脑微血管内皮细胞在制备用于修复血脑屏障损伤的药物中的应用

摘要

本发明公开了脑微血管内皮细胞在制备用于修复血脑屏障损伤的药物中的应用，涉及细胞制剂领域。本发明解决了目前技术下缺血性脑卒中后血脑屏障不可逆开放引发了损伤扩大化，改善了卒中治疗的预后；本发明中的细胞制剂来源广泛，易于获得，且可以快速修复脑血屏障。本发明中的细胞制剂能够靶向至脑缺血部位，可采用简单的静脉注射进行给药便于临床操作。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞制剂领域，具体涉及脑微血管内皮细胞在制备用于修复血脑屏障损伤的药物中的应用。

背景技术

缺血性脑卒中的发病原因是脑血管狭窄或栓塞而导致的局部脑组织受损，其具有高致残率、高致死、高发病率和高复发率等特点，是目前我国三大主要死亡原因。近年来缺血性脑卒中的发病率逐年升高，且发病人群呈年轻化趋势，给患者及其家庭造成了心理和经济上的严重负担。但目前缺血性脑卒中缺少有效治疗手段，鉴于缺血性脑卒中已经事实上影响到了人民健康和社会发展，因而亟需一种有效的治疗方式改善预后。

缺血性脑卒中血脑屏障通透性的变化是缺血型脑卒中病程进展的重要原因。卒中发生后缺血局部由于氧气和葡萄糖等的缺乏引发代谢紊乱，进而导致缺血局部乳酸中毒、细胞外谷氨酸浓度升高、离子通道转运失调、活性氧成分增加，最终导致血管内皮细胞等受损。内皮细胞在受损后细胞骨架发生重排，引起细胞间的紧密连接破坏，导致血脑屏障的功能丧失和局部通透性增加。血脑屏障通透性的增加又会加剧局部水肿和炎症浸润，加重缺血损伤和扩大累及部位。因此若在缺血性脑卒中发生早期及时恢复血脑屏障功能，可以减轻颅内水肿的加重和抑制炎症的进一步发展，改善缺血性卒中的预后。

其中内皮细胞作为血脑屏障的重要功能单位，是促进血脑屏障功能正常化的重要靶点。目前临床使用的治疗药物如依达拉奉和丁苯酞对内皮细胞具有一定保护作用。注射的外源内皮祖细胞也被证明可以分化成为内皮细胞整合进入血脑屏障。但缺血性脑卒中发病迅速，以上治疗措施难以在急性期逆转血脑屏障的损伤。因此一种能够快速恢复受损内皮细胞紧密连接、促进血脑屏障正常化的治疗以改善缺血性脑卒中的预后。

公开号为CN108823145A的专利申请公开了一种人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，该发明提供的技术方案，成功建立了血脑屏障的体外模型，更清楚、准确地反应了血脑屏障的特性。其证明了使用的人脑微血管内皮细胞可在体外参与构成脑血屏障的形成，但对于注射外源内皮细胞参与体内原位脑血屏障修复的应用还未被报道。

探索利用外源性内皮细胞快速介入治疗促进血脑屏障功能正常化的治疗手段，于缺血性脑卒中的治疗有重大意义。

发明内容

本发明提供了脑微血管内皮细胞在制备修复血脑屏障的药物中的应用，可实现缺血性脑卒中后血脑屏障功能的快速恢复。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了脑微血管内皮细胞在制备用于修复血脑屏障损伤的药物中的应用。

所述脑微血管内皮细胞为原代脑微血管内皮细胞或脑微血管内皮细胞系。

优选的，所述脑微血管内皮细胞来源于人、小鼠或大鼠。

优选的，引起血脑屏障损伤的疾病为缺血性脑卒中疾病、创伤性脑损伤、爱因兹海默症或帕金森综合征。

优选的，给药方式为静脉注射。静脉注射时的注射量为0.5×10

本发明还提供了一种用于修复血脑屏障损伤的药物，所述活性成分包括脑微血管内皮细胞。

优选的，所述脑微血管内皮细胞为原代脑微血管内皮细胞或脑微血管内皮细胞系。

优选的，给药方式为静脉注射。静脉注射时的注射量为0.5×10

所述药物在注射后可以靶向至脑卒中病灶部位，作为“补丁”直接整合进入受损的脑血屏障，抑制水肿和炎症浸润，促进血脑屏障功能正常化。

与已有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明解决了目前技术下缺血性脑卒中后血脑屏障不可逆开放引发的损伤扩大化，改善了卒中治疗的预后；本发明中的细胞制剂来源广泛，易于获得，且可以快速修复脑血屏障；本发明中的细胞制剂能够靶向至脑缺血部位，可采用简单的静脉注射进行给药便于临床操作。

