一种高转化率的β-丙氨酸生物酶合成方法及其成套装置

摘要

本发明涉及一种高转化率的β‑丙氨酸生物酶合成法，该方法包括下述步骤，将丙烯酸和氨水溶液在混合器(一)中均匀混合后，将制得的混合液(一)导入混合器(二)中，加入丙烯酸氨氧化酶，均匀混合后，将制得的混合液(二)导入管道反应器中进行转化反应，制得含有β‑丙氨酸的转化液。本发明的制备方法实现了β‑丙氨酸生物酶法的连续化生产，显著降低了副反应，显著提高反应速率和丙烯酸的有效转化率。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高转化率的β-丙氨酸生物酶合成方法及其成套装置。

背景技术

β-丙氨酸为自然界中唯一存在的β型非蛋白氨基酸，并被广泛应用于医药、饲料、食品等领域。

CN 108383742 A公开了一种化学法生产β-丙氨酸的方法，该方法将氨水混合物和丙烯酸分别通向管道反应器中进行连续反应，再对反应产物进行脱氨、脱水、醇析、结晶处理，制得β-丙氨酸。该方法中丙烯酸的有效转化率能达到96％。但反应需在高温(100～150℃)、高压(1.0MPa)条件下进行，存在副反应多(丙烯酸自聚等)、能耗较大等缺陷。

CN1285730C公开了一种生物法合成β-丙氨酸的方法，该方法用可产生丙烯酸氨氧化酶的微生物分别在含丙烯酸的种子培养基和含丙烯酸的发酵培养基中培养出相应的氨基化酶，再将生物转化生成的氨基化酶加入含有1％～50％(g/ml)丙烯酸的氨水溶液，在酶的作用下合成β-丙氨酸，产品纯度可达98％，但其丙烯酸转化率仅约60％。

CN109385415A公开了一种天冬氨酸酶变体将丙烯酸转化为β-丙氨酸的方法，其中，丙烯酸的转化率为84％以上。

CN110923272A公开了一种能将丙烯酸生物转化为β-丙氨酸的天冬氨酸突变体，该突变体同时存在四个突变点，丙烯酸的转化率高达99.8％。但前述转化率并非丙烯酸转化为β-丙氨酸的有效转化率。

与化学合成法相比，β-丙氨酸的生物酶合成法的反应条件相对温和，更适合用于丙烯酸加氨合成β-丙氨酸的转化，但生物酶合成法存在转化率低等缺陷，急需研究探索更高转化率的生物酶合成法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高转化率的β-丙氨酸生物酶合成法，包括如下步骤：

(1)将丙烯酸和氨水溶液在混合器(一)中均匀混合后，将制得的混合液(一)导入混合器(二)中，加入丙烯酸氨氧化酶，均匀混合后，制得混合液(二)；

(2)将制得的混合液(二)导入管道反应器中进行转化反应，制得含有β-丙氨酸的转化液。

本发明的优选技术方案中，所述的丙烯酸氨氧化酶为其丙烯酸氨氧化酶溶液，优选丙烯酸氨氧化酶溶液选自含有可表达丙烯酸氨氧化酶的微生物菌种经过培养基发酵培养所得的发酵液或其浓缩液的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述浓缩选自真空浓缩、减压浓缩、薄膜浓缩、常压浓缩、超滤浓缩、离心浓缩的任一种或其组合。

