一种解决新冠总抗及中和抗体协同检测试纸条及其制备方法

摘要

本发明公开了一种新冠总抗及中和抗体协同检测试纸条，所述试纸条包括：样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫以及底衬，所述样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫依次搭接粘贴在所述底衬上，所述硝酸纤维素膜上从样本垫端至吸水垫端依次设置有释放线、T2检测线、T1竞争线以及C质控线，所述释放线上包被示踪粒子‑标记物偶联物，所述T1竞争线包被ACE2蛋白，所述T2检测线包被SARS‑CoV‑2抗原。本发明通过总抗协同中和抗体检测，在不降低试纸条原有检测灵敏度的情况下，提高了检测的针对性和特异性，在保证试剂盒检测准确性的前提下，克服了待测物浓度过高时出现的HOOK问题。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种解决新冠总抗及中和抗体协同检测的方法。

背景技术

2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株。该病毒症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。由于新型冠状病毒已确认存在人传人现象，且潜伏期也具有传染性，再加之目前新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，因此，识别病毒感染患者，并及时进行隔离和治疗显得尤为迫切和重要。

目前，市面上的新型冠状病毒检测试剂主要包括两类：一类是核酸检测试剂，其中包括了基因测序法(DNA sequencing)、逆转录聚合链式反应(reverse transcription-PCR，RT-PCR)等检测手段；另一类是抗体检测试剂，主要包括了化学发光以及免疫层析等方法。核酸检测类试剂具有特异性强以及检测敏感度高等特点，但由于其包括样本处理、核酸提取以及PCR反应等步骤，平均检测时间需要2-3h，耗时较长，并且需要专业技术人员配套仪器设备以及试剂耗材使用，对使用环境要求较高。磁微粒化学发光检测时间一般需要30-60min，且同样对于使用环境要求较高，配套的检测仪器及试剂耗材成本高，难以在基层医院上大规模使用。免疫层析平均检测时间15min左右，并且检测试剂盒尺寸很小，便于携带，几乎可在任何医疗环境中使用可以作为快速筛查的手段，在大面积人员流动和聚集的时期可以发挥极大的筛查优势。

免疫层析法相关的产品主要有：新型冠状病毒总抗检测试纸条以及中和抗体检测试纸条，其中总抗免疫层析试纸条普遍应用双抗原夹心法，检测结果主要用作对新型冠状病毒核酸检测阴性疑似病例的补充检测指标或疑似病例诊断中与核酸检测协同使用；中和抗体检测试纸条主要采用竞争抑制法，随着新型冠状病毒的持续性流行以及疫苗研究的广泛开展，新冠中和抗体对于确定感染率、群体免疫以及预测具有重要意义。新冠总抗的检测对象包括了能够与新冠S蛋白或位于S1的受体结合域(RBD)集合的所有抗体，即包括了中和抗体以及其余的非中和抗体的抗体总和，具有很高的灵敏度，但针对性和特异性较低，因此无法对检测结果进行溯源，难以保障结果的准确度。同时，由于人体中新冠总抗的含量往往偏高，而为了确保样本在总抗含量较低时依然具有可靠检测灵敏度的情况下，就容易导致样本总抗含量高时出现HOOK问题，进而出现假阴性报值结果。

发明内容

本发明通过在总抗检测基础上协同中和抗体检测原理，在不降低总抗检测原有的灵敏度情况下，显著提升了检测的针对性及特异性，且避免了在样本待测物浓度过高时的HOOK效应，保证了检测准确性；同时，本发明通过示踪标记物结合的SARS-CoV-2抗原和/或RBD抗原以浓缩方式包被于NC膜释放线的方式，避免了标记复合物包被于玻璃纤维干燥和溶解释放的噪声因子波动，配合特殊的固定液组分，可以确保样本加入后标记物均匀的释放，且能够有效减少标记复合物在NC膜上的残留，显著提升了试剂的检测精密度。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：一种新冠总抗及中和抗体协同检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包括：样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫以及底衬，所述样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫依次搭接粘贴在所述底衬上，所述硝酸纤维素膜上从样本垫端至吸水垫端依次设置有释放线、T2检测线、T1 竞争线以及C质控线，所述释放线上包被示踪粒子-标记物偶联物，所述T2检测线包被SARS-CoV-2抗原或RBD抗原中的至少一种、所述T1竞争线包被ACE2 蛋白。

