一种与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染相关的几丁质结合蛋白基因上的SNP标记及其应用

摘要

本发明公开了一种与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染相关的几丁质结合蛋白基因上的SNP标记及其应用。所述的SNP标记位于如SEQ ID NO.1所示的凡纳滨对虾几丁质结合蛋白基因序列的501bp位点处，突变类型为T纯合、T/A杂合和A纯合，该标记的抗副溶血弧菌感染优势基因型为T纯合。本发明同时公开了利用上述标记进行抗副溶血弧菌感染性状标记辅助育种的应用方法。本发明提供了一种有效地开展凡纳滨对虾分子标记辅助抗副溶血弧菌感染性状遗传选育的方法，该方法效率高，操作简单，选育个体基因型稳定，不发生遗传分化，可显著加快抗病育种进展，对提高凡纳滨对虾抗病养殖具有重要指导意义。

说明书

技术领域

本发明属水产养殖生物技术领域，更具体地说，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种凡纳滨对虾几丁质结合蛋白基因上一个引起氨基酸序列改变产生的SNP分子标记，和其在抗副溶血弧菌感染对虾亲本、虾苗鉴定及抗病育种方面的应用。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei，俗称南美白对虾)是世界和我国产量第一大养殖对虾主要种类，在满足人民优质蛋白食品需求方面具有重大作用。根据《2021中国渔业统计年鉴》，2020年我国凡纳滨对虾养殖年产量186万多吨，占全国对虾年产量的86％，虾苗生产量15000多亿尾，市场对良种的需求巨大。然而，近年来频繁暴发的细菌性病害给养殖生产造成了巨大的经济损失；另一方面，细菌性病害的流行和有效防控技术不足也造成了抗菌素的乱用和滥用，产生药物残留、环境污染、抗药性菌株蔓延等诸多负面影响。因此，从种质层面入手，深入发掘和利用凡纳滨对虾的抗菌种质，选育抗菌能力强的优良新品种和筛选抗菌能力强的苗种用于养殖生产，成为细菌性病害防控研发的重点和热点。

细菌病是危害最严重的病害之一，而弧菌病是对虾养殖过程中最为常见、危害最大的细菌性疾病。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人们发现最早的对虾弧菌病原，是凡纳滨对虾主要的条件致病菌。近年来对虾养殖中最为严重的疾病之一“急性肝胰腺坏死综合症(AHPND)”就是由携带毒力基因Pir A和Pir B的副溶血弧菌导致的。2009年首次报道在中国暴发凡纳滨对虾AHPND，随后在墨西哥、马拉西亚、泰国、菲律宾、越南、孟加拉国和美国相继暴发。具体症状为肝胰腺苍白，萎缩，脱落，空肠空胃，发病1-3天内病死率达到100％，给养殖生产造成了极大地损失。

由于坚硬表皮的限制，甲壳动物必须经过蜕皮才能发育和生长。凡纳滨对虾一生经历 35～37次蜕皮，每次蜕皮后免疫力下降，均是弧菌最容易入侵的时期。作为表皮组成成分的几丁质是和蛋白质以结合的形式存在，此蛋白即为几丁质结合蛋白(Chitinbinding protein， CBP)，是甲壳动物表皮中重要的结构性蛋白，该类蛋白一般含有特征性的结构域，与几丁质构成的复合物不仅为钙化作用提供有机支架，而且参与控制钙化的程度，对蜕皮后凡纳滨对虾的抗弧菌感染能力具有重要作用。

随着现代生物技术和遗传学技术在水产领域的快速转化，以性状相关功能基因为基础的分子标记技术成为水产遗传育种的关键技术之一。SNP作为一种遗传标记，具有发生频率高、能稳定遗传、易进行自动化检测等优点，并且在不同物种、不同品种间SNP分布都存在差异。而在水产动物种苗繁育和遗传育种中，SNP标记已运用多年，一些与生长、繁殖及抗病性状等相关的分子标记陆续被筛选到。本发明旨在通过发掘与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关的SNP标记，并通过应用该标记建立一种用于凡纳滨对虾分子标记辅助抗病育种的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关的几丁质结合蛋白基因上的SNP标记及其应用，从而实现凡纳滨对虾的分子标记抗病育种。

