一种从光果甘草渣中提取光甘草定并分离纯化的方法

摘要

本发明公开了一种从光果甘草渣中提取光甘草定并分离纯化的方法，以光果甘草渣为原料，采用氯化胆碱/丙酸低共熔溶剂在超声辅助下提取光甘草定，提取液经乙酸乙酯萃取，萃取剂相经梯度旋蒸得光甘草定粗提物，光甘草定粗提物使用大孔树脂吸附分离纯化，达到了较高的光甘草定纯度和回收率；提取液相经乙醇沉降、离心得低聚木糖，上清液旋蒸后加入去离子水沉降、离心得木质素，上清液进一步通过反渗透膜去除水分，回收低共熔溶剂。本发明的从光果甘草渣中提取并纯化光甘草定的方法，采用绿色低共熔溶剂，实现光甘草定、低聚木糖和木质素的分离纯化，同时回收低共熔溶剂，提取效率高，绿色环保。

说明书

技术领域

本发明属于中药或植物中功能组分的提取、分离纯化技术领域，具体涉及一种从光果甘草渣中提取光甘草定及提取液分离纯化的方法。

背景技术

光果甘草为豆科双子叶植物，含有甘草酸、三萜皂苷、甘草苷、异甘草苷、多糖等物质，具有抗炎、抗菌、美白等功效。光果甘草经工厂提取甘草酸后产生大量光果甘草渣，其中仍有许多如黄酮类的小分子功效组分，其中光甘草定是光果甘草中的主要黄酮类成分之一，且仅存在于光果甘草中，具有抗氧化、降血压、降血脂、抗炎等药理作用；因能有效抑制黑色素生成过程中多种酶的活性，具有很强的抗自由基老化作用，在化妆品行业中广泛应用，市场空缺大，极具开发价值，已有文献报道甘草渣中确实有含量可观的光甘草定，值得对甘草渣进行二次提取。

低共熔溶剂(deep eutectic solvent，DES)是近年来由Abbott等发现的一种可替代传统有机溶剂和离子液体的绿色溶剂，是指由一定化学计量比的氢键受体(如季铵盐)和氢键供体(如酰胺、羧酸和多元醇等化合物)组合而成的两组分或三组分低共熔混合物，其凝固点显著低于各个组分纯物质的熔点。低共熔溶剂作为一类高效绿色的溶剂逐渐应用于中药小分子资源性成分的提取中，低共熔溶剂提取光甘草定或分离黄酮类物质尚处于探索之中。

公开号为CN112645919A的专利报道了一种植物中黄酮类化合物的提取方法，以各种植物为原料，主要采用的工艺是以低共熔溶剂为提取溶剂，高速剪切机多次提取离心，上清液即为黄酮类化合物。该工艺偏重于黄酮类化合物的提取方法，没有进行分离纯化，且原料处理量少，不易扩大，难以实现工业化，并且没有考虑提取后低共熔溶剂的回收，提取成本高且污染环境。

公开号为CN107312047A的专利报道了一种从红景天中同步分离制备红景天苷和洛塞维的方法，以红景天根为原料，粉碎过筛为粒度大于60目得红景天粉末，使用加入5-30倍红景天重量的添加有0.5％-10％的低共熔溶剂的乙醇水溶液中进行回流提取，提取液浓缩、离心，上清液用混合大孔树脂膨胀床吸附，水清洗，5％-25％乙醇洗脱红景天苷，得红景天苷粗提取液；40％-80％乙醇溶液洗脱洛塞维，得洛塞维粗提取液。红景天苷粗提液和洛塞维粗提液分别用混合树脂膨胀床二次分离纯化，红景天苷用5％-40％乙醇洗脱，浓缩干燥得红景天苷提取物；洛塞维用30％-95％乙醇洗脱，浓缩干燥得红景天苷提取物。该工艺同时使用了低共熔溶剂、乙醇、水三种溶液混合为提取溶剂，溶剂成分复杂，且未考虑对各成分进行回收，浪费试剂，污染环境。工艺中使用了两次树脂分离纯化，耗时长。

