蜱媒病原体多样性的分析方法

摘要

本发明提供一种蜱媒病原体多样性的分析方法，属于分子生物学技术领域，包括标本采集；标本的DNA提取；蜱媒病原体的初筛，初筛是通过对所述DNA进行特异性引物设计和PCR扩增完成检测和筛选；测序；生物信息分析，生物信息包括同源性分析，构建系统进化树，以及对不同寄生蜱虫的复合感染状况构成进行统计和分析。该分析方法在微生物多样性分析中的用途，优选为病原体多样性分析。本发明的分析方法用以解决对蜱虫的寄生动物和病原体多样性，以及病原体复合感染情况缺乏系统分析和基因层面的研究的问题；分析结果的可靠性和准确性高，有利于展开蜱媒传染病针对性的预防控制工作，能进一步控制和减少蝉媒介微生物导致的疾病的发生。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种蜱媒病原体多样性的分析方法。

背景技术

蜱是哺乳类动物体表专性寄生的吸血节肢动物，也是多种人兽共患传染病的重要传播媒介。蜱作为一种吸血寄生虫，不但可以游离存活在自然界内，还可以寄生于人和牛、羊、马、骆驼、鼠等动物体表。虽然蜱媒传染病多为自然疫源性疾病，但因其动物宿主、传播媒介分布广泛，易在自然界流行。

蜱媒传染病的病原体种类繁多，包括病毒、细菌和寄生虫等。由于蜱的寄生宿主多样，且可以同时携带多种病原体，因此引起复合感染的几率也随之增大。近年来，一些新发和再发的蜱媒疾病，如发热伴血小板减少综合征、人粒细胞无形体病、单核细胞埃立克体病和新型回归热等在我国及周边国家和地区不断出现，引起世界的关注。蜱媒传染病在感染早期临床特征较为轻微，往往容易忽视；晚期则会导致关节变形、下肢肌肉萎缩，严重者可引起人体多系统、多器官的损害，甚至导致终生残疾或死亡。

内蒙古中西部地处我国北部，与蒙古国接壤，东西跨度较大，生态环境主要以草原、半荒漠草原和戈壁为主，种类繁多的牲畜牧养使其成为蜱类的主要滋生地和最好的栖息场所，蜱媒传染病的流行风险增加。内蒙古地区近年来陆续从蜱体内分离出莱姆病螺旋体、斑点热群立克次体等新发传染病，从而证实蜱媒传染病的存在。

有蜱类存在的地区人兽共患病的发病率往往很高，而由于目前对蜱类病原体的检测方法和技术不完善，病原体种类多且分布多样，检测准确性仍有待提高，因此针对蜱类的病原体及蜱媒传染病的科学检测与分析还有待深入研究和探索。为了对蜱虫的寄生动物和病原体多样性，以及可能存在的病原体复合感染情况进行系统分析和基因层面的研究，提供一种可靠准确的涉及基因层面的蜱媒病原体多样性的分析方法。

发明内容

本发明提供一种蜱媒病原体多样性的分析方法，用以解决对蜱虫的寄生动物和病原体多样性，以及可能存在的病原体复合感染情况缺乏系统分析和基因层面的研究的问题。该分析方法提高结果的可靠性和准确性，深入地挖掘了蜱媒传染病的病原体的多样性，方便相关人员进一步了解蜱媒传染病的流行病学特点及传播规律，更有利于展开蜱媒传染病针对性的预防控制工作，能进一步控制和减少蝉媒介微生物导致的疾病的发生。

第一方面，本发明提供一种蜱媒病原体多样性的分析方法，包括：

S1、标本采集；

S2、标本的DNA提取；

S3、蜱媒病原体的初筛，上述初筛是通过对上述DNA进行特异性引物设计和PCR扩增完成检测和筛选；

S4、测序；

S5、生物信息分析，上述生物信息包括同源性分析，构建系统进化树，以及对不同蜱虫的复合感染状况构成进行统计和分析。

通过以上技术方案，通过对蜱虫的采集、提取、初筛、测序和分析，从基因层面研究了蜱虫的寄生动物和病原体多样性，以及病原体复合感染情况，检测高效、精度高，能实现对样本中的多种不同目的分子进行同时检测，更大限度的保留样品的多样性，缩小偏向性和误差性，大大降低检测分析成本，提高了分析鉴定准确率和检出率。

在具体实施方案中，步骤S1中标本包括游离蜱虫和寄生在家畜及其他动物体表的寄生蜱虫；游离蜱虫标本采用布旗法采集，寄生蜱虫标本采用畜体检法采集。优选地，蜱虫标本的采集期为每年蜱虫活跃高峰期，即每年的4-6月份。