本发明优选的技术方案，所述丙烯酸：氨水溶液：丙烯酸氨氧化酶溶液的重量体积比(w/v/v)为1：1.5～2.0：0.6～1.5，优选为1：1.6：0.7。

本发明优选的技术方案，所述丙烯酸氨氧化酶溶液的酶活力为50-2000U/mL，优选为500-1500U/ml，更优选为800-1200U/mL。

本发明优选的技术方案，所述微生物菌种为野生型菌种，优选为野生型大肠杆菌、野生型藤黄八叠球菌中的任一种。

本发明优选的技术方案，所述微生物菌种为基因工程菌种，优选为大肠杆菌的基因工程菌种、藤黄八叠球菌的基因工程菌种中的任一种。

本发明优选的技术方案，所述氨水溶液的浓度为15％-45％，优选为20％-40％，更优选为20％-30％。

本发明优选的技术方案，所述混合液(一)在混合器(一)内的停留5～60秒，优选为10～50秒，更优选为20～45秒。

本发明优选的技术方案，所述混合液(一)在混合器(一)内的混合温度为45～95℃，优选为50～70℃，更优选55～65℃。

本发明优选的技术方案，所述混合液(二)在混合器(二)中的停留5～40秒，优选为8～35秒，更优选为10-30秒。

本发明技术方案中，所述混合器(一)和混合器(二)为静态混合器、动态混合器的任一种或其组合，优选为静态混合器。

本发明优选的技术方案，所述混合液(二)在管道反应器中的反应温度为30～65℃，优选为35～60℃，更优选为40～55℃。

本发明优选的技术方案，所述混合液(二)在管道反应器中的反应压力为0～1.0MPa，优选为0～0.8MPa，更优选为0～0.5MPa。

本发明优选的技术方案，所述混合液(二)在管道反应器中的反应时间为5～180min，优选为30～150min，更优选为30～120min。

本发明优选的技术方案，所述管道反应器中还设置混合器，优选混合器为静态混合器，更优选为SK型静态混合器。

本发明优选的技术方案，将制得的含有β-丙氨酸的转化液进行纯化处理制得β-丙氨酸，优选纯化处理包括超滤、脱氨、结晶、分离步骤。

本发明优选的技术方案，将制得的β-丙氨酸进行重结晶纯化处理，优选重结晶包括溶解、脱色、结晶、分离、干燥步骤。

本发明的优选技术方案中，所述分离选自过滤、离心、膜处理的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，将收集的分离固体经洗涤处理后干燥，优选所述洗涤所用溶剂为水。

本发明的优选技术方案中，所述干燥选自真空干燥、减压干燥、常压干燥、喷雾干燥、沸腾干燥的任一种或其组合。

本发明优选的技术方案，将制得的β-丙氨酸进行结晶纯化处理的次数不少于1次，优选为2-4次。

本发明优选的技术方案，所述的超滤处理是将制得的β-丙氨酸转化液在密闭的预涂层转鼓过滤器中经过滤后再经超滤处理，优选为经超滤膜处理。

本发明优选的技术方案，将β-丙氨酸转化液经超滤处理中所收集的超滤浓液用于制备有机肥料。

本发明优选的技术方案，所述脱氨处理为闪蒸脱氨。

本发明优选的技术方案，将制得的超滤清液经脱氨处理中所收集的气相经冷凝回收后，回输到液氨和水的混合步骤循环利用。

本发明优选的技术方案，将分离处理中所收集的母液回输至超滤、脱色的任一步骤中循环利用。

本发明优选的技术方案，所述的脱色处理为活性炭、吸附剂处理的任一种。

本发明优选的技术方案，用于脱色处理的活性炭再经焚烧处理或将其用作制备有机肥原料的任一种加以综合利用。

本发明的另一目的是提供一种用于β-丙氨酸生物酶合成法的成套装置，所述的成套装置包括混合器(一)、混合器(二)、管道反应器。

本发明的技术方案中，所述混合器(一)和混合器(二)为静态混合器、动态混合器的任一种或其组合，其中优选静态混合器，更优选静态管道混合器，最优选静态管道SK型填料混合器。