公开号为CN108619202A的专利报道了一种低共熔溶剂提取、大孔吸附树脂分离纯化牛蒡叶总黄酮的方法，以牛蒡叶为原料，首先使用含水率为0％-50％的低共熔溶剂按料液比10-40：1mg/mL、35-80℃、超声功率150-350W，超声辅助20-50min，提取液抽滤得粗提物。粗提物使用大孔吸附树脂分离纯化，浓缩干燥得牛蒡叶总黄酮。该工艺同样没有对低共熔溶剂进行回收。

综上所述，现有技术中有关低共熔溶剂提取中药或植物中黄酮类化合物的研究中，大多关注低共熔溶剂对黄酮类化合物的提取率，对提取液中黄酮类化合物的分离纯化，以及低共熔溶剂的回收利用未予以关注。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种从光果甘草渣中提取光甘草定及提取液分离纯化的方法，采用低共熔溶剂提取光果甘草渣，对提取液中的光甘草定进行分离纯化，并对低共熔溶剂进行回收；所述方法操作工艺简单、回收率高。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案实现的：

一种从光果甘草渣中提取光甘草定并分离纯化的方法，包括以下步骤：

(1)提取溶剂的制备：将丙酸与氯化胆碱混合搅拌制得低共熔溶剂，加入去离子水，混合均匀制备成提取溶剂。

(2)提取：光果甘草渣烘干、粉碎、过筛；将光果甘草渣粉末与步骤(1)中制备得到的提取溶剂混合，超声作用下提取0.5-2h，提取温度30-80℃，过滤并收集提取液，得光甘草定粗提液。

(3)萃取：使用萃取剂乙酸乙酯对步骤(2)中所得的粗提液进行萃取，分离萃取剂相和提取液相。

(4)旋转蒸发：萃取剂相经梯度旋转蒸发，直至去除萃取剂和残留的提取溶剂，得光甘草定粗分离物。

(5)树脂分离纯化：将步骤(4)所得的光甘草定粗分离物用乙醇溶解，选用大孔树脂D101、LS-6、LS-200、LS-21和LS-1180对上述溶解液中的光甘草定进行分离纯化，得光甘草定提取物。

(6)低共熔溶剂的回收：向步骤(3)所得的提取液相中加入乙醇溶液沉降，离心，得沉淀和上清液，收集沉淀为低聚木糖；将上清液旋转蒸发至无乙醇得浓缩液，加去离子水沉降，离心，得沉淀和上清液，收集沉淀为木质素；将上清液进一步通过反渗透膜，除去水，回收低共熔溶剂。

所述的方法中，步骤(1)所述的低共熔溶剂中氢键受体为氯化胆碱，氢键供体为丙酸，氯化胆碱与丙酸的摩尔比为1：2-4，优选为1：4；提取溶剂加入去离子水的体积百分数为10-30％。

所述的方法中，步骤(2)光果甘草渣粉末与提取溶剂的料液比优选为1：20-40mg/mL。提取温度优选为60-80℃。

所述的方法中，步骤(3)所述萃取剂的用量为粗提液的1-4倍，萃取1-3次。优选地，所述萃取剂的用量为粗提液的2倍。

所述的方法中，步骤(4)所述的梯度旋转蒸发的温度包括40-60℃和70-100℃两个范围内的梯度温度。优选地，旋转蒸发温度为50-60℃和80-90℃。

所述的方法中，步骤(5)所述的大孔树脂优选为LS-21。

所述的方法中，步骤(5)所述的溶解光甘草定粗分离物的乙醇体积分数为50％-70％，树脂分离时吸附流速1-4BV/h，洗脱流速为1-4BV/h，洗脱液为体积分数为70％-95％乙醇溶液。

所述的方法中，步骤(6)所述的乙醇溶液体积为提取液相的1-4倍，去离子水体积为浓缩液的1-4倍。

有益效果：本发明的一种从光果甘草渣中提取光甘草定并分离纯化方法，以光果甘草渣为原料，利用低共熔溶剂进行提取，通过溶剂萃取结合大孔树脂吸附分离，得光甘草定，同时利用简单的醇沉和水沉实现低聚木糖和木质素的提取利用，并实现低共熔溶剂的回收。整个工艺中实现了光甘草定、低聚木糖和木质素三种物质的分离纯化，并且实现了溶剂回收，操作简单，易于扩大，利于工业化推广。