优选地，所述示踪粒子-标记物偶联物中，示踪粒子选自荧光微球、胶体金、胶乳微球、磁微粒或纳米碳中的至少一种，优选为荧光微球，标记物为SARS- CoV-2抗原或RBD抗原中的至少一种与IgY抗体的组合物。

优选地，所述释放线上示踪粒子-标记物偶联物的包被量为0.5-1.0ul/cm，优选为0.7-1.0ul/cm。

优选地，所述T1竞争线上ACE2蛋白的包被量为0.5-1.0ul/cm，优选为0.7- 1.0ul/cm；所述T2检测线上SARS-CoV-2抗原的包被量为0.5-1.0ul/cm，优选为 0.7-1.0ul/cm。

一种新冠总抗及中和抗体协同检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)硝酸纤维素膜的处理：

在硝酸纤维素膜上包被释放线、T2检测线、T1竞争线及C质控线后进行干燥处理：

a.释放线的包被：

将示踪粒子-标记物偶联物包被于硝酸纤维素膜上靠近样本垫端1-2mm处；

b.T2检测线的制备：

将RBD抗原溶液或SARS-CoV-2抗原溶液中的至少一种包被于距离释放线 4-6mm处，且远离样品垫端；

c.T1竞争线的制备：

将ACE2蛋白溶液包被于距离T2检测线1-3mm处，且远离样品垫端；

d.C质控线的位置：

将IgY抗体溶液包被于距离T1竞争线1-3mm处，且远离样品垫端；

(2)组装：

在底衬上依次粘贴样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫，切成3-5mm宽的试纸条。

优选地，在步骤(1)释放线的制备中，所述标记物为RBD抗原或SARS- CoV-2抗原中的至少一种与IgY抗体的组合物，所述示踪粒子选自荧光微球、胶体金、胶乳微球、磁微粒或纳米碳中的至少一种，优选为荧光微球；

所述示踪粒子-标记物偶联物的制备方法为：

a.300-500ug示踪粒子与60-100ug RBD抗原或SARS-CoV-2抗原中的至少一种搅拌混匀30-40min后，加入5％-10％BSA，搅拌10-30min后12000-14000rpm 离心20-30min，弃上清，沉淀以荧光标记复溶液溶解；

b.将300-500ug示踪粒子与60-100ug IgY抗体搅拌混匀30-40min后，加入 5％-10％BSA，搅拌10-30min后12000-14000rpm离心20-30min，弃上清，沉淀以荧光标记复溶液溶解；

c.将上述RBD抗原或SARS-CoV-2抗原标记微球与IgY抗体标记微球按1：(0.2-0.5)的比例混合，随后重悬于荧光标记复溶液中，即得示踪粒子-标记物偶联物。

优选地，在步骤(1)中，所述示踪粒子-标记物偶联物以0.5-1ul/cm的量包被于释放线处，优选为0.7-1.0ul/cm；所述ACE2蛋白溶液以0.5-1.0ul/cm的量包被于T1竞争线处，优选为0.7-1.0ul/cm；所述SARS-CoV-2抗原溶液或RBD 抗原溶液以0.5-1.0ul/cm的量包被于T2检测线处，优选为0.7-1.0ul/cm；所述 IgY抗体溶液以0.5-1.0ul/cm的量包被于C质控线处，优选为0.7-1.0ul/cm。。

优选地，所述示踪粒子-标记物偶联物的浓度为0.5-1.0mg/ml，优选为0.8-1.0mg/ml；所述ACE2蛋白溶液的浓度为0.5-1.0mg/ml，优选为0.8-1.0mg/ml；所述SARS-CoV-2抗原溶液或RBD抗原溶液的浓度为0.5-1.0mg/ml，优选为0.8- 1.0mg/ml.