本发明优选的技术方案，所述管道反应器由子反应器串联组成，优选串联的子反应器不少于二台，更优选串联的子反应器不少于三台。

本发明优选的技术方案，所述管道反应器中还设置有混合装置，优选为静态混合装置，更优选为SK型静态混合装置。

本发明优选的技术方案，所述的成套装置还包括超滤装置、脱氨装置、结晶装置、溶解装置、脱色装置、结晶装置、分离装置、干燥装置，优选为顺序串联。

本发明的另一目的是提供一种β-丙氨酸生物酶合成法生成废料的循环利用方法，包括下述步骤：

(1)将丙烯酸和氨水溶液在混合器(一)中均匀混合后，将制得的混合液(一)导入混合器(二)中，加入丙烯酸氨氧化酶，均匀混合后，制得混合液(二)；

(2)将制得的混合液(二)导入管道反应器中进行转化反应，制得含有β-丙氨酸的转化液；

(3)将制得的含有β-丙氨酸的转化液进行纯化处理制得β-丙氨酸，优选纯化处理包括超滤、脱氨、结晶、分离步骤。

本发明优选的技术方案，将制得的含有β-丙氨酸的转化液经超滤处理，所得的超滤清液进行脱氨处理中所收集的超滤浓液用于制备有机肥料。

本发明优选的技术方案，将制得的超滤清液经脱氨处理中所收集的气相经冷凝回收后，回输到液氨和水的混合步骤循环利用。

本发明的优选技术方案中，将结晶处理中所收集的结晶母液回输至超滤、溶解的任一步骤中加以循环利用。

本发明优选的技术方案，用于脱色处理的活性炭再经焚烧处理或将其用作制备有机肥原料的任一种加以综合利用。

本发明的另一目的是提供一种β-丙氨酸生物酶合成法的循环利用成套设备，所述的成套装置包括配料釜、混合器(一)、混合器(二)、管道反应器、超滤装置、脱氨装置、结晶装置、分离装置、溶解装置、脱色装置、结晶装置、分离装置、干燥装置，优选为顺序串联。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

除非另有说明，本发明按照如下方法检测：

1.酶活力的检测方法

本发明将在45℃条件下每分钟催化1mmol丙烯酸转化生成1mmolβ-丙氨酸所需的丙烯酸氨氧化酶量定义为其酶活力单位(1U)。

丙烯酸底物溶液的配制：称取288.24g丙烯酸，将其加入1L烧杯中，加入氨水和去离子水，调节pH 9.5±0.05，定容为1L。

单位体积丙烯酸氨氧化酶溶液的酶活力检测方法：在45℃水浴条件下，向2ml丙烯酸底物溶液中加入0.2ml丙烯酸氨氧化酶溶液，摇匀，反应30min，采用高压液相法检测酶活力并计算β-丙氨酸的生成量。

高压液相法检测条件：仪器型号：Agilent 1200Serie；色谱柱：Nucleosil 100C184.6×250mm 5μm；柱温：25℃；紫外检测波长：210nm；采集时间：10min；进样量：10μL；流速：1.00mL/min。流动相组成：A相：B相＝95:10，其中，A相的配制：称取1.44g KH

按照上述高压液相法检测条件，制作β-丙氨酸浓度标准曲线，并检测反应前后转化液中的β-丙氨酸浓度。

单位体积丙烯酸氨氧化酶溶液的酶活力计算：酶活力(U/ml)＝转化产物中β-丙氨酸浓度(mmol/L)*(丙烯酸底物溶液体积+丙烯酸氨氧化酶溶液体积)/(反应时间*丙烯酸氨氧化酶溶液体积)

2.丙烯酸有效转化率的计算方法

丙烯酸有效转化率＝转化液中β-丙氨酸摩尔浓度/混合液(二)中丙烯酸的初始摩尔浓度。

3.β-丙氨酸纯度的检测方法

称取所需量的β-丙氨酸标准品，将其配制成浓度分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、1.0g/L的标准溶液。按照本发明所述的“丙烯酸氨氧化酶溶液酶活力的检测方法”，绘制浓度和峰面积相关联的β-丙氨酸标准曲线。

将本发明中制得的β丙氨酸配制成1g/L的样品溶液。按照本发明所述的“丙烯酸氨氧化酶溶液酶活力的检测方法”，将所得液相检测峰面积代入β-丙氨酸标准曲线，计算得到样品溶液中β-丙氨酸的浓度。

β-丙氨酸纯度＝样品溶液β-丙氨酸浓度/(1g/L)×100％。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