1)本发明利用超声辅助低共熔溶剂氯化胆碱/丙酸对光果甘草渣中的光甘草定进行提取，光甘草定提取率高；提取液经乙酸乙酯萃取，大孔树脂吸附分离纯化，达到了较高的光甘草定纯度和回收率，实现了从低共熔溶剂中分离纯化光甘草定，分离纯化工艺简单，节能高效。

2)经萃取后的低共熔溶剂通过简单的醇沉和水沉步骤，可直接得到低聚木糖和木质素，再经反渗透膜去除水分，便实现低共熔溶剂的回收，绿色环保，安全节能。

附图说明

图1本发明的光果甘草渣中提取光甘草定并分离纯化方法的工艺流程图。

图2不同提取溶剂对光果甘草渣中光甘草定的提取率。

图3乙酸乙酯用量对光果甘草渣提取液中光甘草定萃取率的影响。

图4不同大孔树脂对光甘草定分离纯化的影响。

具体实施方式

为了对本发明的技术方案作更清楚的描述，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1：光甘草定的提取

(1)提取溶剂的制备：氯化胆碱与丙酸按摩尔比1：2-4在水浴磁力搅拌锅中常温搅拌0.5h，得到透明均一的低共熔溶剂，按体积百分数为10％、20％、30％加入去离子水，配置成提取溶剂。

(2)提取：取2kg光果甘草渣60℃干燥12h，粉碎，过80目筛，得到光果甘草渣粉末。分别取2g光果甘草渣粉末于100mL锥形瓶中，按料液比1：20、1：30或1：40mg/mL加入步骤(1)配置好的提取溶剂，提取溶剂分1-3次加入，30-80℃超声辅助提取0.5-2h，抽滤，得到光甘草定粗提液，HPLC测定其中光甘草定的含量，计算提取率，光甘草定的提取率为0.45-0.6mg/g。其中，提取率＝(粗提液体积*粗提液光甘草定浓度)/甘草渣重量。

实施例2：提取溶剂的筛选和提取条件

(1)提取溶剂的制备：将氯化胆碱分别和甲酸、乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酸按照摩尔比为1：4混合，室温下搅拌30min得到透明均一的低共熔溶剂，按体积百分数为20％加入去离子水，配置成提取溶剂。另配制90％乙醇作为提取溶剂。

(2)提取：取2kg光果甘草渣60℃干燥12h，粉碎，过80目筛，得到光果甘草渣粉末。取2g光果甘草渣粉末于100mL锥形瓶中，按料液比1：20mg/mL分别加入提取溶剂，60℃提取1h，抽滤，得到光甘草定粗提液，HPLC测定光甘草定含量，计算提取率，结果如图2所示。

由图2可知，提取溶剂中只有氯化胆碱/丙酸的提取率在0.45mg/g以上，且除丙酸、乙酸、乳酸与氯化胆碱的低共熔溶剂外，部分低共熔溶剂尚达不到90％乙醇溶剂的提取率。当低共熔溶剂的体系为氯化胆碱/丙酸时，对光甘草定的提取效果最佳，光甘草定的提取率为0.48mg/g。相比传统溶剂90％乙醇(为0.33mg/g)，提取率显著提高。

以低共熔溶剂氯化胆碱/丙酸和水的混合液为提取溶剂，当氯化胆碱与丙酸按摩尔比1：4，其中水体积百分数为10％，料液比1：20mg/mL，提取温度70-80℃的条件下，提取90min，光甘草定的提取率可达0.6mg/g。

实施例3：萃取剂的筛选和萃取剂用量

(1)提取溶剂的制备：氯化胆碱与丙酸按摩尔比1：4在水浴磁力搅拌锅中常温搅拌0.5h，得到透明均一的低共熔溶剂，按体积百分数为10％加入去离子水，配置成提取溶剂。

(2)提取：取2kg光果甘草渣60℃干燥12h，粉碎，过80目筛，得到光果甘草渣粉末。取10g光果甘草渣粉末于500mL锥形瓶中，按料液比1：20mg/mL加入步骤(1)配置好的提取溶剂，40℃超声辅助提取1h，抽滤，得到光甘草定粗提液，光甘草定的提取率为0.49mg/g。

(3)萃取：分别取石油醚、环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷对光甘草定粗提液中的光甘草定进行萃取，粗提液与萃取剂的体积比均为1：3，分离萃取剂相和提取液相。HPLC测定萃取剂相和提取液相中光甘草定的含量，计算萃取率，萃取率＝(萃取液体积*萃取液光甘草定浓度)/(粗提液体积*粗提液光甘草定浓度)*100％。

