稳定剂、凝血酶时间测试试剂及其制备方法、试剂盒

摘要

本发明公开了一种稳定剂、凝血酶时间测试试剂及其制备方法、试剂盒，稳定剂包括黄原胶，凝血酶时间测试试剂包括凝血酶、缓冲液和稳定剂；所述稳定剂包括黄原胶，所述黄原胶在所述凝血酶时间测试试剂中的浓度为0.1g/L～10g/L，所述凝血酶的酶活性为1IU/mL～50IU/mL。本发明利用黄原胶大分子的网状结构，显著提高了液体型凝血酶时间测试试剂的稳定性。

说明书

技术领域

本发明涉及医疗检验技术领域，更具体地，涉及一种稳定剂、凝血酶时间测试试剂及其制备方法、试剂盒。

背景技术

凝血酶时间(Thrombin Time，TT)是测定凝血功能检测的一项重要指标，也是术前检查的重要指标。TT测定是检查血浆纤维蛋白原转变为纤维蛋白的能力以及血浆中肝素样物质的多少。增高见于DIC纤溶亢进期，低(无)纤维蛋白原血症，异常血红蛋白血症，纤维蛋白(原)降解产物增高；降低无临床意义。

目前市面上的TT测试试剂大部分为冻干粉，使用前需要进行复溶，操作不便，瓶间精密性无法保证，而液体型试剂可以克服冻干粉带来的缺陷，提高试剂的精密度。但是液体型试剂最主要的成分是凝血酶，凝血酶是一种多功能的丝氨酸蛋白酶，和大多数蛋白酶一样，稳定性相对较差，容易受PH、温度、离子强度等的影响，从而导致酶的空间结构改变影响试剂检测结果的准确性和灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种稳定剂、稳定的液体型凝血酶时间测试试剂及其制备方法和试剂盒。

为实现上述目的，本发明的一种技术方案如下：

一种稳定剂，用于凝血酶时间测试试剂，包括黄原胶。

本发明还公开了一种凝血酶时间测试试剂，包括凝血酶、缓冲液和上述稳定剂；所述黄原胶在所述凝血酶时间测试试剂中的浓度为0.1g/L～10g/L。

本发明还提供了上述凝血酶时间测试试剂的制备方法，包括以下步骤：

制备缓冲液；

将凝血酶和稳定剂溶解在缓冲液中，所述稳定剂包括黄原胶，所述黄原胶在所述凝血酶时间测试试剂中的浓度为0.1g/L～10g/L，得所述凝血酶时间测试试剂。

本发明还公开了一种试剂盒，包括上述的稳定剂，或上述的凝血酶时间测试试剂。

实施本发明实施例，将具有如下有益效果：

本发明实施例通过采用黄原胶为稳定剂，由于黄原胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对凝血酶进行空间限位，降低了凝血酶分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了凝血酶的稳定性；另一方面，黄原胶还具有很强的亲水性，使得水的自由度变小，加强了凝血酶的疏水作用；凝血酶的疏水基团与黄原胶大分子上的疏水基团或孔发生相互作用，使凝血酶吸附到黄原酸大分子上，进一步增加了液体中凝血酶分子的稳定性。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明公开了一种稳定剂，其用于凝血酶时间测试试剂，更进一步的，用于液体型凝血酶时间测试试剂，其包括黄原胶。黄原胶是一种多糖，它是淡黄色粉末状至微粘状的高分子物质，是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛(酸)、乙酸与丙酮组成的“五糖重复单位”复合物，黄原胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对凝血酶进行空间限位，降低了凝血酶分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了凝血酶的稳定性；另一方面，黄原胶还具有很强的亲水性，使得水的自由度变小，加强了凝血酶的疏水作用；凝血酶的疏水基团与黄原胶大分子上的疏水基团或孔发生相互作用，使凝血酶吸附到黄原酸大分子上，进一步增加了凝血酶分子的稳定性。

进一步的，稳定剂还包括蛋白质大分子，蛋白质大分子与黄原胶的质量比为0.1～7:0.02～2，蛋白质大分子能够提供多种氨基酸，用于稳定凝血酶空间结构，以及能阻止凝血酶蛋白表面的吸附，使凝血酶保持稳定。蛋白质大分子可以选自蛋白胨、牛血清白蛋白或明胶中的一种、两种或三种。

进一步的，稳定剂还包括聚醚多元醇，聚醚多元醇与黄原胶的质量比为0.05～2:0.01～1，聚醚多元醇不仅粘度较大，而且亲水性强，能够为凝血酶提供稳定的水分子，保持凝血酶的活性，同时其具有较大粘度，能稳定凝血酶结构。

进一步的，聚醚多元醇的分子量为6000～12000，该分子量范围的聚醚多元醇更适合凝血酶结构的稳定，粘度过大，凝血酶的凝固时间过长，不利于提高检测效率，粘度过小，不利于保持凝血酶活性。

