰氧基)甲基)环丙基)乙酸甲酯是仑布雷生的制备中间体，其结构式如下：

专利CN104114524B记载了该中间体及其对映异构体杂质的分析方法，但是该方法主成分与对映体分离不佳，使用涂覆型色谱柱，色谱柱耐受性较差，不能满足反应监控（部分反应液样品会损伤色谱柱）。目前暂无其他文献报道仑布雷生的制备中间体及其对映体杂质的分析方法。仑布雷生制备中间体的对映体杂质结构式如下：

发明内容

本发明提供一种高效液相色谱法检测仑布雷生中间体及其对映体杂质的方法，本方法使用键合型色谱柱，色谱柱耐受性更好，可以用作反应监控，主成分与对映体分离度更好。

本发明采用的技术方案如下：

一种高效液相色谱法检测式（I）结构及其对映体杂质的方法，式（I）结构如下：

其特征在于：

1）色谱条件：色谱柱为大赛璐IE 250*4.6mm，5um或大赛璐IC 250*4.6mm，5um；流动相及比例为正己烷：乙醇：异丙醇=85:(0~15):(0~15)；检测波长为205～230 nm；柱温为20～30℃；流动相流速为0.5～1.5 mL/min；

2）供试品溶液的配制：将样品用异丙醇溶解，再用正己烷稀释；

3）测定：精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

本方法所述色谱柱为大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

本方法所述色谱柱为大赛璐IC 250*4.6mm，5um；

本方法所述流动相正己烷:乙醇比例为85：15。

本方法所述流动相正己烷:乙醇:异丙醇比例为85：10：5。

本方法所述流动相正己烷:乙醇:异丙醇比例为85：5：10。

本方法所述流动相正己烷:异丙醇比例为85：15。

本方法所述检测波长为205nm、210 nm、220nm或230nm。

本方法所述柱温为20 ℃、25 ℃或30 ℃。

本方法所述流动相流速为0.5 mL/min、1.0 mL/min或1.5 mL/min。

本方法所述供试品浓度为0.5~2 mg/ml。

本方法所述供试品浓度为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml或2mg/ml。

分离度，用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标，用R表示，R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R＜1.0时，两峰有部分重叠，当R＝1.0时，分离度可达98%，当R＝1.5时，分离度可达99.7%。

本发明提供的高效液相色谱法检测仑布雷生中间体及其对映体杂质的方法可实现仑布雷生中间体与其对映体杂质分离度R ≥ 2.0，6份供试品溶液测得对映体杂质含量RSD ≤ 2.0%，重复性良好，方法耐用性好，可用于仑布雷生中间体的质量控制。

本发明所述任意数字区间范围包含端点值及中间任意值。如0.5～1.5包含0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4和1.5等。

附图说明

图1 实施例2方法专属性实验-式（I）定位。

图2 实施例2方法专属性实验-式（I）对映体杂质定位

图3 实施例2方法专属性实验-系统适用性溶液。

具体实施方式

实施例1：色谱条件的筛选

通过色谱柱、流动相、波长、流速等进行筛选确定色谱条件。

实施例1-a

色谱柱：大赛璐AD-H 250*4.6mm，5um；

检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 uL；流速：0.5 mL/min；

流动相为正己烷:异丙醇=90：10，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：参考现有专利方法（CN104114524B），溶剂采用异丙醇溶解，主成分与对映体分离较差。

实施例1-b

色谱柱：大赛璐OD-H 250*4.6mm，5um；

检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 uL；流速：0.5 mL/min；

流动相为正己烷:异丙醇=90：10，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：在实施例1-a基础上换用OD-H柱，主成分与对映体分离无改善。

实施例1-c

色谱柱：大赛璐AS-H 250*4.6mm，5um；

检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 uL；流速：0.5 mL/min；

流动相为正己烷:乙醇=70：30，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：在实施例1-a基础上换用ASH柱，主成分与对映体未分离，

峰型也较差。

实施例1-d

色谱柱：大赛璐IC 250*4.6mm，5um；

检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 uL；流速：0.5 mL/min；

流动相为正己烷:乙醇=70：30，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：在实施例1-c基础上换用IC柱，主成分与对映体基本分离，分离度为1.8。

实施例1-e

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 uL；流速：0.5 mL/min；

流动相为正己烷:乙醇=70：30，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：在实施例1-d基础上换用IE柱，主成分与对映体分离度1.88。

实施例1-f

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 uL；流速：0.5 mL/min；

流动相为正己烷:乙醇:异丙醇=70：20：10，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：在实施例1-e基础上乙醇中加入异丙醇，主成分与对映体分离有改善，分离度2.58，主峰后相邻位置疑似有杂质包裹。

实施例1-g

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 uL；流速：0.5 mL/min；

流动相为正己烷:乙醇=85：15，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：在实施例1-e基础上降低乙醇比例，主成分与对映体分离度2.37，前后无干扰，但出峰较晚。

实施例1-h

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 uL；流速：0.8 mL/min；

流动相为正己烷:乙醇=85：15，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：在实施例1-g基础上提高流速，主成分与对映体出峰适宜，分离度2.21。

实施例1-I

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 uL；流速：0.8 mL/min；

正己烷:乙醇:异丙醇=85：5：10，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：在实施例1-h基础上乙醇中加入异丙醇，主成分与对映体分离有改善，分离度2.88。

