一种大皂角中活性成分含量的测定方法

摘要

本申请提供了一种大皂角中活性成分含量的测定方法，采用超高效液相色谱‑质谱联用，快速检测大皂角中L‑苹果酸、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、东莨菪内酯、甘草素、芹菜素、木犀草素、圣草酚、香橙素、黄颜木素、隐绿原酸、新绿原酸、绿原酸、牡荆素、异牡荆苷、槲皮苷、荭草苷和异荭草苷的含量。本申请提供的方法操作简单、灵敏度高、分析速度快、专属性强，可以用于大皂角的质量控制。

说明书

技术领域

本申请涉及中药成分测定技术领域，特别是涉及一种大皂角中活性成分含量的测定方法。

背景技术

大皂角(Gleditsiae sinensis fructus)又名皂荚、扁皂角，为豆科云实亚科皂荚属植物，是中国特有的乡土树种之一。在全国大部分地区均有分布，资源十分丰富，具有祛风痰，除湿毒的功效，经炮制后可降低其毒副作用，常用于临床用药。大皂角具有较大的药用价值，但是不同的产地的药材质量参差不齐，难以对其质量进行评价。因此，需要一种高效、快速、高灵敏度的检测方法，测定大皂角中活性成分的含量，为大皂角的质量评价及药效物质基础的研究提供依据。

发明内容

本申请的目的在于提供一种大皂角中活性成分含量的测定方法，能够同时测定大皂角中19种活性成分的含量，可用于大皂角的质量控制。具体技术方案如下：

本申请提供了一种大皂角中活性成分含量的测定方法，其特征在于，采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)，测定大皂角中活性成分的含量；所述活性成分包括L-苹果酸、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、东莨菪内酯、甘草素、芹菜素、木犀草素、圣草酚、香橙素、黄颜木素、隐绿原酸、新绿原酸、绿原酸、牡荆素、异牡荆苷、槲皮苷、荭草苷和异荭草苷；所述方法包括：

(1)建立各活性成分的标准曲线；

以80-100vol％甲醇为溶剂，配制5-12个含有不同已知浓度的各活性成分的混合对照品溶液；其中，L-苹果酸浓度为40-55000ng/mL；新绿原酸浓度为2-20000ng/mL；隐绿原酸浓度为3-10000ng/mL；异牡荆素的浓度为1-10000ng/mL；绿原酸的浓度为1.5-5000ng/mL；圣草酚的浓度为0.5-5000ng/mL；木犀草素的浓度为1-5000ng/mL；荭草苷的浓度为2-3000ng/mL；异荭草苷的浓度为2-3000ng/mL；牡荆素的浓度为0.4-1000ng/mL；原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、东莨菪内酯、芹菜素、黄颜木素浓度分别为0.5-500ng/mL、香橙素、槲皮苷的浓度分别为0.1-500ng/mL；甘草素的浓度为0.25-300ng/mL；

在相同的色谱条件和质谱条件下，将体积为V

以各活性成分的色谱峰的峰面积为纵坐标，以各活性成分的浓度为横坐标，分别建立各活性成分的标准曲线；

(2)获得供试品溶液中各活性成分的色谱峰面积；

取质量为M的供试样品，以体积为V

在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取体积为V

(3)确定供试品中各活性成分的含量；

根据已建立的各活性成分的标准曲线，由供试品溶液中各活性成分的色谱峰面积，分别计算出供试品溶液中各活性成分的浓度C

本申请提供的一种大皂角中活性成分含量的测定方法，采用UPLC-MS/MS，通过合理选择色谱条件和质谱条件，可以同时测定大皂角中19种活性成分的含量，且所述方法具有操作简单、灵敏度高、准确度高、分析速度快、专属性强等优势，可用于大皂角的质量控制，为大皂角的质量评价及其药效物质基础的研究提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。

图1A为实施例1中标8的混合对照品溶液的多反应离子监测图(MRM图)；

图1B为批次S10的大皂角中19种活性成分的MRM图；

图中各数字标号分别代表：1.L-苹果酸；2.原儿茶醛；3.原儿茶酸；4.咖啡酸；5.东莨菪内酯；6.甘草素；7.芹菜素；8.木犀草素；9.圣草酚；10.香橙素；11.黄颜木素；12.隐绿原酸；13.新绿原酸；14.绿原酸；15.牡荆素；16.异牡荆素；17.槲皮苷；18.荭草苷；19.异荭草苷。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请提供了一种大皂角中活性成分含量的测定方法，其特征在于，采用UPLC-MS/MS，测定大皂角中活性成分的含量；所述活性成分包括L-苹果酸、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、东莨菪内酯、甘草素、芹菜素、木犀草素、圣草酚、香橙素、黄颜木素、隐绿原酸、新绿原酸、绿原酸、牡荆素、异牡荆苷、槲皮苷、荭草苷和异荭草苷；所述方法包括：

