使用增强荧光检测的基材在单分子水平上检测分子相互作用

摘要

本发明涉及用于表征结合伴侣之间的结合相互作用的方法。本发明涉及方法，该方法包括将第一结合伴侣与第二结合伴侣接触，该第二结合伴侣显示出与第一结合伴侣的快速解离速率结合特性，以生成第一结合伴侣和第二结合伴侣之间的结合相互作用，其中，第一结合伴侣被固定到基材上，该基材被设计为增强位于基材表面附近的荧光分子的荧光信号，并且其中，第二结合伴侣是发射荧光信号的分子或偶联至发射荧光信号的分子。基于两个结合伴侣之间的多个瞬时相互作用，可分析两个结合伴侣之间的相互作用。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年10月22日提交的美国临时申请62/924,337的权益，其通过引用以其全文并入本文。

背景技术

期望开发增强位于基材的表面附近的荧光分子的荧光信号的基材。已经证明了几个数量级上的荧光增强。通常，被用于增强荧光的基材通常使用在金属介电界面发生的表面共振(即，等离子体激元(plasmon))。传统的基于棱镜的表面等离子体激元共振架构可被用于此目的。金属光栅结构、光子晶体结构、纳米图案化表面、纳米结构化表面等也可用于增强荧光。

单分子动力学指纹(SMKF)提供了分子与其结合伴侣的结合特性。SMKF的某些此类方法被公开于PCT申请公开第WO 2018/140157号，其通过引用以其全文并入本文。SMKF可被用于在单分子水平上表征结合成员之间的结合特性。SMKF提供了关于结合伴侣之间的结合相互作用的更多信息，可用于减少背景/噪声，并提高灵敏度和特异性。

发明内容

本发明涉及用于检测和分析结合伴侣的结合特性的方法。具体地，本发明的某些实施例提供了检测和分析第一结合伴侣和第二结合伴侣之间的结合相互作用的结合特性的方法(例如，产生SMKF)，其中，第一结合伴侣固定在被设计为增强位于基材的表面附近的分子发射的荧光信号的基材上，并且第二结合伴侣是发射荧光信号的分子，或与发射荧光信号的分子偶联，并且其中，第二结合伴侣显示出与第一结合伴侣的快速解离速率结合。

在优选实施例中，本发明提供了方法，该方法包括将第一结合伴侣与显示出与第一结合伴侣的快速解离速率结合的第二结合伴侣接触，以生成第一结合伴侣与第二结合伴侣之间的结合相互作用，并检测第一结合伴侣与第二结合伴侣之间的该结合相互作用的SMKF，其中，第一结合伴侣固定在被设计为增强位于基材的表面附近的荧光分子的荧光信号的基材上，并且其中，第二结合伴侣是发射荧光信号的分子，或与发射荧光信号的分子偶联。

通过测量/确定两个结合伴侣之间的瞬态相互作用，可分析两个结合伴侣之间的相互作用。

附图说明

图1.本发明的某些实施例的示意性表示。

图2.被设计为增强位于基材表面附近的荧光分子的荧光信号的基材的示例。

具体实施方案

如本文所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指示。在具体实施方式和/或权利要求书中使用术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“带有”或其变体的范围内，此类术语旨在以类似于术语“包括(comprising)”的方式包含。过渡术语/短语“包括(comprising)”、“包括(comprises)”、“包括(comprise)”、“基本上由……组成(consistingessentially of)”、“基本上由……组成(consists essentially of)”、“包含(consisting)”和“包含(consists)”(以及其任何语法变体)可互换地使用。

短语“基本上由……组成(consisting essentially of)”或“基本上由……组成(consists essentially of)”指示权利要求包括包含指定材料或步骤的实施例，以及不会对权利要求的(多个)基本特性和新颖特性产生实质性影响的那些实施例。

术语“大约”意味着在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，该误差范围将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的限制。通常，“大约”可意味着给定值的高达0-10％的范围。

在本公开中，范围以简写形式陈述，以避免不得不详细陈述并描述范围内的每个和每一个值。在适当的情况下，可选择范围内的任何适当值作为范围的上限值、下限值或端点。例如，范围0.1-1.0表示端点值0.1和1.0，以及中间值0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，以及0.1-1.0中涵盖的所有中间范围，诸如0.2-0.5、0.2-0.8、0.7-1.0等。设想了范围内具有至少两个有效数字的值，例如，范围5-10指示5.0和10.0之间以及5.00和10.00之间的所有值，包括端点值。