本发明的第一个目的是提供一种与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关的SNP分子标记。

本发明发现凡纳滨对虾几丁质结合蛋白基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)位点的多态性。该位点位于几丁质结合蛋白基因501bp位置，该碱基为T或A，此处为T纯合(T/T) 的凡纳滨对虾在副溶血弧菌感染条件下，存活率显著高于T/A杂合(T/A)，T/A杂合又显著高于A纯合(A/A)。该SNP位点为T/T基因型的凡纳滨对虾个体，具有很好的抗副溶血弧菌感染能力，而且该性状在后代中能稳定遗传；该SNP位点为T/A基因型的凡纳滨对虾个体，具有较好的抗副溶血弧菌感染能力，但该性状在后代不能稳定遗传；该SNP位点为A/A基因型的凡纳滨对虾个体，抗副溶血弧菌感染能力的能力较差。因此，该SNP分子标记的抗副溶血弧菌感染优势基因型为T纯合(T/T)。

因此，本发明提供了区分凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力的SNP分子标记，其位于凡纳滨对虾几丁质结合蛋白基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)的501bp位点处，突变类型T纯合(T/T)、T/A杂合(T/A)和A纯合(A/A)。

本发明的第二个目的是提供一种区分凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染性状相关的SNP分子标记的检测引物，包括以下引物：

LvCBP-SNP-F：5'-CCAAGGCAATGAAACCCTCAGACA-3'；

LvCBP-SNP-R：5'-TCATTCATCCATCACCATAAGT-3'。

所述的检测引物扩增稳定、重复性好。扩增产物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的SNP位点位于扩增序列的324bp位置，为T到A的突变，该标记的抗副溶血弧菌感染优势基因型为T纯合(T/T)。

本发明的第三个目的是提供鉴别所述的SNP分子标记的产品在制备区分凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力的试剂中应用。

本发明的第四个目的是提供所述的SNP分子标记或所述的检测引物在制备区分凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力的检测试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种区分凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力检测试剂盒，该试剂盒包含所述的检测引物。

本发明的第六个目的是提供所述的SNP分子标记、所述的检测引物或所述的检测试剂盒在区分凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力中的应用。

所述的SNP分子标记为T纯合基因型的凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力显著高于T/A 杂合基因型，SNP分子标记为T/A杂合基因型的凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力又显著高于A纯合基因型。

本发明的第七个目的是提供所述的SNP分子标记、所述的检测引物或所述的检测试剂盒在抗副溶血弧菌感染性状凡纳滨对虾亲虾个体鉴定、群体选育或耐副溶血弧菌感染凡纳滨对虾高抗品系维持中的应用。

本发明的第八个目的是提供一种凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染品种的选育方法，包括以下步骤：

a)提取待测凡纳滨对虾基因组DNA；

b)利用权利要求2所述的检测引物LvCBP-SNP-F/LvCBP-SNP-R对待测凡纳滨对虾基因组DNA进行PCR扩增；

c)使用LvCBP-SNP-F引物对扩增产物进行Sanger测序，根据测序峰图对上述的抗副溶血弧菌感染性状相关位点进行SNP分型；

d)选择T纯合型的雌虾和雄虾作为亲本，进行交配产生下一代育种群体。

优选的，所述的PCR扩增，其反应体系25μL，包括：不含Mg

优选的，所述的PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。

优选的，所述的PCR扩增产物，采用ABI公司3730xl DNA Analyzer测序仪进行Sanger 测序。

本发明提供了一种有效地开展凡纳滨对虾分子标记辅助抗副溶血弧菌感染性状遗传选育的方法，该方法效率高，操作简单，选育个体基因型稳定，不发生遗传分化，可显著加快抗病育种进展，对提高凡纳滨对虾抗病养殖具有重要指导意义。

附图说明

图1是凡纳滨对虾几丁质结合蛋白基因LvCBP-SNP-F和LvCBP-SNP-R引物对扩增324 bp位置的T纯合、A纯合和T/A杂合峰图(因毛细管桑格测序前几十碱基读数不准确，故三个测序峰图324bp位置分别显示为280、290和300bp)。

图2是凡纳滨对虾几丁质结合蛋白基因两种基因型编码氨基酸序列比对。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