(1)建立各活性成分的标准曲线；

以80-100vol％甲醇为溶剂，配制5-12个含有不同已知浓度的各活性成分的混合对照品溶液；其中，L-苹果酸浓度为40-55000ng/mL；新绿原酸浓度为2-20000ng/mL；隐绿原酸浓度为3-10000ng/mL；异牡荆素的浓度为1-10000ng/mL；绿原酸的浓度为1.5-5000ng/mL；圣草酚的浓度为0.5-5000ng/mL；木犀草素的浓度为1-5000ng/mL；荭草苷的浓度为2-3000ng/mL；异荭草苷的浓度为2-3000ng/mL；牡荆素的浓度为0.4-1000ng/mL；原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、东莨菪内酯、芹菜素、黄颜木素浓度分别为0.5-500ng/mL、香橙素、槲皮苷的浓度分别为0.1-500ng/mL；甘草素的浓度为0.25-300ng/mL；

在相同的色谱条件和质谱条件下，将体积为V

以各活性成分的色谱峰的峰面积为纵坐标，以各活性成分的浓度为横坐标，分别建立各活性成分的标准曲线；

(2)获得供试品溶液中各活性成分的色谱峰面积；

取质量为M的供试样品，以体积为V

在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取体积为V

(3)确定供试品中各活性成分的含量；

根据已建立的各活性成分的标准曲线，由供试品溶液中各活性成分的色谱峰峰面积，分别计算出供试品溶液中各活性成分的浓度C

本申请提供的一种大皂角中活性成分含量的测定方法，采用UPLC-MS/MS，通过合理选择色谱条件和质谱条件，能够实现大皂角中19种活性成分含量的测定。

在本申请的一些实施方式中，所述各混合对照品溶液中，L-苹果酸浓度为62.5-50000ng/mL，新绿原酸浓度为20-16000ng/mL；隐绿原酸、异牡荆素的浓度分别为10-8000ng/mL；绿原酸、圣草酚、木犀草素的浓度分别为5-4000ng/mL；荭草苷、异荭草苷的浓度分别为2.5-2000ng/mL；牡荆素为1-800ng/mL；原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、东莨菪内酯、芹菜素、香橙素、黄颜木素、槲皮苷的浓度分别为0.5-400ng/mL；甘草素的浓度为0.25-200ng/mL。

本申请对混合对照品溶液的配制方式没有特别的限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以先配制混合对照品储备液，其中各成分的浓度大于等于所述混合对照品溶液中各活性成分的浓度，然后通过稀释获得所述混合对照品溶液。

在本申请的一些实施方式中，在步骤(1)中，以80-100vol％甲醇为溶剂，配制含有各活性成分的混合对照品储备液，所述混合对照品储备液中，L-苹果酸浓度为50000-55000ng/mL，新绿原酸浓度为16000-20000ng/mL；隐绿原酸、异牡荆素的浓度分别为8000-10000ng/mL；绿原酸、圣草酚、木犀草素的浓度分别为4000-5000ng/mL；荭草苷、异荭草苷的浓度分别为2000-3000ng/mL；牡荆素为800-1000ng/mL；原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、东莨菪内酯、芹菜素、香橙素、黄颜木素、槲皮苷的浓度分别为400-500ng/mL；甘草素的浓度为200-300ng/mL；

以80-100vol％甲醇为溶剂稀释所述混合对照品储备液，获得所述5-12个含有不同已知浓度的各活性成分的混合对照品溶液。

其中，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂可以相同，也可以不同，优选地，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂相同，更优选地，用于配制所述混合对照品储备液的溶剂和用于稀释所述混合对照品储备液的溶剂为甲醇。

本申请中，所用于建立标准曲线的混合对照品溶液可包括所述混合对照品储备液；本申请对所述混合对照品储备液的配制没有特别的限定，只要能够实现本申请的目的即可，示例性地，可通过优先单独配制各活性成分的储备液，再分别取各活性成分的储备液，配制所述混合对照品储备液。