1.本发明的制备方法实现了β-丙氨酸生物酶法的连续化生产，显著降低了副反应，显著提高了反应速率和丙烯酸的有效转化率。

2.本发明的成套装置显著提高了反应原料和反应装置的利用率，显著降低了副反应和能耗，显著提高了反应速率和丙烯酸的有效转化率。

3.本发明的制备方法具有反应温和、连续化生产、成本更优、绿色环保等优点。

附图说明

图1β-丙氨酸生物酶合成法工艺流程图

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员了解本发明，但并不因此限制本发明。

本参考例的含酶液是参照CN109385415A实施例1方法制备得到的：

实施例1、天冬氨酸酶突变体的制备及性能鉴定

一、克隆

使用本领域已知的方法构建含有编码所述天冬氨酸酶及其变体基因的质粒，并且将所得重组质粒转化至合适的宿主细胞中。

在本实施例中，专利CN201710659654.9公开了一种可催化丙烯酸加氨的酶及其表达菌株，对来源于枯草芽孢杆菌的天冬氨酸酶编码基因进行改造，获得多种突变体。本发明选取第373个突变体，对来源于枯草芽孢杆菌的天冬氨酸酶编码基因(见序列1)进行改造，编码该变体的突变基因组合如下：A59T/C60G/A267T/C560T/G561T/T772A/A774T/G963T/A971T/

A972T/A976T/A977G/T978C/A1166T/A1167C。在本实施例中，使用的载体质粒具体是pET21a。以含有天冬氨酸酶及其变体编码基因的基因片段为模板，以TATGGCTAGCATGACTGGTatgaataccgatgttcgtattg和GCTAGTTATTGCTCAGCGGttttcttccagcaattcccg为引物进行PCR扩增相应的核苷酸基因片段。之后，将所述PCR扩增得到的基因片段和pET21a按照1:1的摩尔比例混合，通过Gibson assembly的方法(参见：戢志呈等，应用Gibson Assembly方法构建植物表达载体，华南农业大学学报，2014,35(5)：112-116)构建含有天冬氨酸酶变体编码基因的质粒。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主细胞，将含有所述天冬氨酸酶编码基因的重组质粒导入到该宿主细胞中，获得可表达天冬氨酸酶变体(即本发明所述丙烯酸氨基化酶)的表达菌株。

序列1：

二、表达

使用自诱导培养基培养含有步骤一构建的重组质粒的宿主细胞。自诱导培养基的组成如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.27g/L，100％甘油20mL/L，葡萄糖0.5g/L，乳糖2g/L，氨苄青霉素钠50mg/L。将含有重组质粒的宿主细胞接种于自诱导培养基中，按照分批发酵的方式进行发酵。在30℃和200rpm条件下振荡培养20小时。

三、细胞收集

可采用以下三种方法：①离心法：将细胞培养液在4000g转速下，离心10分钟，收集细胞；②中空纤维膜过滤：将细胞培养液用0.22微米中空纤维膜，收集细胞；③陶瓷膜过滤：用50KDa陶瓷膜过滤，收集细胞。实验室条件下优选离心法收集细胞(本实施例采用该方法)。

将收集的细胞加水稀释后获得丙烯酸氨氧化酶溶液，并按照本发明所述的酶活力测定方法测定，至丙烯酸氨氧化酶溶液中的酶活为800U/ml。

β-丙氨酸的制备方法，包括下述步骤：

1、按照表1所述的丙烯酸：氨水：丙烯酸氨氧化酶溶液配比，取所需量的丙烯酸(1000kg)和21％氨水，将其泵入混合器(一)中混合45s后，将制得的混合液(一)进入泵入混合器(二)中，加入参考例1制得的丙烯酸氨氧化酶溶液，均匀混合30s后，再以191L/h的流速进入管道反应器中反应(反应温度见表1)120min后，制得β-丙氨酸转化液。

