两种蒽醌类化合物在防治根结线虫病方面的应用

摘要

本发明公开了两种蒽醌类化合物在防治根结线虫病方面的应用，涉及生物农药应用领域。本发明所述两种蒽醌类化合物源于掌叶大黄根茎提取物，分别为大黄素(1,3,8‑三羟基‑6‑甲基蒽醌)和芦荟大黄素(1,8‑二羟基‑3‑羟甲基蒽醌)，其对南方根结线虫等有较高的致死率，可用于开发源于中药草的杀线剂；可用于制备防治根结线虫病的水乳剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、可溶粒剂、水分散粒剂、悬浮剂、油悬浮剂和片剂。本发明难以使线虫产生抗药性，也不存在药剂残留问题，符合有害生物绿色防控技术的基本要求；本发明用于防治植物根结线虫病，有利于保护农田生态环境和生物多样性，具有良好的生态效益。

说明书

技术领域

本发明涉及生物农药应用领域，尤其涉及两种蒽醌类化合物在防治根结线虫病方面的应用。

背景技术

根结线虫病是制约农业可持续生产的重要瓶颈之一，防治不当极易造成严重的经济损失。根结线虫病属于典型的土传病害，病原习性隐蔽，抗逆性强，生产中极易与缺肥症状混淆而引起误判，与空气、水及种苗等传播途径的病害相比更难防治。根结线虫不仅直接危害植株，造成植株萎蔫黄化，发育迟缓甚至整株死亡，还可诱发青枯病、黑胫病和根黑腐病等其他土传病害。

为有效控制根结线虫病危害，国内外在化学防治、物理防治和生物防治等方面已开展了相关研究。相对而言，土壤化学熏蒸为最彻底有效的方法，但因成本高，且对土壤微生态环境破坏严重，致使棉隆、威百亩等熏蒸剂难以在烟地大面积推广应用。随着高污染、高残留、高毒性的化学杀线剂(例如涕灭威、呋喃丹等)逐渐被淘汰或限制使用，研制绿色高效的杀线剂品种则尤为重要，其中植物源农药则为根结线虫绿色防控的一个重要研究方向。

植物源杀线剂源于自然，具有残留低、污染少、分解快、毒性小等优点。利用杀(抑)线植物的有效活性部位或植物提取物，或将杀线植物与线虫寄主植物混种均可用来控制线虫危害。目前，研究发现的杀(或抑)线植物主要涉及万寿菊属(Tagetes)、大戟属(Euphorbia)、蓖麻属(Ricinus)、合欢属(Acacia)、按属(Eucalyptus)、罗勒属(Ocimum)、葱属(Allium)、大麻属(Cannabis)等植物。在烟草根结线虫防治方面，苦参(Sophoraflavescens)、猪屎豆(Crotalaria pallida)、孔雀草(Tagetes patula)、万寿菊(Tageteserecta)等均具有较好的防治效果。此外，辣根(Horseradish essential)、花椒(Zanthoxylum bungeanum)对茄科作物番茄根结线虫也具有较好的防治效果。竹醋液、夹竹桃(Nerium indicum)、苦楝(Melia azedarach)、马缨丹(Lantana camara L.)对南方根结线虫也具有较好的生物活性。

掌叶大黄(Rheum palmatum L.)为多年生草本植物，属蓼科(Polygonaceae)大黄属(Rheum)，广泛分布于我国西北和西南等地区。迄今为止，掌叶大黄在病虫害防治方面的研究主要集中在杀菌方面，而在防治害虫和线虫方面尚少有报道。我国资源丰富，从掌叶大黄的线虫防治功效出发，科学合理地进行植物源农药开发，具有广阔的市场前景。目前，国内外也尚未有关于掌叶大黄农药剂型加工的研究报道。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供两种蒽醌类化合物在防治根结线虫病方面的应用。

具体地，是针对上述现状，旨在提供一种能够在田间运用，对环境安全友好，且对植物根结线虫病具有较好防治效果的植物源绿色杀线剂。

本发明的目的是这样实现的，两种蒽醌类化合物在防治根结线虫病方面的应用：

①所述两种蒽醌类化合物源于掌叶大黄根茎提取物，分别为大黄素(1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌)和芦荟大黄素(1,8-二羟基-3-羟甲基蒽醌)，其化学结构式分别见图1和图2；

②所述两种蒽醌类化合物展现了它对南方根结线虫较强的毒杀活性，大黄素的使用浓度为1～10mg/mL，处理72h时对南方根结线虫的致死率高于50％；芦荟大黄素的使用浓度为2～20mg/mL，处理72h时对南方根结线虫的致死率高于50％；