优选地，所述荧光标记复溶液的组分包括：缓冲液10-50mmol/L、表面活性剂5-10g/L以及保护剂40-50g/L；所述缓冲液选自Tris、硼酸盐、磷酸盐或PBS 缓冲液中的至少一种；所述表面活性剂选自Twenn-20、Tween-80或Triton-X100 中的至少一种；所述保护剂选自蔗糖或海藻糖中的至少一种。

优选地，所述荧光标记复溶液还包括蛋白10-30g/L、PEG 1-10g/L以及防腐剂1-5g/L，所述蛋白选自酪蛋白或BSA中的至少一种；所述防腐剂选自叠氮钠或proclin-300中的至少一种。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明通过总抗协同中和抗体的检测，在不降低试纸条原有检测灵敏度的情况下，提高了检测的针对性和特异性，在保证试剂盒检测准确性的前提下，克服了待测物浓度过高时出现的HOOK问题。

(2)本发明所述的试纸条采用示踪粒子标记的SARS-CoV-2抗原或/和RBD 抗原以浓缩方式包被硝酸纤维素膜(NC膜)释放线处，避免了固定于玻璃纤维干燥和溶解释放的噪声因子波动，标记物固定于NC膜采用合适的荧光标记复溶液组分，减少了标记物在NC膜上的残留，同时确保样本加入后标记物均匀的释放，有效提高了试剂的精密度。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到试纸条的结构图(1-释放线，2-T2检测线； 3-T1竞争线，4-质控线C，5-样本垫，6-硝酸硝酸纤维素膜，7-吸水垫，8-底衬)

图2为本发明实施例5所述的校准品浓度与A组试纸条检测T2/T1信号值的线性关系图；

图3为本发明实施例5所述的校准品浓度与B组试纸条检测T2/T1信号值的线性关系图；

图4为本发明实施例5所述的校准品浓度与C组试纸条检测T/C信号值的线性关系图；

图5为本发明实施例5所述的校准品浓度与D组试纸条检测T/C信号值的线性关系图。

具体实施例

本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。

实施例1荧光试纸条1的制备

1.荧光标记复溶液的制备

按照下述配方进行配制，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。

2.示踪粒子-标记物偶联物的制备

(1)将60μg RBD抗原加入300μg荧光微球中，室温搅拌反应40min，加入5％BSA，封闭搅拌20min；

(2)14000rpm，离心20min，弃上清，沉淀以荧光标记复溶液恢复体积， 4℃保存；

(3)将60μg鸡IgY加入300μg荧光微球中，室温搅拌反应40min，加入5％BSA，封闭搅拌20min；

(4)14000rpm，离心20min，弃上清，沉淀以荧光标记复溶液恢复体积， 4℃保存；

(5)将上述RBD抗原标记微球和鸡IgY标记微球按照5：1比例混合，随后将混合物重悬于荧光标记复溶液中，即得示踪粒子-标记物偶联物。

3.试纸条的组装

(1)硝酸纤维素膜的处理

硝酸纤维素膜上包被释放线、T2检测线、T1竞争线及C质控线后进行干燥处理：

a.释放线的位置：

将示踪粒子-标记物偶联物以0.7ul/cm的量包被于硝酸纤维素膜靠近样本垫端2mm处；

b.T2检测线的位置：

将浓度为0.8mg/ml的RBD抗原溶液以0.7ul/cm的量包被于硝酸纤维素膜上距离释放线6mm处，且远离样品垫端；

c.T1竞争线的位置：

将浓度为0.8mg/ml的ACE2蛋白溶液以0.7ul/cm的量包被于硝酸纤维素膜上距离T2检测线3mm处，且远离样品垫端；

d.C质控线的位置：

将浓度为0.8mg/ml的IgY抗体溶液以0.7ul/cm的量包被于硝酸纤维素膜上距离T1竞争线3mm处，且远离样品垫端。

塑料底衬、样本垫子以及吸水垫为本领域通用材料，在塑料底衬上依次紧密搭接样品垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫，将贴好的中间物用斩切机切成预设宽度的试纸条，并组装仅试纸条卡盒，即可得成品试纸条(试纸条结构如附图1所示)。