2、将制得β-丙氨酸转化液经陶瓷膜过滤，收集清液。所得清液经闪蒸脱氨处理后，所得的脱氨后料液经脱色处理，脱色条件为：活性炭0.5％(w/v)，55℃维持60min。所得脱色清液在90℃和-0.9MPa条件下蒸发浓缩至β-丙氨酸含量800g/L，将所得晶浆(一)冷却至40℃以下，离心得到离心湿晶体(一)。将离心湿晶体(一)加水重溶至β-丙氨酸含量为450g/L，进行脱色。脱色条件为：活性炭0.5％(w/v)，55℃维持60min。所得脱色清液在90℃和-0.9MPa条件下蒸发浓缩至β-丙氨酸含量800g/L，将所得晶浆(二)冷却至40℃以下离心，离心末期加入5％离心晶浆体积的水漂洗晶体，然后干燥，制得β-丙氨酸纯品。

按照本发明所述的方法检测实施例1-11中丙烯酸的有效转化率和β-丙氨酸的纯度。结果见表1。表1中，丙烯酸、氨水和丙烯酸的单位分别为kg、L和L。

表1

β-丙氨酸的制备方法，包括下述步骤：

(1)按照丙烯酸：氨水：丙烯酸氨氧化酶溶液的配比(w：v：v)为1:1.6:0.7，取所需量的丙烯酸(1000kg)和21％氨水，将其泵入混合器(一)中混合45秒后，将制得的混合液(一)泵入混合器(二)，加入参考例1制得的丙烯酸氨氧化酶溶液，均匀混合30s后，进入釜式反应器继续在45℃条件下反应，结束进料，反应120min，制得β-丙氨酸转化液。

(2)将制得β-丙氨酸转化液经陶瓷膜过滤，收集清液。所得清液经闪蒸脱氨处理后，所得的脱氨后料液经脱色处理，脱色条件为：活性炭0.5％(w/v)，55℃维持60min。所得脱色清液在90℃和-0.9MPa条件下蒸发浓缩至β-丙氨酸含量800g/L，将所得晶浆(一)冷却至40℃以下，离心得到离心湿晶体(一)。将离心湿晶体(一)加水重溶至β-丙氨酸含量为450g/L，进行脱色。脱色条件为：活性炭0.5％(w/v)，55℃维持60min。所得脱色清液在90℃和-0.9MPa条件下蒸发浓缩至β-丙氨酸含量800g/L，将所得晶浆(二)冷却至40℃以下离心，离心末期加入5％离心晶浆体积的水漂洗晶体，然后制得β-丙氨酸纯品。

β-丙氨酸的制备方法，包括下述步骤：

(1)按照丙烯酸：氨水：丙烯酸氨氧化酶溶液的配比(w：v：v)为1:1.6:0.7，取所需量的丙烯酸(1000kg)和21％氨水，将其泵入混合器(一)中，加入参考例1制得的丙烯酸氨氧化酶溶液，均匀混合30s后，再以191L/h的流速进入管道反应器中反应(反应温度45℃)120min后，制得β-丙氨酸转化液。

(2)将制得β-丙氨酸转化液经陶瓷膜过滤，收集清液。所得清液经闪蒸脱氨处理后，所得的脱氨后料液经脱色处理，脱色条件为：活性炭0.5％(w/v)，55℃维持60min。所得脱色清液在90℃和-0.9MPa条件下蒸发浓缩至β-丙氨酸含量800g/L，将所得晶浆(一)冷却至40℃以下，离心得到离心湿晶体(一)。将离心湿晶体(一)加水重溶至β-丙氨酸含量为450g/L，进行脱色。脱色条件为：活性炭0.5％(w/v)，55℃维持60min。所得脱色清液在90℃和-0.9MPa条件下蒸发浓缩至β-丙氨酸含量800g/L，将所得晶浆(二)冷却至40℃以下离心，离心末期加入5％离心晶浆体积的水漂洗晶体，然后制得β-丙氨酸。

按照本发明所述的方法测定对比例1-2的丙烯酸的有效转化率和β-丙氨酸的纯度。结果见表2。

表2

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。