原花青素在抗结核分枝杆菌感染中的潜在应用

摘要

本发明提供了一种针对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)中的富马酸水合酶(fumarate hydratase,FH)的化合物，该化合物名称为原花青素，对结核分枝杆菌中的富马酸水合酶具有显著的抑制活性，因此本发明提供的小分子化合物可用来制备针对结核分枝杆菌中富马酸水合酶的小分子抑制剂，有望成为治疗结核病的潜在药物。

说明书

技术领域

本发明涉及药学的技术领域，具体说是原花青素在治疗结核分枝杆菌感染中的潜在应用。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)侵入人体后，可引起肺结核的发生，分枝杆菌的分类众多，实验菌株主要包括H37Rv、H37Ra和BCG。病菌可通过结核分枝杆菌携带者说话，咳嗽等过程中被散播进入到周围环境，健康人群接触环境中的病菌即有可能感染结核病。2019年死于结核病的患者超过140万人(其中包括20多万艾滋病毒感染者)。在世界范围内，结核病是引起死亡的十大原因之一，其亦是单一感染源导致死亡的主要原因之一。目前通过注射疫苗和药物治疗两种方法，患病人数和死亡率成下降趋势。

抗结核病药物的研究取得初步进展，目前结核病的治疗是基于联合用药的原则，多种药物联用可以提高疗效并缩短疗程。抗结核病药物包括一线治疗药物：异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和链霉素等，对于早期肺结核患者，常采用四药联用的治疗方案。二线治疗药物：阿米卡星，氧氟沙星等。已有的抗结核药物虽取得一定的治疗效果，但也面临着一系列问题和挑战：目前抗结核药物治疗方案为四种药物联用连续进行六个月治疗，疗程长病人依从性低，且药物的副作用肝毒性是一个大问题；另一方面由于长期服用药物以及药物的滥用可能会导致耐药结核(RR-TB)、耐多药结核(MDR-TB)和广泛耐药结核(XDR-TB)的出现。部分人群还会被结核分枝杆菌和艾滋病病毒同时感染，需同时服用不同治疗药物，两类药物共同使用时相互反应，对人体的毒性增大，因此对于TB/HIV共感染病人的治疗难度加大。因此科学家仍然需要致力于治疗结核病的研究，其中比较热门的是针对结核分枝杆菌的特定靶点研究，进而找出治疗结核病的潜在药物。

富马酸水合酶(FH)是结核分枝杆菌三羧酸循环中的一个重要组成部分，它可催化富马酸可逆水合生成L-苹果酸，在Mtb中的转座子诱变研究表明，表达FH的基因fum是最佳生长所必需的。有研究显示，在小鼠感染结核的急性期和慢性期，FH缺乏都具有一定的杀菌作用。这种重要性与富马酸的显著积累有关，富马酸导致蛋白质和代谢物琥珀酸化，富马酸酶失活可能通过一种共价的不可逆形式的代谢毒性杀死Mtb。富马酸水合酶是抗结核分枝杆菌的一个重要的药物靶标，所以针对富马酸水合酶进行抑制剂筛选对结核分枝杆菌感染的相关的药物研发具有很大的意义。

原花青素，英文名称为Procyanidin，原花青素有很强的生物活性,如具有较强的抗氧化活性、可用于防治心血管疾病，同时也具有抵抗癌症、治疗高血压、降低血脂和血糖等作用，但迄今为止，原花青素并未应用于抗结核分枝杆菌感染的探索和研究。

发明内容

针对相关技术中的问题，本发明提供富马酸水合酶在抗结核分枝杆菌感染中的应用。

本发明还提供了针对结核分枝杆菌中富马酸水合酶的抑制剂。

本发明所涉及原花青素CAS号为4852-22-6，购自上海陶素生化科技有限公司。在进行酶活测定时，原花青素对富马酸水合酶抑制活性较好，科研人员可对原花青素进行深入的研究。

本发明提供一种用于预防或治疗结核分枝杆菌中的富马酸水合酶(FH)感染的药物，其活性成分为原花青素，该药物包含上述含有原花青素以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

