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法律状态
2022-06-28
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明属于农药残留免疫分析检测技术领域。更具体地，涉及一种基于纳米抗体的对硫磷农药胶体金标记物及其应用。
背景技术
对硫磷是一种广谱高毒的有机磷酸酯类杀虫、杀螨剂，具有强烈的触杀与胃毒作用，并有一定的薰蒸作用。由于其在果蔬粮食等农作物上的虫害预防和控制效果，对硫磷农药在农业生产中广泛使用，其生态安全风险以及对人类和其他非靶标生物的安全隐患目前也备受关注。对硫磷可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性，导致体内神经递质乙酰胆碱的大量堆积，进而引起一系列的神经反应，产生恶心、头疼、无力、胸闷等中毒症状，严重的可导致死亡。倘若对硫磷在环境和食品中残留蓄积，必定会对人类的健康造成直接或潜在的严重危害，对硫磷属于高毒农药品种目前已被禁止在蔬菜和水果上使用，因此研发对硫磷农药残留的快速检测方法与技术具有重要的现实意义。
目前对硫磷农药的残留的检测方法主要还是高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱质谱联用技术(LC/MS)等仪器方法，但仪器检测法虽然检测结果准确，灵敏，但其复杂的操作过程、昂贵的仪器以及较高的检测费用等缺点都让仪器检测不适用于现场的即时检测。胶体金免疫层析技术是从上世纪80年代开始应用的一种将免疫技术和色谱层析技术相结合即时检测技术。其原理就是含有分析物的样品通过毛细管作用流经整个试纸条并与试纸条的反应膜上的包被物质(抗原或抗体)发生高特异性、高亲和性的免疫反应，免疫复合物被截留在试纸条上进行显色，从而可以得到检测结果。而目前胶体金免疫层析技术所使用的抗体几乎全是单抗或多抗，如现有技术CN 106970217 B公开了一种定量检测有机磷类农药的免疫层析方法，是采用单克隆抗体作为固定检测线，乙酰胆碱酯酶修饰指示剂，制备定量检测有机磷农药的免疫层析方法，该方法是针对有机磷类的农药的多残留检测；虽然使用抗原抗体的检测方法只能实现单一目标物的检测，但是由于我国对于对硫磷农药的残留限量比较严苛最大残留限量为0.01mg/kg，目前采用单抗或多抗的对硫磷检测的免疫层析方法无法达到国标要求。与传统的抗体相比，纳米抗体(Nanobody，Nbs)具有相对分子质量小、人源化简单、亲和力高、稳定性高、可微生物表达、免疫原性低、穿透力强、可溶性好等优势，在医学基础研究以及疾病诊断和治疗方面备受关注。目前还未见有纳米抗体用于对硫磷农药的检测分析报道，因此，需要开发出更多更加简单便捷、低成本、能用于对硫磷农药残留的检测的新产品和方法，使对硫磷检测的检测方法达到国标要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述问题的缺陷和不足，提供一种基于纳米抗体的对硫磷农药胶体金标记物及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种基于纳米抗体的对硫磷农药胶体金标记物。
本发明的第二个目的是提供所述对硫磷纳米抗体胶体金标记物的应用。
本发明的第三个目的是提供一种对硫磷农药检测纳米抗体胶体金试纸条。
本发明的第四个目的是提供所述试纸条的应用。
本发明的第五个目的是提供一种检测农作物中对硫磷农药的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种基于纳米抗体的对硫磷农药胶体金标记物，其制备方法为：在pH值为8～10的胶体金溶液中加入1～10μg/mL对硫磷纳米抗体，混匀静置，再加入20～40μL的10％BSA，静置后离心，弃上清液，采用胶体金复溶缓冲液重悬沉淀，即得到对硫磷纳米抗体胶体金标记物；所述胶体金溶液采用体积比为1：6的1％氯金酸和1％柠檬酸三钠制备得到；所述胶体金复溶缓冲液配方为：0.01～0.5MTris-HCl，0.1～2％BSA、0.1～2％吐温-20、0.1～2％聚乙烯吡咯烷酮和1～15％蔗糖。