聚醚多元醇，是主链含有醚键(—R—O—R—)，端基或侧基含有大于2个羟基(—OH)的低聚物多元醇，是以低分子量多元醇、多元胺或含活泼氢的化合物为起始剂，与氧化烯烃在催化剂作用下开环聚合而成。氧化烯烃主要是氧化丙烯(环氧丙烷)、氧化乙烯(环氧乙烷)等。多元醇起始剂有丙二醇、乙二醇等二元醇，甘油三羟甲基丙烷等三元醇及季戊、四醇、木糖醇、山梨醇、蔗糖等多元醇，胺类起始剂为二乙胺、二乙烯三胺等。具体的，聚醚多元醇可以为聚乙二醇等。

进一步的，黄原胶与蛋白质大分子以及聚醚多元醇相互协同作用，能够起到更好的效果，不仅具有较高稳定性，不损失凝血酶的活性，而且能提供凝血酶适当的凝固时间，便于提高检测效率和检测精度。

具体的，在本具体实施例中，稳定剂包括黄原胶、蛋白胨、牛血清白蛋白和聚乙二醇，黄原胶、蛋白胨、牛血清白蛋白和聚乙二醇的质量比为0.01～1：0.05～2：0.05～5：0.05～2。

本发明公开了一种凝血酶时间测试试剂，包括凝血酶、缓冲液和上述任一种稳定剂；黄原胶在凝血酶时间测试试剂中的浓度为0.1g/L～10g/L。黄原胶的网状结构能够增强凝血酶构象的稳定性，避免凝血酶失活，提高TT检测的精准性，另，适量的稳定剂也能提供TT试剂更适当的凝固时间，便于提高检测效率。

进一步的，在本具体实施例中，凝血酶的酶活性范围为1IU/mL～50IU/mL。

进一步的，缓冲液包括缓冲剂和溶剂，溶剂可以为去离子水，缓冲液中，缓冲剂的摩尔数占溶剂的体积比为10mM～150mM。缓冲剂可以为tris缓冲剂、mops缓冲剂、popos缓冲剂、hepes缓冲剂、pipes缓冲剂、磷酸缓冲剂或咪唑缓冲剂中的一种、两种或两种以上，在本具体实施例中，缓冲剂优选tris缓冲剂。

进一步的，凝血酶时间测试试剂的pH为6.8～8.0，有利于凝血酶构象的稳定，可以用酸性试剂调节pH值，在本具体实施例中，选用1M的HCl调节tris缓冲剂的pH值至6.8～8.0。

进一步的，TT测试试剂还包括防腐剂，防腐剂的浓度为0.01％～0.03％。防腐剂可以为Proclin 300防腐剂、叠氮钠、庆大霉素或硫柳汞中的一种、两种或多种。防腐剂抑制细菌等，防止凝血酶失活。

进一步的，TT测试试剂还包括钙补充剂，钙补充剂中钙离子的浓度为1mM～50mM，钙补充剂可以为氯化钙或乳钙等，Ca

上述凝血酶时间测试试剂是液体型，可以直接用于半自动或全自动的TT测试仪器中。

上述凝血酶时间测试试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)调配缓冲溶液，将缓冲剂用去离子水溶解得缓冲溶液，调节缓冲溶液的pH值为6.8～8。

2)将稳定剂、防腐剂、钙补充剂和凝血酶加入缓冲溶液中，混合均匀，得TT测试试剂。

本发明还公开了一种试剂盒，其包括上述的稳定剂或上述的凝血酶时间测试试剂。

以下为具体实施例。

实施例1

1)称取8.5g Tris加入到去离子水中，持续搅拌，用1M HCl调节pH值在7.60，定容缓冲液至1000mL。

2)分别加入聚乙二醇6000 1.5g、氯化钙1.1g、牛血清白蛋白20g、蛋白胨15g、黄原胶0.5g、Proclin 300 2.0mL，搅拌30min后再加入12IU/mL的凝血酶，搅拌均匀即可获得TT测试试剂。

检测方法：

使用Stago公司的原装正常质控血浆，在Stago公司的Emo Express全自动血凝仪进行测定，记录血浆凝固时间，即TT测量值，其正常值范围为：14.0s～20.0s。

连续小量生产三批试剂盒，每批随机抽取5瓶测定TT值，每瓶做10次重复，检测结果见下表1：S为标准偏差，X为TT平均值，误差CV＝S/X。

表1：三批试剂盒的TT值测试数据

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于：稳定剂只包括黄原胶。

1)称取8.5g Tris加入到去离子水中，持续搅拌，用1M HCl调节pH值在7.60，定容缓冲液至1000mL。

2)分别加入氯化钙1.1g、黄原胶0.5g、Proclin 300 2.0mL，搅拌30min后再加入12IU/mL的凝血酶，搅拌均匀即可获得TT测试试剂。

检测方法与实施例1相同。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于，稳定剂只包括黄原胶和蛋白胨。