其中，乙酸乙酯的萃取效果最好，光甘草定的萃取率为84.74％。二氯甲烷萃取效果远低于乙酸乙酯，萃取率仅为21.84％。石油醚、环己烷、正己烷对光甘草定几乎无萃取效果。

以乙酸乙酯为萃取剂，改变萃取剂用量，使用光甘草定粗提液1-4倍体积的乙酸乙酯进行萃取，结果如图3所示，光甘草定的萃取率均达到80％以上，乙酸乙酯最佳的使用量为光甘草定提取液的两倍，光甘草定的萃取率为89.28％。

实施例4：大孔树脂的筛选

(1)提取溶剂的制备：氯化胆碱与丙酸按摩尔比1：4在水浴磁力搅拌锅中常温搅拌1h，得到透明均一的低共熔溶剂，按体积百分数为10％加入去离子水，配置成提取溶剂。

(2)提取：取5kg光果甘草渣60℃干燥12h，粉碎，过80目筛，得到光果甘草渣粉末。取12g光果甘草渣粉末于500mL锥形瓶中，按料液比1：20mg/mL加入步骤(1)配置好的提取溶剂，60℃超声辅助提取1.5h，抽滤，得到光甘草定粗提液，光甘草定的提取率为0.47mg/g。

(3)萃取：使用光甘草定粗提液2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离萃取剂相和提取液相。

(4)旋转蒸发：萃取剂相经60℃和80℃梯度旋转蒸发，真空浓缩至去除萃取剂和残留的提取溶剂，得光甘草定粗分离物。梯度旋转蒸发一方面保证大孔树脂有效地吸附和分离，另一方面分离乙酸乙酯中的DES，实现乙酸乙酯和DES回收。

(5)大孔树脂吸附分离纯化：将步骤(4)所得的光甘草定粗分离物加入50％乙醇溶解得溶解液。分别称取树脂各1g于50mL锥形瓶中，树脂选自D101、LS-8、LS-21、LS-5、D101B、LS-1180、LS-200、LS-10、LS-38、LS-T83、LS-3020和LS-6。各锥形瓶中分别加入20mL光甘草定粗分离物的50％乙醇溶解液，25℃，120r/min水浴震荡吸附24h，取出溶液，去离子水清洗树脂至水清澈，去除树脂表面的水，加入80％乙醇30mL，25℃，120r/min水浴震荡解吸24h。

HPLC测定乙醇溶液中光甘草定的含量，计算光甘草定的吸附率、解析率和回收率。其中，吸附率＝(溶解液中光甘草定浓度-吸附平衡时溶解液中光甘草定浓度)*溶解液体积/(溶解液中光甘草定浓度*溶解液体积)*100％，解析率＝(解吸液体积*解吸液中光甘草定浓度)/((溶解液中光甘草定浓度-吸附平衡时溶解液中光甘草定浓度)*溶解液体积)*100％，回收率＝(解吸液体积*解吸液中光甘草定浓度)/(溶解液中光甘草定浓度*溶解液体积)*100％。结果如图4所示。

由图4可知，上述的大孔树脂中，D101、LS-6、LS-200、LS-21和LS-1180的吸附量在2.4mg/g以上，回收率在60％以上，可用于光甘草定的分离纯化。LS-5、D101B、LS-10、LS-38、LS-T83、LS-3020和LS-8对光甘草定的回收率均在60％以下。不同极性、不同孔径的大孔树脂对光甘草定的纯化效果有显著影响。

其中，树脂LS-21具有最佳的纯化效果，光甘草定吸附量为2.73mg/g(吸附率94.89％)，解析量为2.38mg/g(解析率91.22％)，回收率为73.85％。光甘草定为极性化合物，LS-21为苯乙烯型极性树脂，极性相近，孔径适当，使得LS-21树脂对光甘草定的吸附效果比其它非极性和强极性的树脂吸附效果好。

