一种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，本发明以B.subtilis 168为出发菌株，使用CRISPR/Cpf1技术在基因组上整合了木糖诱导型启动子PxylA控制的转录因子comK‑comS基因，使其转化效率大幅提高；回复突变了trpC基因和gudB基因，使其能够合成色氨酸并有效利用谷氨酸家族氨基酸；此外，将6个胞外蛋白酶基因进行了敲除，不仅降低了细胞的代谢压力，而且使重组蛋白能在胞外有效累计。利用最终的工程菌株G601在进行发酵时生产的胞外sfGFP的含量是B.subtilis 168的1.88倍，胞内胞外sfGFP总含量是B.subtilis 168的1.94倍。由本发明构建的工程菌转化简便、无营养缺陷、有更好的氨基酸利用能力、胞外蛋白酶活性低，能广泛应用于重组蛋白的分泌表达，具有广阔的应用前景。