1)称取8.5g Tris加入到去离子水中，持续搅拌，用1M HCl调节pH值在7.60，定容缓冲液至1000mL。

2)分别加入氯化钙1.1g、蛋白胨15g、黄原胶0.5g、Proclin 300 2.0mL，搅拌30min后再加入12IU/mL的凝血酶，搅拌均匀即可获得TT测试试剂。

检测方法与实施例1相同。

对比例1

以现有凝血酶冻干粉为对比例，用缓冲液稀释凝血酶冻干粉，具体如下：

1)称取8.5g Tris加入到去离子水中，持续搅拌，用1M HCl调节pH值在7.60，定容缓冲液至1000mL。

2)加入凝血酶冻干粉(博尔西公司生产，凝血酶冻干粉的活性为100IU/mg)0.12g，搅拌均匀后可获得TT测试试剂，该试剂中凝血酶的活性大约为12IU/mL。

检测方法与实施例1相同。

对比例2

对比例2中的TT测试试剂与实施例1相比，无稳定剂。

1)称取8.5g Tris加入到去离子水中，持续搅拌，用1M HCl调节pH值在7.60，定容缓冲液至1000mL。

2)加入12IU/mL的凝血酶，搅拌均匀即可获得TT测试试剂。

检测方法与实施例1相同。

对比例3

对比例3中的TT测试试剂与实施例1相比，其稳定剂仅包括聚乙二醇、蛋白胨和牛血清白蛋白的稳定剂，无黄原胶。

1)称取8.5g Tris加入到去离子水中，持续搅拌，用1M HCl调节pH值在7.60，定容缓冲液至1000mL。

2)分别加入聚乙二醇6000 1.5g、氯化钙1.1g、牛血清白蛋白20g、蛋白胨15g、Proclin 300 2.0mL，搅拌30min后再加入12IU/mL的凝血酶，搅拌均匀即可获得TT测试试剂。

检测方法与实施例1相同。

测试例1

对实施例1～3和对比例1～3所得的TT测试试剂进行开瓶稳定性试验，将盛装液体型TT测试试剂的容器开口放置在室温下30天，在开口放置的1天、5天、10天、15天、20天、25天及30天时，分别测定TT测试试剂的凝固时间，结果如表2所示。通过计算凝固时间的标准偏差S和变异系数CV，可以反映凝血酶的稳定性，标准偏差S和变异系数CV越大，凝血酶的稳定性越差。TT测试试剂的凝固时间的正常范围为14.0s～20.0s，位于该范围内，说明凝固时间适当，凝固时间大于20.0s，原因可能是凝血酶失活所致。

从表2可以看到：实施例1的标准偏差S和变异系数CV都最小，TT测试试剂的稳定性最强。

实施例2和3与实施例1相比，具有相近的实验结果，说明其稳定性、精密度均较佳。

将实施例1～3与对比例1相比，实施例1～3的实验结果明显优于对比例1，说明本发明的稳定剂以及液体型TT测试试剂相比现有技术具有突出的显著效果。

将实施例2与对比例2相比，不同之处仅在于，实施例2中采用了黄原胶的稳定剂，而对比例2无稳定剂，实验结果显示，实施例2的数据明显优于对比例2，说明黄原胶对TT测试试剂的稳定作用效果更突出。

将实施例2与对比例3相比，不同之处在于，对比例3使用了不同于实施例2的稳定剂，实验结果显示，实施例2的数据明显优于对比例3，说明黄原胶对TT测试试剂的稳定作用效果更突出。

表2：开瓶30天稳定性试验

测试例2

对实施例1～3和对比例1～3所得的TT测试试剂进行模拟运输稳定性试验，高温运输条件下的稳定性试验是指将TT测试试剂密封，并在大于37℃的温度下保存进行运输，运输1天、3天、5天、7天以及10天时，分别测试各试剂的凝固时间，结果如表3所示。低温运输条件下的稳定性试验是将TT测试试剂密封并在低于12℃的温度下保存进行运输，结果如表4所示。

从表3和表4中，可以看到，本发明的实施例1～3的试验数据均明显优于对比例1～3，可见，黄原胶能够明显提高TT测试试剂的稳定性。

表3：高温运输条件下10天稳定性试验

表4：低温运输条件下30天稳定性试验

测试例3

将实施例1～3和对比例1～3所得的TT测试试剂于37℃下开盖放置进行37℃加速破坏稳定性试验，分别在1天、3天、5天、7天、10天、15天、20天、25天及30天时测试TT测试试剂的凝固时间，结果参见表5，可见，本发明的实施例1～3的试验数据均明显优于对比例1～3，可见，黄原胶能够明显提高TT测试试剂的稳定性。

表5：37℃加速破坏试验

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。