本发明首次利用对硫磷纳米抗体与对胶体金进行结合，制备得到的对硫磷纳米抗体胶体金标记物可以用于检测对硫磷农药；通过对硫磷纳米抗体胶体金标记物制备过程中的各条件进行优化筛选，最终制备得到稳定性好、灵敏性高的磷纳米抗体胶体金标记物。
优选地，胶体金溶液pH值为8.5～9.5，对硫磷纳米抗体加入量为3～7μg/mL，10％BSA加入量为30～40μL。
优选地，胶体金溶液粒径为10～20nm。
优选地，离心条件为9000rpm、4℃、15min。
优选地，重悬沉淀采用胶体金体积1/5的胶体金复溶缓冲液重悬。
优选地，胶体金复溶缓冲液的配方为：0.05M Tris-HCl、BSA 0.2％～1％、蔗糖2～10％、吐温-20 0.1％～1％以及聚乙烯吡咯烷酮0.3％～1％。
本发明提供对硫磷纳米抗体胶体金标记物在免疫层析技术在检测对硫磷农药中的应用。
本发明提供对硫磷纳米抗体胶体金标记物在制备检测对硫磷农药产品中的应用。
本发明提供一种检测对硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条，在结合释放垫上含有上述对硫磷纳米抗体胶体金标记物。
优选地，还包括样品垫、反应膜、吸水垫和底板。
优选地，所述反应膜上有包被着对硫磷农药半抗原-载体蛋白偶联物的检测线，以及包被着兔抗驼抗体的质控线。
本发明提供的检测对硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条，采用对硫磷纳米抗体胶体金标记物与待测物结合，通过与对硫磷农药半抗原-载体蛋白和兔抗驼抗抗进行竞争抑制反应，来检测对硫磷农药。把待测样品溶液从样品垫加入到试纸条上，通过毛细管作用力样品溶液流经整个试纸条，样品中的待检物质首先与结合释放垫上的对硫磷纳米抗体胶体金标记物结合形成药物-抗体-胶体金标记物。之后混合溶液流经反应膜，药物与检测线上的对硫磷农药半抗原-载体蛋白竞争结合对硫磷纳米抗体胶体金标记物，根据检测线条带是否显色或显色深浅来判断待检样品溶液中是否有对硫磷农药残留。
上述试纸条采用如下方法制备得到：
S1.制备喷涂有对硫磷纳米抗体胶体金标记物的结合释放垫；
S2.制备具有包被有对硫磷农药半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有兔抗驼抗抗体的质控线的反应膜；
S3.将步骤S1和步骤S2制备得到的结合释放垫、反应膜与样品垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
优选地，所述胶体金复溶缓冲液的配方为：0.05M Tris-HCl、BSA 0.2％～1％、蔗糖2～10％、吐温-20 0.1％～1％以及聚乙烯吡咯烷酮0.3％～1％。
优选地，对硫磷农药半抗原溶液的制备参照文献中的描述方法制备而成(Xu etal.Analytica Chimica Acta,2009,647(1):90-96)；对硫磷农药半抗原-载体蛋白是由对硫磷农药的半抗原和卵清蛋白利用化学试剂DMF和NHS化学偶联获得。
优选地，兔抗驼抗体溶液是将对硫磷纳米抗体作为免疫原注射至兔子体内，最后从兔子血清分离得到的抗体溶液。
优选地，将对硫磷农药半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将兔抗驼抗体包被在反应膜上构成质控线。
采用本发明制备得到的试纸条检测时，样品溶液从样品垫加入试纸条通过毛细管作用力通过整个试纸条。当样品处理液中对硫磷农药的浓度低于检测限量或为零时，对硫磷纳米抗体胶体金标记物在层析过程中会与对硫磷农药半抗原-载体蛋白和兔抗驼抗抗体结合在检测线和质控线分别显色；当样品处理液中的对硫磷农药的浓度等于或高于检测限时，样品中的农药会与对硫磷纳米抗体胶体金标记物全部结合，从而在检测线上的对硫磷半抗原-载体蛋白由于竞争反应不会与对硫磷纳米抗体胶体金标记物结合而不发生显色。
本发明提供所述试纸条在检测果蔬农作物中的对硫磷农药残留中的应用。
