法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-06-03
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种高表达ADAM-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备及其应用。
背景技术
黑色素瘤是由黑色素细胞而恶变引发的一种皮肤癌，主要是由紫外线(UV)诱导DNA发生突变而产生，多发生于皮肤，偶发于粘膜和内脏，具有高侵染性，易复发等特点。黑色素瘤是第三常见的皮肤癌，黑色素瘤的发病率上升迅速，是发病率上升最高的癌症之一，其中转移性黑色素瘤具有很高的致命性，是最致命的皮肤癌。免疫系统主要通过CD8
目前，关于ADAM-28与黑色素瘤的相关研究比极少。通过对公共数据库的分析，我们的研究发现：恶性黑色素瘤细胞中ADAM-28的表达水平极低；而且ADAM28的表达水平越高，黑色素瘤患者预后越好。因此， ADAM-28很可能在免疫系统对抗黑色素瘤的过程中起重要作用；高表达ADAM-28的黑色素瘤细胞可能更易激发抗肿瘤免疫应答，具备成为自体黑色素瘤苗的潜力。
发明内容
要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种高表达ADAM-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，由此制备的肿瘤疫苗能激发机体高水平的CD8
技术方案：一种高表达ADAM-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1.携带ADAM-28基因的Venus载体的构建：
设计一对带有BamH1和Xho1酶切位点的特异性引物，使用PCR的方法扩增出目的片段，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM-28基因，采用BamH1和Xho1进行酶切，然后进行产物回收；将回收产物与经BamH1和Xho1双酶切的Venus载体片段连接，将连接产物转化至DH10B的感受态细胞，挑取单菌扩大培养后进行酶切鉴定获得阳性质粒Venus-ADAM28；
S2. 高表达ADAM-28基因的黑色素瘤细胞系的构建：
将S1获得的阳性质粒Venus-ADAM28与辅助质粒ΔR、REV和VSVG共转染293T细胞，获得重组慢病毒；再将获得重组慢病毒感染黑色素瘤细胞B16-F10，然后筛选出过表达ADAM-28的B16-F10细胞，通过定量PCR的方法鉴定出高表达ADAM-28的B16-F10细胞，下称B16-Adam28细胞；
S3.高表达ADAM-28的自体黑色素瘤疫苗的制备：
收集培养密度达70%-80%的B16-Adam28细胞，将细胞以磷酸盐缓冲液悬浮后，进行辐照处理，并离心去除上清液，将离心收集的细胞沉淀以磷酸盐缓冲液重悬至10
所述步骤S1中一对带有BamH1和Xho1酶切位点的特异性引物分别为：
引物1 SEQ NO.1：GGATCCATGCAGCAATGGAGTCT；
引物2 SEQ NO.2：CTCGAGTCAGACTTTTGCATTTGG。
优选的，所述S1中以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM-28基因的条件为：
94℃预变性4min；
94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸2.5min，3个循环；
94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸2.5min，30个循环；
72℃延伸10min；
12℃冷却30min。
优选的，所述S2中阳性质粒Venus-ADAM28，辅助质粒ΔR，辅助质粒REV和辅助质粒VSVG混合比例为质量比(10-11):(6.5-7):(2.3-2.8):(3-3.5)。
优选的，所述S3中辐照处理为用γ射线辐照，辐照剂量为50-100Gy。
上述高表达ADAM-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法制备得到的黑色素瘤自体肿瘤疫苗。
上述黑色素瘤自体肿瘤疫苗在制备肿瘤预防及治疗药物中的应用。
优选的，所述肿瘤为黑色素瘤。
有益效果：本发明的高表达ADAM-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用，具有以下优点：
1. 通过PCR方法从B16细胞中扩增出ADAM-28基因，将其克隆入慢病毒载体中构建重组慢病毒，用重组慢病毒感染B16-F10细胞，得到高表达ADAM-28的黑色素瘤细胞系，通过辐照灭活后，得到黑色素瘤自体肿瘤疫苗，该疫苗经体内试验证明具有肿瘤免疫预防效果；
2. 本发明构建的高表达ADAM-28的B16-F10细胞（疫苗）ADAM-28表达水平显著提高；射线处理过的B16-Adam28细胞接种小鼠后，可显著提高小鼠脾脏中CD8
3. 本发明首次制备高表达ADAM-28的黑色素瘤细胞系，并以此制备得到黑色素瘤自体肿瘤疫苗。通过小鼠肿瘤模型，验证了该疫苗高效激活CD8
附图说明
图1为实施例2中高表达ADAM-28的黑色素瘤细胞的流式细胞图；
图2为实施例2中高表达ADAM-28的黑色素瘤细胞的显著性差异分析图；
图3为实施例3中肿瘤体积与时间的关系图；
图4为实施例4中自体肿瘤疫苗对脾脏中CD8
图5为实施例4中自体肿瘤疫苗对脾脏中CD8
图6为实施例4中自体肿瘤疫苗对脾脏中CD8
上述附图中，* 表示差异具有显著性： *
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种高表达ADAM-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1.携带ADAM-28基因的Venus载体的构建：