如本文中所使用的，术语两个分子之间的“特异性结合”指两个分子之间基于该两个分子之间的特异性相互作用的可测量并且可再现的结合。此类特异性相互作用可包括氢键、疏水力、以及离子键。“特异性结合”不一定需要(尽管可包括)专一结合(exclusivebinding)。例如，抗体通常以低于大约10

在另一方面，两个分子之间的“非特异性结合”指不基于两个分子之间的特异性相互作用的结合。非特异性结合可源于非特异性相互作用，诸如范德华力。两个分子之间的非特异性结合的KD通常高于大约10

本文中使用的术语“靶标”包括感兴趣的分析物。靶标可以是蛋白质、脂质、核酸(例如，RNA、DNA、锁核酸(LNA)、异种核酸(XNA))、糖类、以及碳水化合物。本领域已知靶标的其他示例，并且此类实施例在本发明的范围内。

术语“探针”用于描述某些结合伴侣。探针指特定地结合至靶标的分子。因此，探针可被用于确定靶标的存在。通常，探针包括结合部分和标记部分，该结合部分涉及与其靶标的特异性结合，该标记部分提供有助于检测靶标的荧光信号。因此，探针是发射荧光信号的分子，或者与发射荧光信号的分子偶联。可通过光敏设备检测荧光信号。在关于“标记”的讨论中，下文讨论了荧光信号和发射荧光信号的分子的其他细节。在特定应用中使用的探针的种类取决于靶标分子、可用的检测方法、使用的特定基材、以及本领域熟知的其他参数。此类实施例在本发明的范围内。

“标记”是探针的一部分，或者与探针偶联，并提供通过光敏设备可检测的荧光信号。

示例性荧光团包括但不限于Alexa染料(例如，Alexa 350、Alexa 430、Alexa 488等)、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Dylight染料(Dylight405、Dylight488、Dylight549、Dylight550、Dylight 649、Dylight680、Dylight750、Dylight800)、6-FAM、荧光素、FITC、HEX、6-JOE、俄勒冈(Oregon)绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、REG、罗丹明(Rhodamine)绿、罗丹明红、ROX、R-藻红蛋白(Phycoerythrin)(R-PE)、Starbright蓝染料(例如，Starbright蓝520、Starbright蓝700)、TAMRA、TET、四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine)、得克萨斯(Texas)红、以及TRITC。例如，在PCT公开编号WO 2018/140157中，具体地，在段落[0048]至[0053]中，本领域已知并描述了可用于本文公开的方法中的探针中的其他标记。

探针的结合部分和标记部分可存在于单个实体(例如，能够结合靶标的荧光分子)或多个偶联实体(例如，荧光分子被偶联至能特异性地结合至靶标的分子)中。探针的非限制性示例包括天然或经修饰的肽、蛋白质(例如，抗体、亲合体、或适体)、核酸(例如，多核苷酸、DNA、或RNA)；多糖(例如，凝集素、糖)、脂质、酶、酶底物或抑制剂、配体、受体、抗原、半抗原、小分子、以及合成核酸，诸如LNA和XNA。已知适合在本文所述方法中使用的探针的其他示例，并且此类实施例在本发明的范围内。

也可经由荧光共振能量转移(FRET)识别探针和标记之间的结合。通常，在FRET分析期间，处于激发电子态的供体荧光团将其激发能转移到位于附近(例如，彼此在约1到15纳米以内)的受体发色团。探针和靶标之间的此类靠近是在特定的结合相互作用中实现的，并且因此，激发能从偶联至供体荧光团的探针到偶联至靶标的受体荧光团的转移指示探针和靶标之间的结合。因此，在此类实施例中，探针或靶标可以与供体发色团偶联，并且对应的靶标或探针可以与受体发色团偶联，并且可基于荧光信号的发射来检测探针和靶标之间的结合。本领域中已知合适的供体和受体荧光团对，并且此类实施例在本发明的范围之内。