本发明提供一种检测农作物中对硫磷农药的方法，采用上述试纸条对样品进行检测，根据试纸条显色结果判断对硫磷农药的残留情况。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次采用对硫磷纳米抗体与对胶体金进行结合制备对硫磷纳米抗体胶体金标记物，采用对硫磷纳米抗体胶体金标记物对对硫磷农药检测的稳定性好，检测的灵敏度高，用于制备得到的基于纳米抗体的对硫磷农药检测胶体金试纸条，具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适用于市场的快速检测、易于储存、保质期长的优点。本发明所提供的试纸条对对硫磷农药残留检测的灵敏度达到0.0013～0.085mg/kg，检测限是0.00069mg/kg满足国标检测要求，反应时间为5～8min，适合于对蔬菜、水果等农产品中的对硫磷农的快速检测，该方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
图1为配制得到的五种不同比例的胶体金溶液；
图2为采用五种不同比例的胶体金溶液与对硫磷纳米抗体的结合结果；
图3为五种不同的胶体金溶液制备胶体金-对硫磷纳米抗体探针进行对硫磷药物溶液检测结果；
图4为对硫磷纳米抗体胶体金标记物的制备pH优化；
图5为对硫磷纳米抗体胶体金标记物的制备纳米抗体添加量优化；
图6为对硫磷纳米抗体胶体金标记物的制备BSA含量优化；
图7为对硫磷纳米抗体胶体金标记物的制备胶体金复溶缓冲液优化；
图8为本发明试纸条的结构示意图(其中，1-样品垫、2-结合物释放垫、3-反应膜、4-吸水垫、5-对硫磷农药半抗原与载体蛋白偶联物的检测线、6-包被有兔抗驼抗抗体的质控线、7-底板)；
图9为本发明对硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条检测结果示意图；
图10为不同对硫磷标准品农药浓度试纸条检测结果；
图11为对不同的浓度梯度检测的标准曲线；
图12为对硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条的稳定性试验；
图13为对硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条实际样本的检测。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1对硫磷纳米抗体胶体金标记物的制备及优化
1、胶体金的制备
取超纯水置于锥形瓶中加入1％氯金酸，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热溶液颜色首先由黄色变为无色，接着变为黑色再慢慢变为酒红色，当溶液颜色不再发生变化后继续反应10min，冷却至室温后用超纯水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
在胶体金溶液的制备过程中最后得到的胶体金溶液粒径会随加入柠檬酸三钠的含量不同而发生变化。目前现有技术中单抗使用的胶体金溶液的制备中采用的1％氯金酸和1％柠檬酸三钠的体积比通常为1：1、1：1.25以及1：1.5。而为了制备适合纳米抗体的胶体金溶液，采用不同体积比的1％氯金酸和1％柠檬酸三钠进行制备胶体金溶液，同时设置1％氯金酸和1％柠檬酸三钠的体积比为1：1、1：1.25、1：1.5以及1：2和1：6配制得到五种不同粒径的胶体金溶液，分别与对硫磷纳米抗体标记结合，依据结果判断胶体金溶液与纳米抗体的结合情况。
配制得到的五种不同体积比的胶体金溶液如图1所示，采用五种不同体积比的胶体金溶液与对硫磷纳米抗体的结合结果如图2所示，胶体金溶液在不适合的条件下溶液会发生聚集，颜色由酒红色变为黑色并有沉淀；在采用体积比为1：1、1：1.25、1：1.5制备得到的单抗常用的胶体金溶液中加入对硫磷纳米抗体溶液后，其溶液的颜色由红色变为黑色，表明体积比为1：1、1：1.25、1：1.5制备得到的单抗常用的胶体金溶液不适合对硫磷纳米抗体的结合。采用体积比为1：2的胶体金溶液与对硫磷纳米抗体结合后，溶液也由红色变紫，表明体积比为1：2制备的胶体金溶液与对硫磷纳米抗体结合后同样存在不稳定的情况；而在采用体积比为1：6制备的胶体金溶液加入对硫磷纳米抗体后，溶液的颜色没有发生明显变化，表明混合溶液可以保持稳定。