在具体实施方案中，步骤S2中DNA提取的步骤包括：将采集到的蜱虫标本使用次磷酸钠和75％的乙醇加碘伏，浸泡5-10min，消毒后用无菌水清洗自然干燥，然后利用体视显微镜逐一进行解剖，摘出唾液腺保存于PBS溶液，并使用基因组提取试剂盒进行DNA提取，所提取的DNA保存于-20℃。

在具体实施方案中，步骤S3中，初筛步骤的靶基因包括：柠檬酸合成酶gltA，鞭毛蛋白flaB，磷酸二酯酶glpQ，外膜蛋白质omp1和主要表面蛋白msp2。

在具体实施方案中，步骤S3中设计的特异性引物包括正向引物组和反向引物组；上述正向引物组由以下正向引物中的一条或多条组成：

引物F1：其引物序列为5′-CGAACTTACCGCTATTAGAATG-3′；

引物F2：其引物序列为5′-TGGTGGAGCTCATAAGTTACA-3′；

引物F3：其引物序列为5′-GCTAAGGAGTTAGCTTATGA-3′；

引物F4：其引物序列为5′-ATYAGTGSAAARTAYRTRCCAA-3′；

引物F5：其引物序列为5′-GCTGAAGAGCTTGGAATGCACC-3′；

引物F6：其引物序列为5′-CATACGCTTCTGCYTTRGGMGCTGA-3′；

上述反向引物组由以下反向引物中的一条或多条组成：

引物R1：其引物序列为5′-CTTTAAGAGCGATAGCTTCAAG-3′；

引物R2：其引物序列为5′-AGTTACATTTCCTGCACCTAC-3′；

引物R3：其引物序列为5′-AGAAGATCATAACAAGCATTG-3′；

引物R4：其引物序列为5′-TTARAARGYAAAYCTKCCTCC-3′；

引物R5：其引物序列为5′-TGATCAGTATCATTCTAATAGCA-3′；

引物R6：其引物序列为5′-GCAACCTGTGYCATACCTTCTTSTG-3′。

在具体实施方案中，步骤S3中PCR扩增的25μL反应体系含有：5×buffer 4μL，5.0mM dNTP 1μL，0.1-0.2mM巯基乙胺，0.15-0.25mM茶碱，10μM正向引物和反向引物对应形成的引物对混合液各0.5μL，基因组DNA 100ng，余量为dH

PCR扩增的模板分子的碱基偏好会导致扩增效率低，得到更多的扩增片段和重复序列，进而导致一些序列片段信息丢失，扩增产量降低，使得电泳出现非特异性条带，结果准确度降低。在扩增体系中加入的巯基乙胺和茶碱可能发挥了协同效应，提高了PCR的特异性反应，抑制GC碱基配对，促进引物与模板有效结合，提高了扩增效率和扩增产量，减少重复序列的产生，能提供更多的序列信息量，进而缩小偏向性和误差性，提高分析鉴定和多样性评价结果的准确性。

在具体实施方案中，步骤S3中PCR扩增的条件如下：94℃变性15-30s，53-55℃退火15-30s，70-72℃延伸30s，循环数35个。

在具体实施方案中，步骤S5中构建系统进化树采用邻接法，重复参数设置为100次，Bootstrap设置为1000。

第二方面，本发明还提供一种上述蜱媒病原体多样性的分析方法在微生物多样性分析中的用途，上述微生物多样性分析包括病原体多样性分析。该分析方法适用于常规样品、微量样品等多种微生物样本，将不同微生物样本通过采集、提取、初筛、测序和分析，能用以保证样本丰富性以及样本不同物种丰度的真实性，能扩大微生物多样性研究的应用范围。

优选地，微生物多样性分析的微生物的实例包括但不限于：细菌、真菌、古菌、病原体、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、放线菌等。

在具体实施方案中，微生物样本的基因组DNA的质量不低于1ng，上述基因组DNA由微生物样本进行裂解或抽提获得。优选地，微生物样本的基因组DNA的质量为10-500ng。

本发明提供的蜱媒病原体多样性的分析方法，通过基因层面检测及系统进化分析的手段，实现如下的有益效果：

1)该方法深入地挖掘了蜱媒传染病潜在的传播规律，方便相关人员进一步了解蜱媒传染病的流行病学特点及传播规律，更有利于展开蜱媒传染病针对性的预防控制工作，能进一步控制和减少蝉媒介微生物导致的疾病的发生。