如本文中所使用的，术语“动力学指纹”指探针与靶标的时间依赖的结合特性。动力学指纹可用于区分探针和靶标之间的特异性结合和探针和非靶标之间的非特异性结合。例如，动力学指纹可用于识别并区分来自探针和靶标的结合的信号与来自探针和非靶标的非特异性结合的信号。这是因为探针在与对应靶标的相互作用中以独特的方式表现，并且如果在一段时间内(例如，超过5到10分钟)在探针和靶标之间观察到这种表现，则这种独特的表现可用于识别探针和靶标之间的特异性结合。在另一方面，如果在一段时间内(例如，超过5到10分钟)没有观察到探针和靶标之间的独特表现，则缺少该独特表现可用于将探针和靶标之间的结合识别为非特异性。PCT公开WO2018/140157的图1A-1C和段落[0025]到[0027]描述了探针和其靶标之间的特异性结合的独特表现的某些方面，并且将此类独特表现和探针与非靶标之间的非特异性结合进行区分。对于已知的一对探针及其特异性靶标，该独特表现也可用于分离可能由非特异性相互作用产生的不需要的信号，并且因此，在进一步分析期间，否则将干扰特异性结合相互作用的测量的信号可被过滤或忽略。

k

任何两个分子可以以不同的亲和力彼此结合，或者可能彼此完全不结合。如本文中所使用的，短语“结合伴侣”描述特异性地彼此结合的分子。例如，结合伴侣对中的一者可以是探针，并且另一者可以是特异性靶标分子。类似地，结合伴侣中的一者可以是抗体，并且另一者可以是抗体特异性地与之结合的特异性抗原。合适的结合伴侣的示例包括但不限于核酸和核酸；蛋白质或肽和核酸；蛋白质或肽和蛋白质或肽；抗原和抗体；受体和配体，半抗原和关联抗体，多糖和蛋白质，以及药物化合物和关联生物靶标。本领域已知结合伴侣的其他示例，并且此类实施例在本发明的范围内。

在分子结合相互作用中，特异性指示分子识别其结合伴侣的程度。例如，免疫系统对抗原的特异性确定该免疫系统可以区分不同抗原并且仅响应相关抗原的程度。因此，特异性定义免疫反应区分抗原变体的程度。通过测量抗体或T细胞对不同抗原变体的相对结合亲和力，可以测量免疫器官(诸如抗体或T细胞)的特异性。在另一方面，分子结合相互作用中的交叉反应测量不同结合伴侣对探针而言的相似程度。

在WO 2018/140157中公开并且在下文中再现了抗原对其抗体的示例性结合特性，以及它们对解离速率对比总解离时间的影响。

K

K

单分子的动力学分析需要昂贵的设备。在设计此类系统时，考虑到重要的工程权衡。例如，在分析动力学信息时，可用于提高系统的信噪比的时间平均量是有限的。此外，因为随时间监测分子的动力学结合，因此除非使用具有非常快速结合特性的分子，否则该方法在本质上是缓慢的。在一个示例中，可能需要5到10分钟来观察几个结合相互作用以得到明确的分子相互作用的动力学指纹。在该情况下，按照时间顺序依次分析不同分子可能是不切实际的，并且必须并行分析不同的靶标。

例如，由于荧光的弱性质，因此使用成像系统实现单分子检测并非易事。要在照明功率、成像面积、成像分辨率之间作出困难的工程权衡，其中，所有这些权衡影响系统的成本和速度，并影响可并行成像的不同靶标的数量。本公开提供了使用被设计为增强荧光信号的强度的基材，允许并行分析更大数量的分子。使用此类基材还使系统更快，并且更便宜。此外，对位于基材表面附近的分子产生的信号表现出增强检测的基材尤其使得能够对单个分子进行动力学结合分析用于靶标检测。

本公开提供用于明确识别单分子和与其结合伴侣的相互作用的方法，该方法使用被调整为增强由位于基材的表面附近的分子发射的荧光信号的基材。图1中提供了这种系统的示例。

本公开还涉及被设计为利用单分子检测技术最小化或消除非特异性结合或噪声的测定。该测定依赖于在测定表面上测量一个分子(优选地，是生物分子)结合至所有分子(优选地，是各种生物分子的阵列，包括其结合伴侣)的概率。在一定时间段内，在测定表面上观察到分子与其结合伴侣在个体水平上的相互作用。该方法允许计算与位于测定表面上的其结合伴侣特异性地结合的分子的数量，即使由于探针分子与捕获表面的非特异性相互作用而存在更大量的非特异性结合事件也是如此。基于特异性分子相互作用的相互作用或动力学特征与非特异性相互作用的相互作用或动力学特征的差异，可进行此类区分。这种非特异性噪音的最小化或消除导致低得多的定量限。