再采用以上制备的五种不同体积比的胶体金溶液制备胶体金-对硫磷纳米抗体探针进行对硫磷药物溶液检测，结果如图3所示，在采用体积比为1：6的胶体金溶液与对硫磷纳米抗体结合稳定性和检测效果都是最好的。
2、对硫磷纳米抗体胶体金标记物的制备
本发明采用的对硫磷纳米抗体溶液制备参照文献中的描述结合常规方法制备得到(张玉琪等，分析化学,2019,47(9):1419-1426)。利用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金溶液的pH值，按每毫升胶体金溶液中加入1～10μg的对硫磷纳米抗体，振荡混匀之后静置30min，加入10％BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为0.5％(体积分数)，静置30min。之后进行离心，弃上清液，沉淀用胶体金体积1/5的胶体金复溶缓冲液重悬，置4℃备用。
3、对硫磷纳米抗体胶体金标记物的优化
在整个对硫磷纳米抗体胶体金标记物的标记过程中对pH、纳米抗体添加量、BSA添加量、离心条件以及最后胶体金复溶液的体系进行优化，优化结果根据最终得到的纳米抗体胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定。
(1)pH优化：利用0.2M碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH，通过加入20、25、30、35、40μL碳酸钾溶液，pH分别为：8.12、8.45、8.78、9.12、9.67，得到不同pH的胶体金溶液。之后按照上述步骤2中的反应过程得到不同的胶体金复合物，根据最终得到的纳米抗体胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定合适的pH。
利用这五种不同pH的胶体金-对硫磷纳米抗体探针进行对硫磷药物溶液检测，结果如图4所示，在碳酸钾溶液添加量为30μL时得到的胶体金-纳米抗体复合物的效果最好，pH为8.5～9.5的胶体金与对硫磷纳米抗体结合稳定性和检测效果都是最好的。
(2)纳米抗体添加量优化：根据优化好的pH 9.12时，再分别加入3、5、7、10μL的1mg/mL对硫磷纳米抗体溶液，得到不同的胶体金复合物，根据最终得到的纳米抗体胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定合适的对硫磷纳米抗体添加量。
利用这4种不同含量的对硫磷纳米抗体溶液的胶体金-对硫磷纳米抗体探针进行对硫磷药物溶液检测，结果如图5所示，在对硫磷纳米抗体溶液含量为3～7μg/mL的胶体金与对硫磷纳米抗体结合稳定性和检测效果都是最好的。
(3)BSA含量优化：利用上述优化后的条件，在封闭过程分别利用25、30、35、40μL的10％BSA进行封闭，同样根据最终得到的纳米抗体胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定合适的BSA添加量。
利用这4种不同BSA含量的胶体金-对硫磷纳米抗体探针进行对硫磷药物溶液检测，结果如图6所示，在BSA含量为30～40μL的胶体金与对硫磷纳米抗体结合稳定性和检测效果都是最好的。
(4)胶体金复溶缓冲液优化：优化胶体金复溶缓冲液，包括胶体金复溶液体系(采用不同的缓冲溶液)：PBS、Tris-HCl、BB、PB；不同的Tris-HCl的浓度0.5、0.2、0.1、0.05、0.02M；不同的BSA含量0.1、0.2、0.5、1、2％；蔗糖含量1、2、5、10、15％；吐温-20含量0.1、0.2、0.5、1、2％；以及PVP含量0.1、0.2、0.5、1、2％。同样利用纳米抗体-胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定合适复溶液配方。
对胶体金复溶缓冲液的配方进行优化后，分别采用胶体金复溶缓冲液配制得到的胶体金-对硫磷纳米抗体探针进行对硫磷药物溶液检测，结果如图7所示，在胶体金复溶缓冲液配方为：0.05M Tris-HCl、BSA 0.2％～1％、蔗糖2～10％、吐温-20 0.1％～1％以及聚乙烯吡咯烷酮0.3％～1％时配制的胶体金与对硫磷纳米抗体结合稳定性和检测效果都是最好的。