在本申请的一些实施方式中，在步骤(2)中，所述提取为超声提取，提取功率为100-300W，提取频率为30-50kHz，提取时间为20-60分钟。

通过采用本申请供试品溶液的制备方法，实现获得包括19种活性成分的供试品溶液，使得大皂角中活性成分含量的检测结果更加全面、准确、可信；其中，通过超声提取，获得包括19种活性成分的供试品溶液，用于测定各活性成分含量，使得各活性成分含量的检测结果更准确。

在本申请的一些实施方式中，所述色谱条件包括：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：A相为体积分数为0.05-0.15％的甲酸水溶液，B相为甲醇；采用体积分数5-90％A相，10-95％B相，梯度洗脱；柱温20-30℃；流速0.1-0.5mL/分钟；进样体积V

优选地，所述色谱条件包括：流动相：A相为体积分数为0.08-0.12％的甲酸水溶液，B相为甲醇；柱温：20-28℃；流速：0.2-0.4mL/分钟；进样体积V

发明人在研究中发现，采用本申请的梯度洗脱，能够使大皂角中19种活性成分获得更好的分离效果，优选地，在本申请的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：0～1.0分钟，10％～25％B相；1.0～5.0分钟，25％～31％B相；5.0～7.5分钟，31％～31％B相，7.5～8.0分钟，31％～50％B相；8.0～9.0分钟，50％～95％B相；9.0～11.0分钟，95％～95％B相。

本申请中对质谱的种类没有特别的限定，只要能够实现本申请的目的即可，例如可以采用三重四级杆质谱。为了有效获得色谱分离后的各活性成分的特征离子，以便于获得更准确的各活性成分的鉴定结果，在本申请的一些实施方式中，所述质谱为三重四级杆质谱，所述质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测模式为多反应离子监测，负离子扫描模式；干燥气温度：250-350℃；干燥气流速：5-10L/分钟；雾化器压力：30-40psi；鞘气温度：300-400℃；鞘气流速：8-15L/分钟；毛细管电压：3000-4000V。

优选地，所述质谱条件包括：干燥气温度：280-320℃；干燥气流速：6-8L/分钟；雾化器压力：32-38psi；鞘气温度：330-370℃；鞘气流速：10-12L/分钟；毛细管电压：3300-3700V。

在本申请的一些实施方式中，所述各活性成分的特征离子包括：

下面对本申请所需的仪器和试剂进行说明。

仪器

Agilent 6470三重四级杆质谱仪(美国Agilent公司)；Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Agilent MassHunter分析软件(美国Agilent公司)；A60/220.R2型十万分之一天平(波兰Radwag公司)；Milli-Q IQ 7005超纯水制备仪(Millipore公司)；5453型高速离心机(德国Eppendorf公司)；Vortex-2旋涡混匀仪(上海沪析实业有限公司)；ZZ-L6DT超声清洗槽(天津知著科技有限公司)。

试剂

L-苹果酸(批号：DST201124-038)、原儿茶醛(批号：DST200628-080)、原儿茶酸(批号：DSTDY008101)、咖啡酸(批号：DST191030-013)、东莨菪内酯(批号：DSTDD006401)甘草素(批号：DST200326-010)、芹菜素(批号：DST200809-026)、木犀草素(批号：DST200910-032)、圣草酚(批号：DSTDS004201)、香橙素(批号：DSTDX009401)、黄颜木素(批号：DST201019-147)、隐绿原酸(批号：DSTDY003501)、新绿原酸(批号：DSTDX001501)、绿原酸(批号：DSTDL002101)、牡荆素(批号：DST200325-034)、异牡荆苷(批号：DST200519-054)、槲皮苷(批号：DST180506-006)、荭草苷(批号：DSTDH004901)、异荭草苷(批号：DST200815-121)均购自成都德思特生物技术有限公司。

