一种明胶空心胶囊中山梨酸和苯甲酸的浓缩提取测定方法

摘要

本发明提出的是一种明胶空心胶囊中山梨酸和苯甲酸的浓缩提取测定方法，包括如下步骤：取明胶空心胶囊精密称定，置离心管中加水并立即涡旋振荡溶解，超声处理后迅速加入无水乙醇，振摇混匀使明胶析出，再超声处理并离心，取上清液减压回收溶剂，定量转移至量瓶中稀释至刻度，摇匀滤过得供试品溶液；取苯甲酸钠和山梨酸钾对照品精密称定，加水制成对照品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪测定，得到供试品色谱。本发明既可提取供试品中的苯甲酸和山梨酸，又可以最大限度快速分离体系内的明胶，不仅可以增加目标成分的信号强度，又可有效避免色谱图中的乙醇干扰峰，具有操作简便，稳定性强，重复性好和回收率较高的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种山梨酸和苯甲酸的提取方法，特别是一种明胶空心胶囊中山梨酸和苯甲酸的浓缩提取测定方法，属于食品安全技术领域。

背景技术

明胶空心胶囊是由药用明胶加辅料精制而成的两节胶囊壳组合结构，主要用于盛装自制散剂、保健品、药剂等固体药物，解决了药品入口难、口感差的问题，同时具有良好的生物利用度，可在服用后迅速、可靠和安全地溶解。

苯甲酸又名安息香酸，是普遍使用的化学合成防腐剂，长期以来一直作为果酱、碳酸饮料、果汁饮料、泡菜等酸性食品的防腐剂使用。然而近几年来，国内外食品行业有逐渐减少其使用的趋势，主要是因为根据近年来的研究情况，苯甲酸具有一定的致突变作用、遗传毒性以及对雄性动物的生殖毒性。山梨酸又名2，4－已二烯酸，虽然毒副作用较苯甲酸低，但长期服用在一定程度上会抑制骨骼生长，危害肾、肝脏的健康，但目前尚未有关于山梨酸对人体危害的具体报道。

目前明胶空心胶囊在生产过程中会添加尼泊金作为抑菌剂，或将产品进行环氧乙烷灭菌，如果在明胶原料处理制作过程或空心胶囊制作过程中带入其它防腐剂，会增加患者用药风险。现有的明胶空心胶囊标准并未包含苯甲酸和山梨酸成分的检测项目，对于非法添加该类防腐剂的行为起不到监督检验作用，因此，对明胶空心胶囊的现行标准增加补充检验方法，针对苯甲酸和山梨酸成分进行检查，对于确保人民群众用上放心安全的药物而言十分重要。

发明内容

为进一步提高明胶空心胶囊中非法添加的违禁物质提取效率，同时克服传统高蛋白含量样品提取困难的问题，本发明采用水提醇沉方法对明胶空心胶囊中山梨酸和苯甲酸进行提取，该方法操作简便，重复性和稳定性均符合中国药典要求。

本发明的技术解决方案：一种明胶空心胶囊中山梨酸和苯甲酸的浓缩提取测定方法，具体包括如下步骤：

1)供试品溶液的制备：取明胶空心胶囊1g，精密称定，置50ml离心管中，加60℃的水10ml，立即涡旋振荡使供试品溶解，50℃超声处理20分钟，迅速加入40ml无水乙醇，轻轻振摇使混匀，使明胶析出，再50℃超声处理1分钟，7000RPM离心8分钟，取上清液，减压回收溶剂至约2ml，定量转移至25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2)对照品溶液的制备：取苯甲酸钠和山梨酸钾对照品适量，精密称定，加水制成每1ml各含苯甲酸和山梨酸10μg的溶液，即得。

3)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以0.02mol/L乙酸铵溶液-甲醇(93:7)为流动相；检测波长为229nm。理论板数按山梨酸峰计算应不低于5000。苯甲酸和山梨酸与相邻峰的分离度均应符合规定。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结果判断：供试品色谱中，不应呈现与对照品保留时间一致的色谱峰。如出现与对照品保留时间一致的色谱峰，则应采用二极管阵列检测器进行检测，若该色谱峰与对照品的紫外吸收光谱相同，则可判定含相应组分。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1)采用先以水进行溶解，再用醇沉的提取方法，既可提取供试品中的苯甲酸和山梨酸，又可以最大限度快速分离体系内的明胶，