实施例1

湛江某对虾养殖场，采集凡纳滨对虾若干尾，分别取游泳足提取各凡纳滨对虾的基因组DNA(取组织不影响该凡纳滨对虾的存活)，利用LvCBP-SNP-F和LvCBP-SNP-R引物对进行扩增，具体方法如下：

扩增引物：

LvCBP-SNP-F：5'-CCAAGGCAATGAAACCCTCAGACA-3'；

LvCBP-SNP-R：5'-TCATTCATCCATCACCATAAGT-3'。

扩增体系：

PCR扩增反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。使用LvCBP-SNP-F引物对PCR扩增产物进行测序，测序采用 ABI公司3730xl DNA Analyzer测序仪进行Sanger测序。

结果发现：该场所养殖的凡纳滨对虾在几丁质结合蛋白基因501bp位置(LvCBP-SNP-F 和LvCBP-SNP-R引物对扩增324bp位置)包含3种突变类型，分别为T纯合、A纯合和T/A杂合，其测序峰图如图1所示。当该位点为T时，编码蛋白序列第153氨基酸为天门冬酰胺(N)；当该位点为A时，编码蛋白序列第153氨基酸为异亮氨酸(I)。两种氨基酸序列比对如图2所示。

实施例2

湛江某对虾养殖场规格7～8cm凡纳滨对虾500尾，分别取游泳足提取各凡纳滨对虾的基因组DNA，按照实施例1的方法使用本发明所描述引物对进行扩增和测序。由此鉴别获得几丁质结合蛋白基因501bp位置T纯合基因型202尾、A纯合基因型243尾、T/A杂合基因型55尾。

副溶血弧菌由中国科学院南海海洋研究所从急性肝胰腺坏死综合症凡纳滨对虾肝胰腺分离。菌种于25％甘油-80℃中保存，划线于LB固态培养基培养，接种于LB液态培养基30℃震荡培养24小时。将菌液3000g高速离心10分钟，沉淀菌体用PBS缓冲液冲洗3次后等体积悬浮。菌液浓度通过分光光度计560nm(OD560)测定，通过平板涂布实验，确定副溶血弧菌菌株浓度为：每OD560为1.43×10

此处为T纯合的凡纳滨对虾在副溶血弧菌感染条件下，存活率显著高于T/A杂合，T/A杂合又显著高于A纯合,该标记的抗副溶血弧菌感染优势基因型为T纯合。

实施例3

湛江某对虾种苗场规格25-28cm凡纳滨对虾亲虾，分别取游泳足提取各凡纳滨对虾的基因组DNA，按照实施例1的方法使用本发明所描述引物对进行扩增和测序。分别获得T/T纯合基因型、T/A杂合基因型、A/A纯合基因型亲虾各一对进行繁育。待子一代全同胞家系稚虾生长至3cm，每个家系各取300尾进行副溶血弧菌攻毒实验(同实施例2)。其中，亲本T/T纯合基因型亲虾所产生稚虾存活143尾(47.7％)；亲本T/A杂合基因型亲虾所产生稚虾存活75尾 (25.0％)；亲本A/A纯合基因型亲虾所产生稚虾存活32尾(10.7％)。由此可见，该SNP位点为T/T基因型的凡纳滨对虾个体，具有较好的抗副溶血弧菌感染能力，而且该性状在后代中能稳定遗传；该SNP位点为T/A基因型的凡纳滨对虾个体，产生后代抗副溶血弧菌感染能力较差；该SNP位点为A/A基因型的凡纳滨对虾个体，产生后代抗副溶血弧菌感染能力极差。因此，对该SNP位点为T/T基因型的凡纳滨对虾个体的筛选和鉴定，在抗副溶血弧菌感染性状凡纳滨对虾亲虾鉴定、群体选育上，及在耐副溶血弧菌凡纳滨对虾高抗品系维持上，均有非常重要的应用价值。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染相关的几丁质结合蛋白基因上的SNP标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1990

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 1

tatgtatata tatatatata tatatatata tatatatata tatacatata tatatatata 60

tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 120

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tgttttctgg 1990

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 2

ccaaggcaat gaaaccctca gacaagtcat ggagattcgt tgtttattgt tgacaaggag 60

agaagcagga gatggtctcg ctgcatctct ggtgcatgac gtcgaagttc ccgagaggac 120

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tga 783