因此，本发明的某些实施例提供分析探针及其靶标之间的结合相互作用的方法。该方法包括：将探针与显示出与探针的快速解离速率结合特性的靶标接触，以产生探针和靶标之间的结合相互作用，并通过在多个位置对探针进行单分子检测来检测探针和靶标之间的结合相互作用，其中，靶标被固定到基材上，该基材被设计为增强从位于基材表面附近的探针发射的荧光信号。

因此，发射荧光信号或偶联至发射荧光信号的分子的结合伴侣被允许与具有于其上固定的某些靶标的表面接触。固定至表面上的靶标可包括与发射荧光信号的探针或偶联至发射荧光信号的分子的探针特异性地结合的分子。探针与固定在表面上的许多不同靶标瞬时地相互作用，在解结合之前与一些靶标结合达长时间，同时与其他靶标结合达较短时间，并且仍然完全不结合一些靶标。在优选实施例中，通过荧光显微镜(诸如全内反射荧光(TIRF)显微镜)对表面处的瞬时结合事件进行成像。

在某些实施例中，软件程序识别发生探针分子与表面的重复结合的所有位置。然后，该软件分析这些区域中的每一者的动力学表现，并识别哪些区域可归因于感兴趣的特异性探针/靶标相互作用，以及哪些区域可归因于不感兴趣的非特异性结合。例如，与其他点处相比，某些探针在一些点处停留(结合)的时间更长，这指示，相比于其他点处的分子，探针在不同的频率下与某些点处的分子结合。

以下公式优选地表征了瞬时结合：

K

探针的瞬时结合的任何合适度量(包括K

观察到的探针与靶标的结合的停留时间可以在大约1纳秒到大约10分钟之间或更久。通过在大约1纳秒到大约10分钟、1小时或一天的时间范围内在特定点观察到的结合和解离事件(即，瞬时事件)的总数，可以测量结合频率。通过停留时间和相互作用频率、解离时间段、和/或信号强度等的组合，可描述探针与基材表面上固定的靶标生物分子的瞬时结合的不同模式。

因此，本发明的特定实施例提供了通过增强荧光信号确定单分子动力学指纹的方法，该荧光信号指示发射荧光信号的一个或多个探针和一个或多个靶标之间的结合相互作用，该方法包括：

a)将一个或多个靶标(例如，捕获抗体)固定到基材上，该基材被设计为增强由一个或多个探针在位于基材表面附近时发射的荧光信号，

b)将一个或多个探针与固定至基材上的一个或多个靶标接触，

c)在单分子水平上检测一个或多个探针与一个或多个靶标之间的相互作用，以确定单分子动力学指纹。

一个或多个靶标可通过偶联至基材来固定至基材上。例如，使用亲水自组装单层，一个或多个靶标(例如，核酸靶标)可被固定至基材上。例如，经由商购自SoluLinK的溶液，在表面钝化之前或同时，可将一个或多个靶标附接至基材上。一个或多个靶标也可以偶联至赋予苯甲醛官能团的异双功能PEG接头(例如，PEG-4)。例如，可以使用腙官能团激活基材(诸如玻璃)，并且可以通过一个或多个靶标的苯甲醛衍生物与表面腙官能团之间的高度特异性的高效反应，以低占据率(<0.8面积％)将一个或多个靶标附接至表面。一个或多个靶标在基材上的分布可由靶标浓度和反应时间控制占据率。经由靶标固定中使用的相同偶联化学，可以用单官能(苯甲醛)PEG链钝化未被占据的表面区域。本领域已知将靶标偶联至基材的其他示例，并且，例如，在PCT公开编号WO 2018/140157中，具体地，在段落[0072]至[0079]中，描述了此类示例。此类实施例在本发明的范围内。将靶标偶联至基材的其他示例在以下文献中描述：《生物偶联技术(Bioconjugate Techniques)》，第三版，2013，爱思唯尔公司(Elsevier Inc.)，Greg T Hermanson编；以及《酶和细胞的固定(Immobilization ofEnzymes and Cells)》，第三版，2013，Jose M Guisan编，哈门那(Humana)出版社。这些参考文献的内容通过引用以其全文纳入本文。马塞诸塞州沃尔瑟姆市的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)提供了将靶标偶联至基材的商业方法，并且此类方法的使用在本发明的范围内。此外，将核酸偶联至基材的方法用于核酸分析中，例如，在下一代测序和微阵列分析中。此类方法的使用也在本发明的范围内。