2)该方法取样简单，检测高效、精度高，检测结果准确性高；同时对多个样本进行初筛、测序和分析，能更大限度的保留样品的多样性，更加全面地分析样本组成，缩小传统调查方法的偏向性和误差性，提高了分析鉴定准确率和检出率，能较好反应蜱虫的寄生动物和病原体的分布差异和多样性，以及病原体复合感染情况，是可靠的多样性分析调查技术。

3)该方法灵活性好，重复性好，可以根据需要修改和/或加减检测病原体的种类，能对样本中的多种不同目的分子同时进行检测，大大降低检测分析成本，能应用于微生物样本的质量监测、流行病学调查及早期预警。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为蜱媒立克次体gltA基因片段的系统进化分析图；

图2为蜱媒立克次体rOmpA基因片段的系统进化分析图；

图3为蜱媒埃立克体omp1基因片段的系统进化分析图；

图4为蜱媒疏螺旋体flaB基因片段的遗传进化分析图；

图5为不同寄生蜱虫的复合感染状况构成示意图；

图6为不同实验组别的PCR产物的电泳图，A-实施例1，B-对比例1，C-对比例2，D-对比例3。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，也属于本发明保护的范围。

本发明中PCR扩增中使用的各种特异性引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成。试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)购自德国Qiagen公司，PCR试剂、DNA回收纯化试剂盒购自日本TaKaRa公司，TA克隆试剂盒购自Thermo Fisher公司，DNA标志物购自天根生化科技(北京)有限公司，大肠埃希菌(Escherichia coli)感受态细胞DH5α购自日本TOYOBO公司，RsaⅠ和AluⅠ酶均购自美国NEB公司。

在更具体实施方案中，步骤S3中，采用灵敏度和特异性较高的靶基因检测蜱虫携带的病原体并进行PCR初筛。具体的，斑点热立克次体以柠檬酸合成酶A(citratesynthase，gltA)，疏螺旋体以鞭毛蛋白B(flagellin gene B，flaB)、磷酸二酯酶(glycerophosphodiester phosphodiesterase，glpQ)，埃立克体属以外膜蛋白质1(outermembrane protein 1，omp1)，无形体属以主要表面蛋白2(major surface protein 2，msp2)等基因作为靶基因。

在更具体实施方案中，步骤S4测序中，立克次体gltA基因初筛阳性样品用RsaⅠ和AluⅠ进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分类，再进行gltA基因测序，并扩增立克次体外膜蛋白A(Rickettsia outer membraneprotein A，rOmpA)基因进行测序确认。

在更具体实施方案中，步骤S4测序中，按照DNA回收纯化试剂盒说明回收无形体msp2和埃立克体属omp1基因扩增条带，连接至pCR2.1载体上，转化大肠埃希菌，在含有IPTG和X-gal的平板上筛选分离阳性克隆；大量培养后提取质粒，EcoRⅠ酶切确认插入片段后，送南京金斯瑞生物科技公司进行双向测序。

在更具体实施方案中，步骤S5生物信息分析中，在NCBI上进行BLAST同源性比对，使用MEGA7.0、Clustal W进行同源性分析，用邻接法构建系统进化树，重复参数设置为100次，Bootstrap设置为1000；同时对蜱虫的寄生动物和病原体多样性分布情况、不同寄生蜱虫的复合感染状况构成进行统计和分析。

在更具体实施方案中，微生物样本的基因组DNA不限于由微生物样本进行裂解或抽提获得，也能采用由他人利用本领域所熟知的技术已经由微生物样本裂解获得或由微生物样本抽提获得的样本基因组DNA。进一步地，提供基因组DNA的微生物样本的细胞是原核细胞或真核细胞。

除非另外说明，本发明中未详细说明的所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术，所用的仪器设备、试剂材料等，均为本领域技术人员使用的常规仪器设备和常规试剂材料。如采用试剂盒使用等均按照相应试剂盒的说明书操作。在此不再赘述。

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

一种蜱媒病原体多样性的分析方法，包括以下步骤：

1)标本采集：在蜱虫活跃高峰期(4-6月)，于环境中采集蜱虫标本，上述蜱虫标本包括游离蜱虫和寄生在家畜及其他动物体表的寄生蜱虫。游离蜱虫标本采用布旗法采集，寄生蜱虫标本采用畜体检法采集。记录采集时间、地点、方法、宿主种类等信息。

其中，蜱虫标本采集地区包括锡林郭勒盟、乌兰察布市、巴彦淖尔市、鄂尔多斯市、乌海市和阿拉善盟；采集宿主包括牛、羊、流浪犬、马、骆驼；蜱种包括草原革蜱(Dermacentor nuttalli)、亚东璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)、边缘璃眼蜱(H.marginutum)。