实施例2荧光试纸条2的制备

本实施例中试纸条的制备方法与实施例1的区别在于：示踪粒子-标记物偶联物的制备过程中采用SARS-CoV-2抗原标记荧光微球，且T2检测线上包被的为SARS-CoV-2抗原溶液。

实施例3荧光试纸条3的制备

本实施例中试纸条的制备方法与实施例1的区别在于：缺少竞争线T1。

实施例4荧光试纸条4的制备

本实施例中试纸条的制备方法与实施例1的区别在于：缺少检测线T2。

实施例5试纸条性能验证

为验证本发明实施例1所述试纸条的检测性能，共设置4组试纸条进行验证：

A组：本发明实施例1制备得到的试纸条；

B组：本发明实施例2制备得到的试纸条；

C组：本发明实施例3制备得到的试纸条；

D组：本发明实施例4制备得到的试纸条。

(1)新冠中和抗体标准品的检测结果

使用四组试纸条分别对校准品进行准确度测试，设2个重复，通过免疫定量分析仪(重庆中元汇吉生物技术有限公司，Q8pro)读取信号，计算测定均值与靶值得相对偏差进行准确度验证。检测结果如下表所示：

表1标准品检测结果

由上述实验结果可知，四组试纸条测试值1与靶值1的相对偏差分别为 0.46％、-0.97％、-4.38％以及-1.51％，测试值2与靶值2的相对偏差分别为- 0.46％、-0.81％、-18.24％以及-3.95％。其中本发明实施例1制备得到的试纸条 (A组)检测准确度优于B组、C组以及D组试纸条。

(2)精密度测定

配置低值、中值以及高值校准品溶液，使用三组试纸条分别对各浓度校准品溶液重复测定10次，分别计算测定均值和标准差，计算变异系数进行重复性考察，检测结果如下表所示：

表2检测试纸条精密度

由上述实验结果可知，四组试纸条在低值样本检测时的变异系数分别为 0.95％、1.35％、2.99％以及5.96％，中值样本检测时的变异系数分别为1.08％、 1.53％、2.71％以及3.98％，高值样本检测时的变异系数分别为0.99％、1.75％、 8.02％以及4.07％。实验结果说明，本发明实施例1制备得到的试纸条(A组) 以及实施例2制备得到的试纸条(B组)在检测低值、中值以及高值样本时的精密度优于C组以及D组试纸条。

(3)临床评价

选取53例完成新冠疫苗注射的阳性样本，119例未接种新冠疫苗的阴性样本，使用上述三组试纸条分别针对阳性样本以及阴性样本进行检测，检测结果如下表所示：

表3检测试纸条临床性能

*注：阳性样本为完成疫苗接种样本；阴性样本为未接种疫苗样本；临床灵敏度＝(阳性检测数/阳性样本数)％；临床特异性＝(阴性检测数/阴性样本数)％；总符合率＝(正确检测数/ 总样本数)％。

由上述实验结果可知，四组试纸条的临床灵敏度分别为98.11％、96.22％、54.71％以及67.92％，临床特异性分别为100％、98.32％、96.64％以及92.44％，总符合率分别为99.42％、97.67％、83.72％以及84.88％。实验结果说明，本发明实施例1制备得到的试纸条(A组)以及实施例2制备得到的试纸条(B 组)的临床符合性显著优于C组以及D组试纸条。