对比例1

(1)提取溶剂的制备：氯化胆碱与丙酸按摩尔比1：4在水浴磁力搅拌锅中常温搅拌1h，得到透明均一的低共熔溶剂，按体积百分数为10％加入去离子水，配置成提取溶剂。

(2)提取：取5kg光果甘草渣60℃干燥12h，粉碎，过80目筛，得到光果甘草渣粉末。取12g光果甘草渣粉末于500mL锥形瓶中，按料液比1：20mg/mL加入步骤(1)配置好的提取溶剂，60℃超声辅助提取1.5h，抽滤，得到光甘草定粗提液，光甘草定的提取率为0.47mg/g。

(3)萃取：使用光甘草定粗提液2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离萃取剂相和提取液相。

(4)旋转蒸发：萃取剂相经60℃旋转蒸发，得到光甘草定粗分离物，包含未去除的微量液体。

(5)大孔树脂吸附分离纯化：将所得的光甘草定粗分离物加入50％乙醇溶解得溶解液。称取1g LS-21树脂于50mL锥形瓶中，取20mL上述光甘草定粗分离物的乙醇溶解液，25℃，120r/min水浴震荡吸附24h，取出溶液，去离子水清洗树脂至水清澈，去除树脂表面的水，加入80％乙醇30mL，25℃，120r/min水浴震荡解吸24h。

HPLC测定乙醇溶液中光甘草定的含量，LS-21树脂对光甘草定的吸附量为0.558mg/g，解析量为0.238mg/g，回收率为31.2％。

实施例5：光甘草定的提取和分离纯化

(1)提取溶剂的制备：氯化胆碱与丙酸按摩尔比1：4在水浴磁力搅拌锅中常温搅拌1.5h，得到透明均一的低共熔溶剂，按体积百分数为10％加入去离子水，配置成提取溶剂。

(2)提取：取1kg光果甘草渣60℃干燥12h，粉碎，过60目筛，得到光果甘草渣粉末。取25g光果甘草渣粉末于1L锥形瓶中，按料液比1：20mg/mL加入步骤(1)配置好的提取溶剂，60℃超声辅助提取2h，抽滤，得到光甘草定粗提液，光甘草定的提取率为0.45mg/g。

(3)萃取：使用光甘草定粗提液2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离萃取剂相和提取液相。

(4)旋转蒸发：萃取剂相经60℃和90℃梯度旋转蒸发，真空浓缩至去除萃取剂和残留的提取溶剂，得光甘草定粗分离物。

(5)大孔树脂吸附分离纯化：将步骤(4)所得的光甘草定粗分离物后加入50％乙醇溶解得溶解液。称取5g LS-21大孔吸附树脂装入树脂柱(1.5cm×50cm)中，加入50％乙醇溶解液进行吸附，流速2BV/h，吸附完成后，用去离子水洗至水清澈，再用体积分数为90％的乙醇洗脱光甘草定，收集光甘草定洗脱液，洗脱液经旋转蒸发浓缩成浸膏，光甘草定的回收率为75.23％。

实施例6：低聚木糖和木质素的提取和低共熔溶剂的回收

(1)提取溶剂的制备：氯化胆碱与丙酸按摩尔比1：4在水浴磁力搅拌锅中常温搅拌1h，得到透明均一的低共熔溶剂，按体积百分数为10％加入去离子水，配置成提取溶剂。

(2)提取：取2kg光果甘草渣60℃干燥12h，粉碎，过60目筛，得到光果甘草渣粉末。取20g光果甘草渣粉末于1L锥形瓶中，按料液比1：30加入步骤(1)配置好的提取溶剂，60℃超声辅助提取2h，抽滤，得到光甘草定粗提液，光甘草定的提取率为0.46mg/g。

(3)萃取：使用光甘草定粗提液2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分离萃取剂相和提取液相。

(4)-(5)：对于萃取剂相，按照与实施例4相同的方法分离纯化，得到光甘草定。

(6)低共熔溶剂的回收：步骤(3)分离出提取液相，加入3倍体积的乙醇，摇匀，静置沉降48h，离心15min，转速7000r/min，收集第一次沉淀，稀硫酸水解后经液相检测为低聚木糖。上清液旋转蒸发回收乙醇后，加入3倍体积的去离子水，搅拌均匀，静置沉降48h，离心15min，转速7000r/min，收集第二次沉淀，经酸水解，过滤，滤液使用紫外分光光度计测量酸溶性木质素，滤渣经马弗炉575℃烧6h后测定为酸不溶性木质素。上清液过反渗透膜，去除水分，回收得到低共熔溶剂。