③所述两种蒽醌类化合物大黄素和芦荟大黄素混合使用的浓度比例为2∶1～3∶1，使用浓度为1～10mg/mL，处理72h时对南方根结线虫的致死率高于60％；

④所述蒽醌类化合物是从传统的中草药中筛选的对南方根结线虫具有毒杀作用的植物源提取物，可用于开发源于中药草的杀线剂；

⑤所述掌叶大黄根茎提取物防治根结线虫的使用浓度为1～4mg/mL，灌液量为100～500mL，对番茄根结线虫病的盆栽防治效果高于60％；

⑥所述掌叶大黄根茎提取物可用于制备防治根结线虫病的水乳剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、可溶粒剂、水分散粒剂、悬浮剂、油悬浮剂和片剂。

本发明具有下列优点和积极效果：

①采用天然中草药植物掌叶大黄为材料，从其根茎提取物中分离得到了两种对根结线虫幼虫具有较好毒杀活性的蒽醌类化合物，该蒽醌类化合物源于自然，对环境安全友好，且来源相对广泛。

②本防治技术难以使害虫产生抗药性，也不存在药剂残留问题，符合有害生物绿色防控技术的基本要求。

③本发明用于防治植物根结线虫病，有利于保护农田生态环境和生物多样性，具有良好的生态效益。

附图说明

图1为掌叶大黄根茎分离杀线活性化合物大黄素化学结构图；

图2为掌叶大黄根茎分离杀线活性化合物芦荟大黄素化学结构图；

表1为掌叶大黄根茎乙醇提取物对南方根结线虫J

表2为掌叶大黄根茎乙醇提取物对南方根结线虫J

表3为掌叶大黄根茎提取物不同分离组分的杀线虫活性；

表4为两种蒽醌类化合物对南方根结线虫的毒力分析；

表5为大黄素和芦荟大黄素对南方根结线虫的联合毒力；

表6为掌叶大黄根茎提取物对番茄根结线虫病的盆栽防治效果。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明进行具体描述。

1、实施例1：掌叶大黄根茎乙醇提取物对南方根结线虫的生物活性

1)根结线虫的饲养

采用盆栽番茄进行繁殖饲养；在番茄苗移栽存活后，在距离番茄根部1～2cm处用移液器接入线虫悬浮液，定期进行水肥管理，40d左右将根系挖出，挑取卵囊；将卵囊放入玻璃培养皿内，加入少量清水，在22～24℃避光条件下放置孵化2～3d后，镜检线虫液，使线虫浓度约为200头/mL；试验选用活力旺盛的J

2)掌叶大黄根茎提取物的制备

称取掌叶大黄根茎干粉200g放入棕色广口瓶中，加入800mL无水乙醇于24～27℃室温下浸泡，每日早晚用玻璃棒搅拌一次；浸泡7d后将浸提液抽滤，滤液于40℃水浴下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得粘稠膏状提取物，放入4℃冰箱避光保存备用。

3)杀线活性测试方法

采用浸虫法测试提取物对南方根结线虫的毒杀效果；称取提取物0.2g，室温下加入9.8mL清水，定容至10mL，即预先稀释50倍；将3mL提取物稀释液和上述3mL线虫液充分混匀得到提取物100倍液，即配制成浓度为10mg/mL的线虫和提取物的混合液；用移液器将混合液加入到48孔细胞培养板内，每孔分别加入1.5mL；另设无菌水为对照；每个处理加入4孔，即重复4次；加盖后置于25℃无菌避光条件下静置，于24h、48h和72h后在光学显微镜40倍下观察，调查线虫死亡数，计算校正死亡率。

调查方法：每孔调查0.6mL(6次×0.1mL/次)，每次用移液器吸取0.1mL于载玻片上计数，每处理调查总虫数200～240头。

校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(100-对照死亡率)×100

线虫的死亡判定标准：在显微镜下观察线虫时，若线虫活动或呈“S”形，卷曲形可判断为活虫，线虫僵直不动或呈“J”型判断为失活死亡，难以判断时用挑针轻轻触碰虫体，如虫体无任何反应则判定为死亡。

植物浸提物用无菌水分别稀释成4.00、2.00、1.00、0.67、0.50mg/mL；25℃避光条件下处理24h、48h和72h后，按照上述方法调查线虫死亡数，并计算校正死亡率、毒力回归方程、半致死浓度LC

4)试验结果

表1掌叶大黄根茎乙醇提取物对南方根结线虫的毒杀活性(10mg/mL)

*对照死亡率均低于10％。

由表1可知，用掌叶大黄提取物以10mg/mL处理试虫24h、48h和72h后，试虫的校正死亡率分别为88.41％，91.30％和95.22％，表明掌叶大黄根茎乙醇提取物对南方根结线虫具有较高的毒杀活性。