2)标本的DNA提取：将采集到的蜱虫标本使用次磷酸钠和75％的乙醇加碘伏，浸泡5min，消毒后用无菌水清洗自然干燥，然后利用体视显微镜逐一进行解剖，摘出唾液腺保存于PBS溶液，并使用基因组提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)进行DNA提取，所提取的DNA保存于-20℃。

3)蜱媒病原体的初筛：采用灵敏度和特异性较高的靶基因检测蜱虫携带的病原体并进行PCR初筛，初筛包括对上述DNA进行特异性引物设计，PCR扩增，检测和筛选。

具体的，斑点热立克次体以柠檬酸合成酶A(citrate synthase，gltA)，疏螺旋体以磷酸二酯酶(glycerophosphodiester phosphodiesterase，glpQ)、鞭毛蛋白B(flagellin gene B，flaB)，埃立克体属以外膜蛋白质1(outer membrane protein 1，omp1)，无形体属以主要表面蛋白2(major surface protein 2，msp2)等基因作为靶基因。

设计的特异性引物包括正向引物组和反向引物组；上述正向引物组由以下正向引物中的一条或多条组成：

引物F1：其引物序列为5′-CGAACTTACCGCTATTAGAATG-3′；

引物F2：其引物序列为5′-TGGTGGAGCTCATAAGTTACA-3′；

引物F3：其引物序列为5′-GCTAAGGAGTTAGCTTATGA-3′；

引物F4：其引物序列为5′-ATYAGTGSAAARTAYRTRCCAA-3′；

引物F5：其引物序列为5′-GCTGAAGAGCTTGGAATGCACC-3′；

引物F6：其引物序列为5′-CATACGCTTCTGCYTTRGGMGCTGA-3′；

上述反向引物组由以下反向引物中的一条或多条组成：

引物R1：其引物序列为5′-CTTTAAGAGCGATAGCTTCAAG-3′；

引物R2：其引物序列为5′-AGTTACATTTCCTGCACCTAC-3′；

引物R3：其引物序列为5′-AGAAGATCATAACAAGCATTG-3′；

引物R4：其引物序列为5′-TTARAARGYAAAYCTKCCTCC-3′；

引物R5：其引物序列为5′-TGATCAGTATCATTCTAATAGCA-3′；

引物R6：其引物序列为5′-GCAACCTGTGYCATACCTTCTTSTG-3′。

上述PCR扩增的25μL反应体系含有：5×buffer 4μL，5.0mM dNTP 1μL，0.15mM巯基乙胺，0.2mM茶碱，10μM正向引物和反向引物对应形成的引物对混合液各0.5μL，基因组DNA100ng，余量为dH

上述PCR扩增的条件如下：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环数35个。

PCR扩增结束后，使用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用DNA回收纯化试剂盒对合格的PCR产物进行回收、纯化。

4)测序：立克次体gltA基因初筛阳性样品用RsaⅠ和AluⅠ进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分类，再进行gltA基因测序，并扩增立克次体外膜蛋白A(Rickettsia outer membrane protein A，rOmpA)基因进行测序确认。

按照DNA回收纯化试剂盒说明回收无形体msp2和埃立克体属omp1基因扩增条带，连接至pCR2.1载体上，转化大肠埃希菌，在含有IPTG和X-gal的平板上筛选分离阳性克隆；大量培养后提取质粒，EcoRⅠ酶切确认插入片段后，送南京金斯瑞生物科技公司进行双向测序。

5)生物信息分析：测序结束后，在NCBI上进行BLAST同源性比对，使用MEGA7.0、Clustal W进行同源性分析，用邻接法构建系统进化树(如附图1-4)，重复参数设置为100次，Bootstrap设置为1000；同时对蜱虫的寄生动物和病原体多样性分布情况、不同寄生蜱虫的复合感染状况构成进行统计和分析。

其中，立克次体gltA基因序列均为581bp，与R.raoultii(DQ365804)或R.aeschlimanni(KT873466)的同源性为100％；rOmpA基因均长367bp，与R.raoultii(AH015610)或R.aeschlimanni(U83466)的同源性为100％。疏螺旋体flaB基因序列，与目前莱姆病主要病原体B.garinii(AB035602)和B.afzeliiPKo(NC008277)的同源性分别为90.6-100％和95.6-100％。埃立克体属omp1基因序列与E.muris的同源性最高，仅为65-69％。

图1为蜱媒立克次体gltA基因片段的系统进化分析图。图2为蜱媒立克次体rOmpA基因片段的系统进化分析图。图3为蜱媒埃立克体omp1基因片段的系统进化分析图。图4为蜱媒疏螺旋体flaB基因片段的遗传进化分析图。