设计一对带有BamH1和Xho1酶切位点的特异性引物，特异性引物序列如下：引物1SEQ NO.1：GGATCCATGCAGCAATGGAGTCT；引物2 SEQ NO.2：CTCGAGTCAGACTTTTGCATTTGG；使用PCR的方法扩增出目的片段，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM-28基因，采用BamH1和Xho1进行酶切，然后进行产物回收；将回收产物与经BamH1和Xho1双酶切的Venus载体片段连接，将连接产物转化至DH10B的感受态细胞，挑取单菌扩大培养后进行酶切鉴定获得阳性质粒Venus-ADAM28，其中，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM-28基因的条件为：
94℃预变性4min；
94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸2.5min，3个循环；
94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸2.5min，30个循环；
72℃延伸10min；
12℃冷却30min；
S2. 高表达ADAM-28基因的黑色素瘤细胞系的构建：
通过CaCl
S3.高表达ADAM-28的自体黑色素瘤疫苗的制备：
收集培养密度达70%-80%区间范围的B16-Adam28细胞，将细胞以磷酸盐缓冲液悬浮后，进行γ射线辐照处理，辐照剂量为100Gy，并离心去除上清液，将离心收集的细胞沉淀以磷酸盐缓冲液重悬至10
实施例2
一种高表达ADAM-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1.携带ADAM-28基因的Venus载体的构建：
设计一对带有BamH1和Xho1酶切位点的特异性引物，特异性引物序列如下：引物1SEQ NO.1：GGATCCATGCAGCAATGGAGTCT；引物2 SEQ NO.2：CTCGAGTCAGACTTTTGCATTTGG；使用PCR的方法扩增出目的片段，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM-28基因，采用BamH1和Xho1进行酶切，然后进行产物回收；将回收产物与经BamH1和Xho1双酶切的Venus载体片段连接，将连接产物转化至DH10B的感受态细胞，挑取单菌扩大培养后进行酶切鉴定获得阳性质粒Venus-ADAM28，其中，以B16细胞cDNA为模板，扩增出ADAM-28基因的条件为：
94℃预变性4min；
94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸2.5min，3个循环；
94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸2.5min，5个循环；
94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸2.5min，30个循环；
72℃延伸10min；
12℃冷却30min；
S2. 高表达ADAM-28基因的黑色素瘤细胞系的构建：
通过CaCl
S3.高表达ADAM-28的自体黑色素瘤疫苗的制备：
收集培养密度达70%-80%区间范围的B16-Adam28细胞，将细胞以磷酸盐缓冲液悬浮后，进行γ射线辐照处理，辐照剂量为100Gy，并离心去除上清液，将离心收集的细胞沉淀以磷酸盐缓冲液重悬至10
对比例1
采用Venus替换实施例2中的阳性质粒Venus-ADAM28作为对照，其他工艺条件均与实施例2中相同，得到对比例细胞（疫苗）为B16-V细胞。
对比例2
采用未感染病毒的黑色素瘤细胞作为对照，得到对比例细胞（疫苗）为B16细胞。图1中的结果表明，Venus和Venus-ADAM28病毒均能高效的感染B16细胞，得到B16-Venus和B16-Adam28细胞系。图2中定量PCR的结果表明，B16-Adam28细胞中ADAM-28基因的表达水平是对照细胞B16和B16-Venus的7000倍。这些结果表明，通过本发明中的构建方法得到了高表达ADAM-28的黑色素瘤细胞系B16-Adam28。
实施例3
动物实验：
实验分组：试验分3组，分别为γ射线辐照过的B16细胞（对比例2）、B16-Venus细胞（对比例1）和B16-Adam28细胞（实施例2）。C57BL/6小鼠分别用1×10
图3为肿瘤体积与时间的关系，可以看出B16-Adam28组肿瘤生长速度较其它组均有显著下降，差异显著；该结果表明，本发明公开的高表达ADAM-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗具有很好的肿瘤免疫预防效果。
实施例4
取实施例3中的小鼠，在接种肿瘤18天后处死，收集小鼠脾脏细胞，通过细胞计数及流式细胞术分析CD8
图4和5为上述自体肿瘤疫苗对脾脏中CD8
图6为上述自体肿瘤疫苗对脾脏中CD8
以上结果说明本发明公开的高表达ADAM-28的自体黑色素瘤苗可以诱导高水平的CD8
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州慧疗生物医药科技有限公司
苏州大学
<120> 高表达ADAM-28的黑色素瘤自体肿瘤疫苗的制备方法及其应用
<130> 2022.04.26
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 1
ggatccatgc agcaatggag tct 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 2
ctcgagtcag acttttgcat ttgg 24