甲醇(色谱纯)购自美国Fisher公司，甲酸(色谱纯)购自ROE公司。

材料

大皂角分别购自于河北、安徽、河南、山西、山东、云南、贵州等地。药材来源见表1。

表1不同批次大皂角来源

以下实施例中所涉及的试剂与药材如无特殊说明均可来源于市售或按照本领域公知方法取得。

实施例1

(1)建立各活性成分的标准曲线

精密称取L-苹果酸、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、东莨菪内酯、甘草素、芹菜素、木犀草素、圣草酚、香橙素、黄颜木素、隐绿原酸、新绿原酸、绿原酸、牡荆素、异牡荆苷、槲皮苷、荭草苷、异荭草苷对照品各10.0mg，分别用甲醇溶解，配制成浓度均为1mg/mL的各对照品储备液，放于4℃冰箱保存备用。

精确量取各对照品储备液适量，用甲醇配制成混合对照品储备液，记为标1，其中，L-苹果酸浓度为50000ng/mL，新绿原酸浓度为16000ng/mL，隐绿原酸、异牡荆素浓度为8000ng/mL，绿原酸、圣草酚、木犀草素浓度为4000ng/mL，荭草苷，异荭草苷浓度为2000ng/mL，牡荆素为800ng/mL，原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、东莨菪内酯、芹菜素、香橙素、黄颜木素、槲皮苷浓度为400ng/mL，甘草素浓度为200ng/mL；将混合对照品储备液用甲醇依次稀释2、2.5、2、2、2.5、2、4、2倍，得到包含混合对照品储备液在内的9个含有不同已知浓度的各活性成分的混合对照品溶液，依次标记为标1-标9。

在相同的色谱条件和质谱条件下，分别取2μL各混合对照品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测，根据各活性成分的特征离子确定各活性成分的色谱峰，并获得各活性成分的色谱峰面积；

其中，所述色谱条件包括：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters)；流动相：A相为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B相为甲醇；梯度洗脱，洗脱梯度为：0～1.0分钟，10％～25％B；1.0～5.0分钟，25％～31％B；5.0～7.5分钟，31％～31％B，7.5～8.0分钟，31％～50％B；8.0～9.0分钟，50％～95％B；9.0～11.0分钟，95％～95％B，流速为0.3mL/分钟；柱温：25℃；进样量V

所述质谱为三重四级杆质谱，所述质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源；检测模式为多反应离子监测，负离子扫描模式；干燥气温度：300℃；干燥气流速：7L/分钟；雾化器压力：35psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/分钟；毛细管电压：3500V；19种活性成分的特征离子及相应质谱参数如表2所示。

表2 19种活性成分的特征离子及相应质谱参数

以各活性成分色谱峰的峰面积(y)为纵坐标，以各活性成分的浓度(x)为横坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，权重系数为1/x，建立19种活性成分的标准曲线，得到各活性成分的线性方程及相关系数r；将标9的混合对照品溶液逐步稀释后，分别以信噪比(signal-noise ratio，S/N)＝10时各对照品的浓度作为各活性成分的最低定量限(LLOQ)，结果见表3；其中，标8的混合对照品溶液的MRM图如图1A所示，可见19种活性成分之间互不干扰，各活性成分的色谱峰对称性良好，分离度高。

表3 19种活性成分标准曲线

(2)获得供试品溶液中各活性成分的色谱峰面积：

将表1中批次S1的大皂角粉碎(过60目筛，筛孔内径0.3mm)，精密称取100.0mg粉碎后的大皂角粉末置于10mL容量瓶中，加入70vol％甲醇定容至刻度，超声提取40分钟，提取功率180W，提取频率40kHz，超声后取出放至室温，70vol％甲醇补足失重，取上清液用0.22μm有机微孔滤膜过滤，该滤液为供试品溶液，放于4℃冰箱保存备用。在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取2μL的供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，通过质谱检测，根据各活性成分的特征离子确定各活性成分的色谱峰，并获得各活性成分的色谱峰面积；

(3)确定供试品中各活性成分的含量；

根据已建立的各活性成分的标准曲线，由供试品溶液中各活性成分的色谱峰面积，分别计算出供试品溶液中各活性成分的浓度C

实施例2-12

除了分别取表1中批次S2至批次S12的大皂角替换实施例1中批次S1的大皂角外，其余与实施例1相同，分别得到批次S2至批次S12的大皂角中19种活性成分的含量，结果见表4.1-4.2所示，其中，批次S10的大皂角中19种活性成分的MRM图如图1B所示。

表4.1不同批次大皂角中19种活性成分的含量(一)(μg/g)

表4.2不同批次大皂角中19种活性成分的含量(二)(μg/g)