也可经由与偶联至基材的实体的特异性结合将一个或多个靶标固定至基材上。例如，捕获抗体可被固定在表面上。在另一个示例中，一个或多个靶标可被偶联至生物素，该生物素经由链霉亲和素的特异性结合与偶联至基材并包含链霉亲和素的实体相结合。本领域已知可用于将一个或多个靶标固定至固定在基材上的实体的此类结合对的其他示例，并且此类实施例在本发明的范围内。

从样品(例如，生物样品)中可获取一个或多个靶标。可用偶联有一个或多个实体的基材处理此类生物样品，在样品中，该一个或多个实体与一个或多个靶标特异性结合。已知与一个或多个靶标特异性结合的一个或多个实体在基材上的位置。一旦来自生物样品的一个或多个靶标结合到基材上的实体，来自生物样品的未结合的分子可从基材上被洗去，并且然后，基材可以与一个或多个探针接触，以研究该一个或多个探针与固定在基材上的该一个或多个靶标之间的结合相互作用。

本领域已知被设计为增强由位于基材表面附近的分子发射的荧光信号的表面的几个示例。例如，增强由位于基材表面附近的荧光分子发射的荧光信号的表面的示例公开于以下文献(其中每一者通过引用以其全文并入本文)中：欧洲专利编号：EP2257790(美国专利8679855)和EP2110658(美国专利8421036)；美国专利编号：9459212、9464988、8993339、以及9709538；以及美国专利申请公开编号：20150377783、20170152549、20190017934、20190262947、20170168048、20150338345、20140374621、20140323323、20140256593、20130094021、20120058697、20110269644、20100159614、20100009862、20090117006、20080166270、20020132376、以及20020010279。在某些实施例中，基材包括基于棱镜的表面等离子体激元共振架构。在优选实施例中，基材包括金属光栅结构、光子晶体结构、纳米图案化表面、或纳米结构化表面。本领域已知被设计为增强由位于基板表面附近的分子发射的荧光信号的基材的其他示例，并且此类实施例在本发明的范围内。

在某些实施例中，探针被设计为增强由位于基材表面附近的探针发射的荧光信号。例如，探针可被偶联至纳米颗粒(诸如荧光增强的纳米颗粒或珠粒(金或银纳米颗粒或珠粒))，该纳米颗粒增强由探针在位于基材表面附近时发射的荧光信号。

将一个或多个探针与固定在基材上的一个或多个靶标接触的步骤在允许一个或多个探针与一个或多个靶标之间的结合的条件下进行。通常，此类条件包括合适的缓冲液、合适的温度、以及合适的时间长度。本领域普通技术人员可确定用于一个或多个探针和一个或多个靶标的给定集合的合适条件。

在单分子水平上检测一个或多个探针与一个或多个靶标之间的相互作用的步骤包括检测一个或多个探针在一个或多个靶标所固定至的基材上的位置处的存在。本领域已知用于在分子水平上实时检测荧光信号的几种方法，例如，由位于基材上的已知位置的分子引起的荧光信号。由Croop等(2019)，《威利跨学科评论：系统生物和医学》(WIREsSystems Biology and Medicine)，第11卷，第4期，e1445评论并描述了在单分子水平上实时检测荧光信号的某些示例。Croop等的公开通过引用以其全文并入本文。本领域已知在单分子水平上实时检测荧光信号的其他示例，并且此类实施例在本发明的范围内。

在优选实施例中，一个或多个探针中的至少一个探针和一个或多个靶标中的至少一个靶标之间的瞬时相互作用显示出快速解离速率结合特性。例如，一个或多个探针中的至少一个探针和一个或多个靶标中的至少一个靶标之间的瞬时相互作用具有大约10分钟到大约1纳秒的观察到的停留时间。

检测一个或多个探针与一个或多个靶标之间的相互作用，并将相互作用关联以确定一个或多个探针与一个或多个靶标的结合特性，可用于对一个或多个探针与一个或多个靶标之间的特异性结合相互作用和探针分子与围绕捕获分子的表面的非特异性结合进行区分。为了区分特异性和非特异性结合，考虑到几个结合特性，例如，在特定靶标分子处的结合和解离事件的总数，以及瞬时相互作用的数量。