(4)抗HOOK能力验证

配制超高浓度的校准品溶液(浓度为10000ng/ml)，利用超纯水按比例稀释配制各浓度梯度溶液，使用三组试纸条分别对校准品溶液进行测试，每个样本分别重复测定三次，通过免疫定量分析仪读取信号，检测结果如下表所示：

表4抗HOOK能力验证

将四组试纸条的检测结果与校准品浓度值进行比对分析(如附图2-5所示)，实验结果显示，C组试纸条的检测缺陷在于单纯依赖检测线的夹心原理，线性高端特别在2000ng/ml以上出现HOOK导致假阴性，D组试纸条的检测缺陷在于竞争法低端灵敏度特别在参考范围300ng/ml附近区分不明显，而A组试纸条以及B组试纸条同时结合了夹心法与竞争法的优势，在线性低端以及高端时均具备较好的检测准确度，在整个线性范围内均有较好的抗HOOK能力。

由上述实验结果可知，本发明所述试纸条通过总抗协同中和抗体的检测，在不降低试纸条原有检测灵敏度的情况下，提高了检测的针对性和特异性，在保证试剂盒检测准确性的前提下，有效克服了待测物浓度过高时出现的HOOK问题。

实施例6 NC膜上设置释放线对检测性能的影响

为验证试纸条NC膜上设置释放线取代常规结合垫的技术方案，能有效提升试纸条检测精密度，设置以下两组试纸条：

A组：本发明实施例1所述试纸条；

B组：所述试纸条制备方法与实施例1的区别在于：缺少释放线，且试纸条上设置有结合垫，示踪粒子-标记物偶联物包被于结合垫上。

配置低值、中值以及高值校准品溶液，使用三组试纸条分别对各浓度校准品溶液重复测定10次，分别计算测定均值和标准差，计算变异系数进行重复性考察，检测结果如下表所示：

表5精密度验证

由上述实验结果可知，两组试纸条在低值样本检测时的变异系数分别为 0.88％以及7.48％，中值样本检测时的变异系数分别为0.65％以及6.03％，高值样本检测时的变异系数分别为0.71％以及6.90％。实验结果说明，本发明实施例1制备得到的试纸条(A组)在检测低值、中值以及高值样本时的精密度优于B组试纸条。

实施例7释放线上标记微球浓度对检测性能的影响

为验证释放线上标记微球的浓度对试纸条检测线性的影响，设置以下5组实验：

A组：所述试纸条制备方法与实施例1的区别在于：释放线上标记微球的浓度为0.1mg/ml；

B组：所述试纸条制备方法与实施例1的区别在于：释放线上标记微球的浓度为0.5mg/ml；

C组：所述试纸条制备方法与实施例1的区别在于：释放线上标记微球的浓度为1mg/ml；

D组：所述试纸条制备方法与实施例1的区别在于：释放线上标记微球的浓度为1.5mg/ml；

E组：所述试纸条制备方法与实施例1的区别在于：释放线上标记微球的浓度为5mg/ml；

配制中值校准品溶液，使用五组试纸条分别对中值校准品溶液重复测定10 次，分别计算测定均值和标准差，计算变异系数进行重复性考察，检测结果如下表所示：

表6精密度验证

实验结果表明，在释放线上标记微球的浓度范围在0.5-1.0mg/ml时，试纸条的检测精密度较好，CV值均小于2％，在浓度为1.0mg/ml时，精密度最好，可达0.65％。

由上述实验结果可知，本发明所述的试纸条采用示踪粒子标记的SARS- CoV-2抗原或RBD抗原以浓缩方式包被硝酸纤维素膜(NC膜)释放线替代常规的示踪粒子标记物包被于结合垫上的技术方案，一方面避免了其固定于玻璃纤维素膜上干燥和溶解释放的噪声因子波动。另一方面采用特殊组分的NC膜固定液组分帮助示踪粒子标记物包被于释放线上，减少了层析过程中标记物在 NC膜上的残留，同时确保样本加入后标记物均匀的释放，进而有效提高了试剂的检测精密度。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变形。