2)采用旋转蒸发的形式低温浓缩供试液，再以水定容，不仅可以增加目标成分的信号强度，又可有效避免色谱图中的乙醇干扰峰；

3)具有操作简便，稳定性强，重复性好和回收率较高的特点。

附图说明

附图1是实施例中根据液相色谱仪测得数据计算出的苯甲酸标准曲线图。

附图2是实施例中根据液相色谱仪测得数据计算出的山梨酸标准曲线图。

附图3是实施例中明胶空心胶囊供试品溶液的液相色谱结果图。

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明的技术方案。

本实施例中采用的仪器型号与试药成分具体如下：

仪器：Dionex U3000高效液相色谱仪二极管阵列检测器、Agilent 1260高效液相色谱仪二极管阵列检测器、Waters 2695e高效液相色谱仪二极管阵列监测器；Agilent1290高效液相色谱仪-AB SCIEX 5500QTRAP质谱仪；Eppendorf 5430离心机；IKA RV10旋转蒸发仪；Sartorius CPA225D电子分析天平。

试药乙酸铵(阿拉丁试剂，for HPLC，含量≥99.0％)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，优级纯)；甲醇(德国默克，色谱纯)。

本实施例中提出的明胶空心胶囊中山梨酸和苯甲酸的浓缩提取测定方法，具体包括如下步骤：

1)溶液的制备

①供试品溶液的制备：取明胶空心胶囊1g，精密称定，置50ml离心管中，加60℃的水10ml，立即涡旋振荡使供试品溶解，50℃超声处理20分钟，迅速加入40ml无水乙醇，轻轻振摇使混匀，使明胶析出，再50℃超声处理1分钟，7000RPM离心8分钟，取上清液，减压回收溶剂至约2ml，定量转移至25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液得供试品溶液；同时取不含苯甲酸和山梨酸的明胶空心胶囊1g，精密称定，其余按步骤①同法操作，得阴性供试品溶液。

②对照品溶液的制备：取苯甲酸钠和山梨酸钾对照品适量，精密称定，加水制成每1ml各含1mg的溶液，再分别用水稀释成每1ml各含苯甲酸和山梨酸1μg、5μg、10μg、20μg和50μg的系列对照品溶液。

2)液相色谱仪检测：分别精密吸取系列对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定相应的峰面积，以系列对照品溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，再将供试品溶液峰面积带入标准曲线中，得到供试品溶液中苯甲酸和山梨酸的质量浓度。

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以0.02mol/L乙酸铵溶液-甲醇(93:7)为流动相；检测波长为229nm。

以下对本实施例中提出的方法的线性范围、精密度、专属性、准确度、检测限、定量限、耐用性进行逐一检测认定。

1)线性范围

分别精密吸取各浓度苯甲酸和山梨酸对照品溶液10μl进样，测定峰面积，建立标准曲线，如图1～图2所示，并计算回归方程如下：苯甲酸：y＝23.693x+1.1295，r＝0.9999，线性范围：1.0194～50.9716μg/ml。山梨酸：y＝41.984x+1.7136，r＝0.9999，线性范围：1.0102～50.5088μg/ml。明胶空心胶囊供试品溶液的液相色谱结果如图3所示。

2)精密度

①重复性

平行制备供试品溶液6份，分别进样10μl，测定6份供试品溶液中苯甲酸和山梨酸的峰面积并根据相应回归方程计算含量，具体结果如下表1～表2所示。

表1

表2

由上表可看出，6份平行供试品苯甲酸含量RSD为2.49％，山梨酸含量RSD为2.73％，参照《中国药典2015年版四部》9101药品质量标准分析方法指导原则的相关要求，供试品溶液重复性良好。

②中间精密度

由三名不同的检验人员，使用不同品牌高效液相色谱仪和色谱柱，分别按各制备2份供试品溶液，同时制备苯甲酸和山梨酸系列对照品溶液，分别建立标准曲线，测定供试品中苯甲酸和山梨酸含量，计算RSD。

使用Agilent 1260高效液相色谱仪建立标准曲线，计算回归方程，苯甲酸：y＝32.687x+1.2226，R

表3

表4

使用Waters2695e高效液相色谱仪建立标准曲线，计算回归方程，苯甲酸：y＝40889x-4826.5，R

表5

表6

综合使用DionexU3000高效液相色谱仪建立标准曲线，计算回归方程后得出的供试品中苯甲酸和山梨酸含量，可计算出三者间苯甲酸和山梨酸含量测定值的RSD。具体结果如下表7所示。