表2掌叶大黄根茎乙醇提取物对南方根结线虫的毒力分析

由表2可知，用掌叶大黄提取物处理试虫24h、48h和72h后的LC

实施例2：掌叶大黄根茎提取蒽醌类化合物对南方根结线虫的毒杀活性

1)根结线虫的饲养

同实施例1。

2)掌叶大黄根茎提取蒽醌类化合物的分离制备

称取实施例1中的掌叶大黄乙醇提取浓缩物5g，采用硅胶柱层析法进行分离，用湿柱法进行装柱；洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯洗脱液＝4:1(V/V)，洗脱剂用量约为15倍保留体积，按50mL/瓶进行收集，洗脱流速约为3mL/min；采用薄层色谱法(TLC)对各组洗脱馏分进行初步鉴定，将TLC图谱相似的洗脱馏分进行合并收集；全部洗脱结束后，减压浓缩共得到3个组分：经薄层层析鉴定组分A为混合组分(进一步对其分离得到单一组分A1和A2)，B和C为单一组分；化学结构鉴定表明A1和A2分别为大黄酚和大黄素甲醚，B和C为大黄素(图1)和芦荟大黄素(图2)。

3)杀线活性测试方法

同实施例1。

4)试验结果

表3掌叶大黄根茎提取物不同分离组分的杀线虫活性(2mg/mL)

*每列中有字母相同者表示差异未达显著水平(P>0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0.05)；对照死亡率均低于10％。

由表3可知，各组分以2mg/mL处理根结线虫24h后，试虫的校正死亡率均低于30％，杀线活性较弱。处理48h后，大黄素和芦荟大黄素的校正死亡率均高于30％；处理72h后大黄素的校正死亡率为76.68％，芦荟大黄素为56.47％。掌叶大黄各成分中对南方根结线虫活性较强的为大黄素和芦荟大黄素，但活性低于掌叶大黄根茎粗提物。

表4两种蒽醌类化合物对南方根结线虫的毒力分析

由大黄素与芦荟大黄素两种活性成分对根结线虫的毒力测试结果(表4)可知，处理24h、48h和72h时，大黄素对根结线虫的室内毒力均优于芦荟大黄素，表现出更优的室内毒杀效果，其处理24h、48h和72h时的LC

表5大黄素和芦荟大黄素对南方根结线虫的联合毒力(72h)

从表5可以看出，药剂处理72h后，大黄素和芦荟大黄素5种不同配比对根结线虫的LC

实施例3：掌叶大黄根茎提取物对番茄根结线虫病的盆栽防治效果

按实施例1中的方法对掌叶大黄根茎进行提取，浓缩后得到根茎提取物。将根茎提取物用清水稀释，分别配制成0.1％，0.2％和0.4％的稀释液用于灌根处理。

番茄移栽时灌根处理：施药前将洁净的营养土与根结线虫染病土以2：1(w/w)充分混合均匀，装入直径为15cm，高为20cm的塑料花盆中，每盆装入病土混样2Kg；待健康的番茄幼苗长出第三片真叶后进行移栽到上述预先处理好的花盆中；移栽后每盆灌入上述稀释液100mL，设3个重复，每重复20盆。对照灌入100mL清水。放于塑料大棚内，统一水肥管理；60d后轻轻拔出番茄根部，根据根部根结情况调查发病轻重，统计对根结线虫病的盆栽防治效果。

按照Barker的方法对根结进行分级，分级标准如下：

0级：根系健康完整，未出现根结；1级：略微出现少量根结，且根结较小；2级：在侧根出现清晰可见的小根结，主根正常；3级：在侧根出现较大根结，主根正常；4级：侧根根结较多，主根正常；5级：主根开始出现零星根结；6级：部分主根出现明显根结；7级：绝大多数主根均出现根结；8级：所有的主根均出现根结；9级：所有根系均出现根结；10级：所有根系均出现严重根结，受侵染严重。

根据以上的分级标准计算病情指数和防治效果，计算公式分别为：

病情指数＝∑(各病级植株数×该级数值)/(调查总株数×最重病级数值)×100

防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％

表6掌叶大黄根茎提取物对番茄根结线虫病的盆栽防治效果

从表6可知，番茄定植60d后，经过3种提取物浓度处理的番茄根系根结数量均比对照组减轻，0.1％，0.2％和0.4％提取物处理后其病情指数分别为20.4，15.4和8.9，防治效果分别为62.2％，71.5％和83.5％，其中0.4％掌叶大黄提取物处理后盆栽防效高于80％，效果明显好于0.1％和0.2％掌叶大黄提取物处理。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。