精密度试验

日内精密度：精密称取批次S12的大皂角粉末100.0mg，按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件和质谱条件进样分析，重复进样6次，记录各活性成分的峰面积；分别计算19种活性成分的峰面积的平均值及相对标准偏差(RSD)值，结果见表5。从表5可以看出，19种活性成分峰面积的RSD值范围在0.4％-6％之间，结果表明本申请的方法日内精密度良好。

表5 19种活性成分日内精密度试验结果(n＝6)

日间精密度：精密称取批次S12的大皂角粉末100.0mg，按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件和质谱条件进样分析，重复进样2次，连续进样3天，记录各活性成分的峰面积；分别计算19种活性成分峰面积的平均值及其RSD值，结果见表6。从表6可以看出，19种活性成分峰面积的RSD值在0.5％-5.8％之间，结果表明本申请的方法日间精密度良好。

表6 19种活性成分日间精密度试验结果(n＝6)

重复性试验

精密称取批次S12的大皂角6份，每份100.0mg，按实施例1的方法制备供试品溶液，分别按实施例1的色谱条件和质谱条件进样分析，记录各活性成分的峰面积；根据实施例1中各活性成分的标准曲线，分别计算19种活性成分的浓度，并计算各活性成分浓度的平均值及RSD值，结果见表7。从表7可以看出，19种活性成分峰面积的RSD值在2.0％-6.6％之间，结果表明本申请的方法重复性较好。

表7 19种活性成分重复性试验结果(n＝6,ng/mL)

稳定性试验

精密称取批次S12的大皂角粉末100.0mg，按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件和质谱条件，分别于0、2、4、8、12、24小时进样分析，记录各活性成分的峰面积；分别计算19种活性成分峰面积的平均值及RSD值，结果见表8。从表8可以看出，19种活性成分峰面积的RSD值在0.6％-5.6％之间，结果表明本申请的供试品溶液在室温放置24小时条件下稳定性良好。

表8 19种活性成分稳定性试验结果(n＝6)

加样回收率试验

精密称取精密称取批次S12的大皂角粉末6份，每份50.0mg，配制19种活性成分的各对照品溶液，各活性成分浓度分别为：L-苹果酸1mg/mL，木犀草素、隐绿原酸、新绿原酸、异牡荆苷、荭草苷、异荭草苷100μg/mL，原儿茶醛、原儿茶酸、圣草酚、黄颜木素、绿原酸5μg/mL，咖啡酸、东莨菪内酯、甘草素、芹菜素、香橙素、牡荆素、槲皮苷1μg/mL，分别取各对照品溶液：L-苹果酸56μL，木犀草素26μL，隐绿原酸50μL，新绿原酸150μL，异牡荆苷105μL，荭草苷27μL，异荭草苷17μL，原儿茶醛24μL，原儿茶酸24μL，圣草酚64μL，黄颜木素44μL，绿原酸56μL，咖啡酸100μL，东莨菪内酯110μL，甘草素27μL，芹菜素130μL，香橙素80μL，牡荆素50μL，槲皮苷60μL，加至待测样品中，各活性成分的加入值如表9所示，用70vol％甲醇定容至10mL，按实施例1的方法制备各加标样品的供试品溶液，分别按实施例1的色谱条件和质谱条件进样分析，记录各活性成分的峰面积；根据实施例1中各活性成分的标准曲线，分别计算各加标样品中19种活性成分的浓度，得到各加标样品中19种活性成分的含量，根据加样回收率(％)＝(测得值-原始值)/加入值×100％计算各加标样品的加样回收率，并计算各活性成分的加样回收率的平均回收率及RSD值，结果见表9。表9结果显示19种活性成分的平均回收率在88.7％-112.9％之间，其RSD值在0.8％-6.7％之间，结果表明本申请的方法准确度好。

表9 19种活性成分加样回收率试验结果(n＝6)

综上所述，本申请实施例提供的大皂角中活性成分含量的测定方法，采用UPLC-MS/MS法，同时测定大皂角中L-苹果酸、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、东莨菪内酯、甘草素、芹菜素、木犀草素、圣草酚、香橙素、黄颜木素、隐绿原酸、新绿原酸、绿原酸、牡荆素、异牡荆苷、槲皮苷、荭草苷和异荭草苷的含量，此方法操作简单、灵敏度高、准确度高、分析速度快，可以为大皂角的质量评价及其药效物质基础的研究提供依据。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。