注：

由图1-4可知，基于立克次体gltA和rOmpA序列以邻接法构建的系统进化树显示，草原革蜱、亚东璃眼蜱和边缘璃眼蜱感染的立克次体，均与R.raoultii和R.aeschlimanni聚在一簇。以埃立克体属菌群omp1序列构建的系统进化树显示，草原革蜱感染的埃立克体属菌与目前已知的埃立克体属菌群关系较远，形成独自的聚类。以疏螺旋体菌群flaB序列的系统进化树显示，在获得的10条序列中，源于草原革蜱和亚东璃眼蜱的1条与B.garinii聚在一簇；草原革蜱的另1条与B.afzelii聚在一簇；剩余8条序列与B.garinii和B.afzelii的flaB基因序列处在不同的分支。

omp1多基因家族是埃立克体属菌群特征性的主要外膜蛋白基因群，其拷贝数在基因组中有22个。OMP1蛋白构造内存在保存完整的氨基酸片段和不完整的片段(超可变领域)，氨基酸序列N端和C端为高保守区，中心区域为可变区域，利用此特点的设计引物可同时扩增散落在基因组里的片段，提高PCR敏感度。本实施例仅从1只蜱样品中检测到omp1基因群，与目前已知的埃立克体属菌群的同源性较低，可能是未发现的新种，有待进一步研究验证。

蜱虫的寄生动物和病原体多样性分布情况统计及分析结果如表1所示，其中采集的蜱虫标本中，游离蜱有3590只，宿主为牛的寄生蜱1695只，宿主为羊的寄生蜱1541只，宿主为流浪犬的寄生蜱621只，宿主为马的寄生蜱1820只，宿主为骆驼的寄生蜱942只。

表1不同寄生蜱携带病原体的多样性分析

不同寄生蜱虫的复合感染状况构成进行统计和分析如图5所示。图5为不同寄生蜱虫的复合感染状况构成示意图。结果显示，游离蜱中1种病原体感染占比为27.5％，复合2种病原体感染占比为21.9％，复合3种病原体感染占比为15.0％，复合4种病原体感染占比为7.4％；牛寄生蜱中1种病原体感染占比为64.7％，复合2种病原体感染占比为3.4％；羊寄生蜱中1种病原体感染占比为68.9％，复合2种病原体感染占比为7.3％，复合3种病原体感染占比为3.0％；骆驼寄生蜱中1种病原体感染占比为79.1％，复合2种病原体感染占比为3.8％；马和流浪犬寄生蜱中1种病原体感染占比分别为59.6％和63.0％。蜱传疾病的复合感染比较多见，游离蜱复合感染率远高于寄生蜱。

对比例1：

一种蜱媒病原体多样性的分析方法，与实施例1的不同之处仅在于：步骤3)中，PCR扩增的25μL反应体系含有：5×buffer 4μL，5.0mM dNTP1μL，10μM正向引物和反向引物对应形成的引物对混合液各0.5μL，基因组DNA 100ng，余量为dH

对比例2：

一种蜱媒病原体多样性的分析方法，与实施例1的不同之处仅在于：步骤3)中，PCR扩增的25μL反应体系含有：5×buffer 4μL，5.0mM dNTP1μL，0.15mM巯基乙胺，10μM正向引物和反向引物对应形成的引物对混合液各0.5μL，基因组DNA 100ng，余量为dH

对比例3：

一种蜱媒病原体多样性的分析方法，与实施例1的不同之处仅在于：步骤3)中，PCR扩增的25μL反应体系含有：5×buffer 4μL，5.0mM dNTP1μL，0.2mM茶碱，10μM正向引物和反向引物对应形成的引物对混合液各0.5μL，基因组DNA 100ng，余量为dH

实验例1：

实验方法：根据实施例1和对比例1-3中的扩增体系，分别取其扩增产物，在相同的条件下，使用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，其电泳图如图6所示。每个实验组别设有3个平行。

图6为不同实验组别的PCR产物的电泳图，A-实施例1，B-对比例1，C-对比例2，D-对比例3。结果显示，实施例1的PCR产物的电泳图清晰、明亮、单一，无非特异性条带产生；说明PCR反应体系中加入巯基乙胺和茶碱可能发挥了协同效应，提高了PCR的特异性反应，抑制非特异性产物的生成，提高了扩增效率和扩增产量，减少重复序列的产生，测序质量较高，缩小偏向性和误差性，提高分析鉴定和多样性评价结果的准确性。

最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。