实施例1-j

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 uL；流速：1.0 mL/min；

正己烷:乙醇:异丙醇=85：5：10，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：在实施例1-i基础上提高流速，主成分与对映体出峰适宜，前后无干扰，分离度2.74。

实施例1-k

色谱柱：大赛璐ID 250*4.6mm，5um；

检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 uL；流速：1.0 mL/min；

正己烷:乙醇:异丙醇=85：5：10，按照0 min、60min等度洗脱；

结论：在实施例1-j基础上换用ID柱，主成分与对映体未分离。

实施例2：方法专属性

【步骤1】流动相的配制：

精密量取正己烷850ml，乙醇50ml及异丙醇100ml，混匀，超声备用。

【步骤2】溶液配制：

将仑布雷生中间体与其对映体样品分别用异丙醇溶解正己烷稀释，配制成浓度为1.0 mg/mL的供试品溶液、0.01mg/mL的自身对照溶液及含仑布雷生中间体1.0 mg/mL，其对映体0.01mg/mL的系统适用性溶液。

色谱条件如下：

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 uL；流速：1.0 mL/min；

正己烷:乙醇:异丙醇=85：5：10，按照0 min、60min等度洗脱；

结果：式（I）结构保留时间：22.31min；式（I）对映体杂质保留时间：24.30 min；

本发明方法能实现式（I）及其对映体杂质的完全分离，方法专属性好。

实施例3：重复性实验

取6份供试品溶液，连续进样，记录色谱图，结果如下：

（1）仑布雷生对映体保留时间：24.370 min；峰面积：2.2237；对映体含量：0.48 %；

（2）仑布雷生对映体保留时间：24.377 min；峰面积：2.2497；对映体含量：0.46 %；

（3）仑布雷生对映体保留时间：24.370 min；峰面积：2.2676；对映体含量：0.48 %；

（4）仑布雷生对映体保留时间：24.380 min；峰面积：2.2056；对映体含量：0.46 %；

（5）仑布雷生对映体保留时间：24.387 min；峰面积：2.2368；对映体含量：0.47 %；

（6）仑布雷生对映体保留时间：24.373 min；峰面积：2.2754；对映体含量：0.48 %；

重复性实验结果显示：6份供试品溶液连续进样，主成分及对映体保留时间RSD小于2.0%，对映体含量RSD小于2.0%，实验方法重复性好。

实施例4：耐用性实验

通过将色谱条件的流速、流动相比例、柱温、波长等进行调整，测定结果不受影响的承受程度。

实施例4-a、不同流速耐用性实验

色谱条件如下：

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：220 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 uL；流速: 0.5~1.5mL/min；

正己烷:乙醇:异丙醇=85：10：5，按照0 min、60min等度洗脱；

结果如下：

（1）流速为0.5 mL/min，分离度为3.20；

（2）流速为1.0 mL/min，分离度为2.72；

（3）流速为1.5 mL/min，分离度为2.41；

耐用性不同流速的测试结果显示：本测试方法在流速0.5~1.5 mL/min之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。

实施例4-b、不同流动相比例耐用性实验

色谱条件如下：

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：220 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 uL；流速: 1 mL/min；

正己烷:乙醇:异丙醇= 85:(0~15):(0~15)，按照0 min、60min等度洗脱；

结果如下：

（1）正己烷:乙醇= 85：15 ，分离度为2.09；

（2）正己烷:乙醇:异丙醇= 85：10：5 ，分离度为2.72；

（3）正己烷:乙醇:异丙醇= 85：5：10 ，分离度为3.78；

（4）正己烷:异丙醇= 85：15 ，分离度为4.78；

耐用性不同流动相起始比例的测试结果显示：本测试方法的流动相比例在85:(0~15):(0~15)之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。

实施例4-c、不同柱温耐用性实验

色谱条件如下：

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：220 nm；柱温：20~30 ℃；进样量：10 uL；流速: 1 mL/min；

正己烷:乙醇:异丙醇=85：10：5，按照0 min、60min等度洗脱；

结果如下：

（1）柱温为20 ℃，分离度为2.90；

（2）柱温为25 ℃，分离度为2.72；

（3）柱温为30 ℃，分离度为2.55；

耐用性不同柱温的测试结果显示：本测试方法在柱温20~30 ℃之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。

实施例4-d、不同检测波长耐用性实验

色谱条件如下：

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um；

检测波长：205~230 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 uL；流速: 1 mL/min；

正己烷:乙醇:异丙醇=85：10：5，按照0 min、60min等度洗脱；

结果如下：

（1）检测波长为205 nm，分离度为2.46；

（2）检测波长为210 nm，分离度为2.74；

（3）检测波长为220 nm，分离度为2.72；

（4）检测波长为230 nm，分离度为2.72；

耐用性不同检测波长的测试结果显示：本测试方法在检测波长205~230nm之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。

实施例4-e、不同色谱柱耐用性实验

色谱条件如下：

色谱柱：大赛璐IE 250*4.6mm，5um或大赛璐IC 250*4.6mm，5um；

检测波长：220 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 uL；流速: 1.0 mL/min；

正己烷:乙醇:异丙醇=85：10：5，按照0 min、60min等度洗脱；

结果如下：

（1）色谱柱为大赛璐IE 250*4.6mm，5um，分离度为2.72；

（2）色谱柱为大赛璐IC 250*4.6mm，5um，分离度为2.43；

耐用性不同类型色谱柱的测试结果显示：本测试方法色谱柱为IE柱或IC柱，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。