(5)离心条件优化：在上述优化后的条件的基础上对离心条件进行优化，包括离心温度、离心转速以及离心时间。分别设置：温度包括0、4、16、25、37℃；转速包括8000、9000、10000、12000rpm；离心时间包括10、15、20min。同样根据最终得到的纳米抗体-胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定合适的离心条件。
利用不同的离心条件的胶体金-对硫磷纳米抗体探针进行对硫磷药物溶液检测，当离心条件为9000rpm、4℃、15min对硫磷纳米抗体结合稳定性和检测效果都是最好的。
综上，对对硫磷纳米抗体胶体金标记物的制备进行优化后，最终优化结果为：pH为8.5～9.5，对硫磷纳米抗体添加量为3～7μg/mL，10％BSA含量为30～40μL，离心条件为9000rpm、4℃、15min。胶体金复溶缓冲液配方为0.05M Tris-HCl、BSA 0.2％～1％、蔗糖2～10％、吐温-20 0.1％～1％以及PVP在0.3％～1％；时制备得到的对硫磷纳米抗体胶体金标记物的稳定性好、灵敏性高。
实施例2检测对硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条的制备
1、结合释放垫的制备
首先将结合释放垫用胶体金复溶液浸泡30min之后在45℃烘箱中烘干，之后将实施例1中制备得到的对硫磷纳米抗体胶体金标记物溶液用AUTOKUN划膜喷金标机以每孔5μL/cm的量喷涂在处理过的结合释放垫上，之后将喷涂完成的结合释放垫放置在37℃烘箱中，放置12h之后密封加入干燥剂干燥保存。
2、反应膜的制备
本发明采用的对硫磷农药半抗原溶液的制备参照文献中的描述方法制备而成(Xuet al.Analytica Chimica Acta,2009,647(1):90-96)；对硫磷农药半抗原-载体蛋白是由对硫磷农药的半抗原和卵清蛋白利用化学试剂DMF和NHS化学偶联获得。
本发明采用的兔抗驼抗体溶液是将对硫磷纳米抗体作为免疫原注射至兔子体内，最后从兔子血清分离得到的抗体溶液。
将对硫磷农药半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将兔抗驼抗体包被在反应膜上构成质控线。
包被过程：用磷酸缓冲液将对硫磷农药半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到0.2mg/mL，用AUTOKUN划膜喷金标机将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)，包被量为0.8μL/cm；用磷酸盐缓冲液将兔抗驼抗抗体稀释到1mg/mL，用AUTOKUN划膜喷金标机将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为0.8μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥4h，干燥备用。
3、样品垫的制备
将样品垫置于含1％牛血清白蛋白(体积分数)、1％蔗糖(体积分数)、0.3％聚乙烯吡咯烷酮(体积分数)、0.5％曲拉通(体积分数)、pH7.4、0.2mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡1h，37℃烘4h备用。
4、试纸条的组装
将反应膜、结合释放垫、样品垫和吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；样品垫的末端与结合释放垫的始端相连，结合释放垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，且结合释放垫垫和吸水垫与反应膜都有2mm的重叠，样品垫与结合释放垫有2mm的重叠。样品垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线(T线)和质控线(C线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近样品垫的末端的一侧；质控线位于靠近吸水垫的首端的一侧；组装好的试纸条如图8所述，将试纸条用机器切成4mm宽的小条，装在特制的密封袋中，4～30℃条件下可保存12个月。