表7

由上表可看出，三名不同的检验人员使用不同品牌高效液相色谱仪和色谱柱对供试品进行苯甲酸和山梨酸的含量进行测定，苯甲酸含量RSD为3.11％，山梨酸含量RSD为1.46％，参照《中国药典2015年版四部》9101药品质量标准分析方法指导原则的相关要求，供试品溶液中间精密度良好。

3)专属性

对比苯甲酸、山梨酸对照品溶液及供试品溶液色谱图，供试品溶液色谱图中出现与苯甲酸、山梨酸对照品溶液保留时间一致的色谱峰。采用二极管阵列检测器进行检测，供试品溶液中与对照品溶液中对应色谱峰的紫外吸收光谱基本相同，故进一步采用LC-MS方法进行确证。

LC-MS方法色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为3μm)；柱温为35℃；以0.02mol/L乙酸铵溶液-甲醇(93:7)为流动相；检测波长为229nm；进样量为5μl。质谱条件：采用ESI离子源；离子化方式为负离子；离子源温度150℃；毛细管温度375℃；源电压3.5kV；鞘气流速为30arb；辅助气流速为5arb；扫描方式为一级质谱全扫描；扫描范围50～200m/z；苯甲酸和山梨酸的m/z分别为121、111。

经LC-MS方法确证，供试品溶液色谱图中与苯甲酸、山梨酸对照品溶液保留时间一致的色谱峰确为苯甲酸和山梨酸。

4)准确度(回收率)

取明胶空心胶囊0.5g，精密称定，置50ml离心管中，精密加入相当于0.5g供试品中含有的苯甲酸和山梨酸，继续制备成供试品溶液，共制备6份，各取10μl进样，记录色谱图和相应组分色谱峰面积。根据峰面积计算出相应组分总含量，根据6份供试品中苯甲酸和山梨酸的平均含量计算供试品中相应组分的含量，进一步计算出6份供试品的加样回收率并计算RSD。具体结果如下表8～表9所示。

表8

表9

由上表可看出，6份加样回收供试品中，苯甲酸回收率平均值为94.98％，RSD为3.76％；山梨酸回收率平均值为92.28％，RSD为2.56％。两组分回收率平均值均达到90％以上，RSD均小于4％，参照《中国药典2015年版四部》9101药品质量标准分析方法指导原则的相关要求，本方法准确度良好。

5)检测限、定量限

具体结果如下表10～表11所示。

表10

表11

6)耐用性

①稳定性

在30小时内每隔一段时间对同一份供试品溶液进样检测，记录供试品中苯甲酸和山梨酸峰面积，计算RSD值。具体结果如下表12所示。

表12

由上表可看出，30小时内，同一份供试品溶液苯甲酸峰面积RSD为1.23％，山梨酸峰面积RSD为0.22％，参照《中国药典2015年版四部》9101药品质量标准分析方法指导原则的相关要求，供试品溶液稳定性良好。

②提取方法比较

取明胶空心胶囊1g，精密称定，置50ml离心管中，加60℃的水10ml，立即涡旋振荡使供试品溶解，共制备5份，然后分别40℃超声20分钟，60℃超声20分钟，50℃超声15分钟，50℃超声20分钟，50℃超声25分钟，之后制备供试品溶液，分别进样后测定供试品中苯甲酸和山梨酸的峰面积。具体结果如下表13所示。

表13

参照《中国药典2015年版四部》9101药品质量标准分析方法指导原则的相关要求，结合上表中数据可以看出，供试品提取时超声温度及时间小范围的变动对试验结果并无显著影响。

③色谱条件比较

取同一份供试品溶液、同一份1μg/ml苯甲酸对照品溶液和同一份5μg/ml山梨酸对照品溶液，改变色谱条件，取上述溶液各进样一次，记录色谱图。具体结果如下表14所示。

表14

参照《中国药典2015年版四部》9101药品质量标准分析方法指导原则的相关要求，结合上表中数据可以看出，柱温、进样量、流动相比例、流速等色谱条件小范围的变动对试验结果并无显著影响。

另取柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm的色谱柱进行试验，发现山梨酸与相邻杂质峰的分离度不符合要求，故本实施例中要求使用柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm的色谱柱。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。