本发明具有的优点和积极效果是：

本发明的针对结核分枝杆菌中的富马酸水合酶(FH)的抑制剂，这种抑制剂为原花青素。原花青素可显著抑制结核分枝杆菌中的富马酸水合酶活性。

附图说明

图1是原花青素对结核分枝杆菌中的富马酸水合酶的抑制活性示意图。

图2是原花青素对结核分枝杆菌中的富马酸水合酶的IC

图3是原花青素对结核分枝杆菌中的富马酸水合酶抑制剂类型判断的示意图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在此将详述本发明的具体的的实施方式。

1.富马酸水合酶(FH)的表达与纯化

根据文献(KasbekarM,Fischer G,Mott BT,et al.Selective small moleculeinhibitor of the Mycobacterium tuberculosis fumarate hydratase reveals anallosteric regulatory site.Proc Natl Acad Sci USA.2016；113(27):7503-7508.doi:10.1073/pnas.1600630113)

(1)将pET-28a-fum重组质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)的菌株，利用LB(加入50mg/L卡那霉素)培养基筛选得到具有重组质粒的菌株。

(2)挑取具有重组质粒的菌株，加入一定量LB液体培养基(50mg/L卡那霉素)，当其在600nm波长处的吸光值(即OD

(3)用3500rpm离心15min后，收集菌体，进行超声波破菌；菌体破碎后10000rpm离心90min，保留上清液。

(4)将上清液加入至Ni-NTA亲和层析柱中，用Ni-NTA亲和层析的方法获得较为均一的蛋白。

(5)含20mM咪唑的buffer除去非目的蛋白，含200mM咪唑的buffer收集MtFH，用阴离子交换层析和凝胶过滤层析的方法进行纯化来进一步获得具有稳定均一的目的蛋白。

2.MtFH的活性测定

使用大于98％纯度的L-苹果酸(购自麦克林公司)作为底物；紫外波长测定的仪器为Thermo Fisher的Multiskan SkyHigh全波长酶标仪,在紫外波长250nm处完成了FH活性的光度测定。

蛋白buffer组分为50mM Hepes,50mM NaCl,pH 7.5，用缓冲液配MtFH(终浓度200nM)，加入原花青素(终浓度为20μM),进行10min孵育，迅速加入底物L-苹果酸(终浓度为6mM)。600rpm震荡10s，检测吸光度值。

用酶标仪测定酶动力学曲线，曲线前200s的斜率作为酶促反应的初速度。计算出每个化合物抑制率。设定V

3.原花青素IC

蛋白MtFH的终浓度为200nM，再用二蒸水配置底物L-苹果酸，使其终浓度为6mM。我们首先根据初筛结果设定14个抑制剂浓度，原花青素的终浓度分别是32uM、30μM、28μM、24μM、20μM、16μM、12μM、8μM、4μM、2μM、1μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM。先将MtFH与原花青素在37℃孵育10min后，加入1μL底物，记录时间与吸光度值变化曲线。使用Graphpadprism 6.0软件分析MtFH反应初速率，得到原花青素浓度与抑制率的关系曲线，最终求出IC

4.化合物原花青素抑制剂类型的判断

实验操作为：用二蒸水配制抑制剂，原花青素的浓度为0μM、10μM、20μM。用酶活buffer配制不同浓度的MtFH，浓度为0nM、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM。将98μL的不同浓度的MtFH加到96孔酶标板中，加入1μL的不同浓度的抑制剂。最后加入1μL的6mM底物L-苹果酸。使用全波长酶标仪测吸光度的变化值。

本发明涉及药学的技术领域，具体说是原花青素在抗结核分枝杆菌感染中的应用，原花青素在抑制结核分枝杆菌中的MtFH时抑制率Ir>90％，且抑制剂类型为可逆性抑制剂，在制备抗结核分枝杆菌中富马酸水合酶的小分子抑制剂方面有很大应用潜力，科研人员可对原花青素在抗结核病领域进行深入研究。

以上所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常用的方法。

以上仅为本发明的具体实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。