实施例3检测对硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条对对硫磷农药残留的检测
1、检测限试验
在PBS缓冲液中分别添加对硫磷标准品农药至最终浓度为0.2mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg、0.025mg/kg、0.0125mg/kg、0.00625mg/kg、0.003125mg/kg、0.00156mg/kg和0.00078mg/kg，再取实施例2中制备好的试纸条进行检测，每个样本重复测试三次。
将样品溶液垂直滴加到样品垫上，液体流动时开始计时，反应5～8min，判定结果，试纸条检测结果示意图如图9所示。结果通过胶体金分析仪读数可以得到准确数据。根据其数据可以通过Origin软件得到一条标准曲线。
试纸条检测结果如图所示10，随着对硫磷标准品农药浓度的降低，试纸条上的对硫磷标准品农药检测结果的检测线颜色逐渐加深；通过对不同的浓度梯度进行检测后得到的标准曲线如图11所示，该曲线对应的结果表明此方法检测对硫磷农药残留检测范围是0.0013～0.085mg/kg，检测限是0.00069mg/kg满足国标检测要求。
2、特异性试验
采用本发明制备得到的对硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条分别检测5mg/kg的喹硫磷、甲基对硫磷、水胺硫磷、杀螟硫磷、丙溴磷和克百威等药物。上述采用的农药均使用PBS缓冲溶液稀释到浓度为5mg/kg。
将样品溶液垂直滴加到样品垫上，液体流动时开始计时，反应5～8min，判定结果。
通过胶体金分析仪读取检测结果：
阴性(-)：表示样品中待测物质浓度低于检测限；
阳性(+)：表示样品中待测物质浓度等于或高于检测限；
无效：表示需要重新测试。
结果显示试纸条质控线和检测线均显色，呈阴性。说明本试纸条对5mg/kg喹硫磷、三唑磷、甲基对硫磷、水胺硫磷、杀螟硫磷、丙溴磷和克百威等药物无交叉反应。
3、稳定性试验
采用实施例2中制备好的对硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条装入密封袋内，内置干燥剂，于45℃烘箱内保存，分别于3天、7天、14天、21天、28天、30天取出，利用PBS稀释对硫磷标准品至0.01mg/kg的溶液，后进行检测试纸条的稳定性。
结果如图12所示，在45℃保存3天、7天、14天、21天、28天，检测结果均无明显变化，45℃保存30天，金标垫上胶体金标记的抗体的复溶效果有所下降，T线和C线的颜色变浅，灵敏度略有下降。45℃保存30天，相当于常温保存12个月。
实施例4果蔬农作物中的对硫磷农药残留中的检测分析
将市购的白菜、黄瓜及橘子样本，样品洗净晾干之后称取10g(±0.1g)均质样品至50mL塑料离心管中，每个样品分为两组，分为阴性样品和阳性样品，阴性样品不做任何处理，阳性样品则加入对硫磷标准品至药物浓度达到0.01mg/kg。随后在阴性样品和阳性样品中都加入10mL的乙腈，涡旋混匀；加入萃取包，继续涡旋震荡2min，5000rpm/min下离心3min，室温静置。取上清溶液加入到净化管中，涡旋震荡2min，5000rpm/min下离心3min后取上清液，37度氮吹，之后利用EDTA溶液原倍复溶。
再取实施例2中制备好的试纸条进行检测，将处理好的样品溶液垂直滴加到样品垫上，液体流动时开始计时，反应5～8min，判定结果。
通过胶体金分析仪读取检测结果：
阴性(-)：表示样品中待测物质浓度低于检测限；
阳性(+)：表示样品中待测物质浓度等于或高于检测限；
无效：表示需要重新测试。
采用本发明制备的试纸条进行检测的结果示意图如图13所示，在检测白菜、黄瓜及橘子样本时，我们可以看到阴性样品中T线与C线都发生显色，而阳性样品C线显色明显强于T线的显色结果。说明本发明的对硫磷检测方法对于实际样品的检测结果也是可以满足要求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