附图说明

图1为细胞制剂所用脑微血管内皮细胞系形态图。

图2为细胞制剂在体内的脑缺血病灶部位靶向效果图。

图3为细胞制剂治疗和未经治疗的MCAO小鼠血脑屏障完整性对比图；其中，A为小鼠大脑表面染料分布图；B为小鼠大脑表面染料分布的定量结果图；*p＜0.05。

图4为细胞制剂治疗和未治疗的MCAO小鼠神经功能评分变化情况图。

图5为细胞制剂治疗和未治疗的MCAO小鼠脑切片对比图。

具体实施方式

实施例1

细胞制剂修复大脑中动脉栓塞模型小鼠的损伤的血脑屏障。

1.细胞制剂制备

将鼠源脑微血管内皮细胞培养于175mm

2.动物实验

(1)小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型的建立

MCAO模型是目前缺血性脑卒中最常用模型，其具有缺血部位固定、缺血时间固定、可模拟缺血再灌注损伤(遭受一定时间缺血的组织细胞恢复血流)、手术创伤小等优势，可以一定程度上模拟人类缺血性脑卒中病理过程。其建立过程首先选择20-25g的雄性C57BL/6小鼠，将戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠仰卧固定在手术台上。颈部正中开口，分离颈总动脉，并结扎颈总动脉近心端，远心端打活结，上部用止血夹夹住。将颈总动脉开口后插入线栓至止血夹处，打开止血夹，继续推入线栓至进入颈内动脉约8-10mm，缝合伤口。在缺血1h后拔出线栓，进行再灌注。待小鼠恢复清醒后将其放回饲养环境。

假手术对照(Sham)组建立时在颈总动脉开口后不插入线栓直接缝合。其余过程同MCAO模型建立。

(2)细胞制剂的递送及体内分布

将细胞制剂用细胞膜红色荧光染料(Did)染色，MCAO模型小鼠再灌注4-6h后，每只小鼠尾静脉注射500万步骤(1)制得的鼠源脑微血管内皮细胞。12h后处死小鼠，取出大脑后观察细胞“补丁”(Patch)在脑内的分布情况。

如图2所示，细胞制剂在注射后12h即可集中到脑缺血部位，具有一定的病灶部位靶向能力。

(3)MCAO小鼠治疗后屏障功能恢复情况

MCAO小鼠再灌注4-6h后，每只小鼠尾静脉注射500万步骤(1)制得的鼠源脑微血管内皮细胞。48h后给予小鼠尾静脉注射100μL的体积比为2％的伊文思蓝染料，2h后对小鼠心脏灌流并取小鼠大脑观察大脑渗漏情况。将获取的小鼠大脑在体积比为50％的三氯乙酸中匀浆后12000rpm离心10min，取上清液测定在620/680nm下的荧光强度，计算小鼠大脑中伊文思蓝染料的含量。

如图3A所示，未经细胞制剂治疗的模型小鼠大脑表面可见明显染料分布，说明血脑屏障出现破损；但细胞制剂治疗后大脑表面的染料渗漏明显减少。图3B中的定量结果也证明细胞制剂治疗后染料在小鼠大脑中的分布减少。以上结果说明了本发明能够恢复血脑屏障功能。

(4)小鼠治疗后行为和组织学变化情况

小鼠接受补丁治疗后每日对小鼠神经功能行为进行神经行为学评分(mNSS评分)，总分为18分，评分越高表明神经功能受损越严重。在小鼠接受治疗后14天或小鼠死亡后取出小鼠大脑，切片后H&E染色观察小鼠海马区水肿情况。

如图4显示，MCAO造模后小鼠mNSS评分在10-13分，神经功能损伤严重。不进行治疗的小鼠mNSS评分会持续上升直至在第4天死亡；而接受细胞制剂治疗后，小鼠mNSS评分逐渐下降，神经功能得到恢复，在治疗结束后mNss降至7分左右。小鼠大脑结构也得到了保护，如图5所示，MCAO模型小鼠在再灌注第3天时，脑内水肿严重，海马、皮层和基底核等结构破坏；而细胞制剂治疗的小鼠在治疗后脑内水肿明显缓解，海马、皮层和基底核等部分结构未见明显异常。以上结果证明细胞制剂通过修复血脑屏障功能，减轻颅内水肿和保护脑组织，降低缺血性脑卒中的死亡率和促进感觉及运动的恢复。