诱导细胞融合的痘苗病毒及其应用

摘要

本发明的目的在于提供一种诱导受感染细胞的细胞融合的痘苗病毒及其制备方法。本发明是一种突变的痘苗病毒，其能够引起受感染细胞的特异性细胞融合，其中，K2L基因或HA基因、或者K2L基因和HA基因的功能发生了缺陷，所述痘苗病毒引起受感染细胞的细胞融合，诱导细胞死亡。

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导受感染细胞的细胞融合的痘苗病毒。

背景技术

目前，世界上都在积极开展活病毒治疗癌症的临床前研究和临床试验。这种癌症病毒疗法是一种利用病毒的原始特性治疗癌症的方法，即在受感染的细胞和组织内增殖传播的同时使其死亡。与常规放疗和化疗相比，它通过多种机制发挥抗癌作用，首先是利用病毒增殖的溶瘤病毒，其次是与其伴随的抗肿瘤免疫的诱导。

以前有一种痘苗病毒的疫苗株，其在日本构建并作为天花疫苗用于人类并已被证明是高度安全的(参见非专利文献1)。然而，由于它在正常组织中仍保持较弱的增殖性，因此必须改良为仅在癌细胞中生长，以使其成为更安全的癌症病毒疗法。因此，在此疫苗株的基础上，我们将通过基因重组技术对其进行改进，并以在广泛的癌症中MAPK/ERK通路的异常调控为指标，成功开发出癌细胞特异性增殖并破坏癌症的基因重组痘苗病毒(参见专利文献1和2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公布第WO2011/125469号

专利文献2：国际公布第WO2015/076422号

非专利文献

非专利文献1：蛋白质核酸酶，Vol.48No.12(2003),p.1693-1700

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供一种诱导受感染细胞的细胞融合的痘苗病毒及其制备方法。

解决问题的技术方案

本发明人在研究痘苗病毒的抗肿瘤效果时，发现如果使痘苗病毒的K2L基因或HA基因等基因发生缺陷，则诱导受感染细胞的细胞融合，其结果是引起细胞死亡。即，通过使K2L基因或HA基因发生缺陷的痘苗病毒感染癌细胞，显示出抗癌效果。进一步，发现了通过使溶瘤性的痘苗病毒的K2L基因或HA基因发生缺陷，发挥协同抗癌效果，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述：

[1]一种突变的痘苗病毒，其能够引起受感染细胞的细胞融合。

[2]根据[1]的痘苗病毒，其中，K2L基因或HA基因、或者K2L基因和HA基因的功能发生了缺陷，所述痘苗病毒引起受感染细胞的细胞融合，诱导细胞死亡。

[3]根据[1]或[2]的痘苗病毒，其是溶瘤性痘苗病毒。

[4]根据[3]的痘苗病毒，其不在正常细胞内增殖，但在癌细胞内特异性增殖，并具有特异性破坏癌细胞的溶瘤性。

[5]根据[1]～[4]中任一项的痘苗病毒，其中，痘苗病毒是LC16株、LC16mO株或经修饰以表达B5R基因的LC16m8株。

[6]一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含[1]～[5]中任一项的痘苗病毒。

[7]一种痘苗病毒载体，其在[1]～[5]中任一项的痘苗病毒中导入有外源DNA。

[8]根据[7]的痘苗病毒载体，其中，外源DNA是标记DNA、具有细胞毒性作用或免疫激活作用的治疗用基因，或者是编码癌症、病毒、细菌或原虫的抗原的DNA。

[9]一种药物组合物，其用于治疗癌症或用作针对癌症、病毒、细菌或原虫的疫苗，所述药物组合物含有[7]或[8]的痘苗病毒载体。

[10]一种痘苗病毒的制备方法，所述痘苗病毒引起受感染细胞的细胞融合，诱导细胞死亡，所述制备方法包括使痘苗病毒的K2L基因或HA基因、或者K2L基因和HA基因的功能发生缺陷。

[11]根据[10]的制备方法，所述痘苗病毒是溶瘤性痘苗病毒。

[12]根据[10]或[11]的制备方法，其中，所述制备方法进一步包括使痘苗病毒生长因子(VGF)基因或O1L基因、或者痘苗病毒生长因子(VGF)基因和O1L基因的功能发生缺陷。

[13]根据[10]～[12]中任一项的制备方法，其中，痘苗病毒是LC16株、LC16mO株或经修饰以表达B5R基因的LC16m8株。

[14]一种用于治疗癌症的组合药物套装，所述组合药物套装含有与免疫检查点抑制剂组合的[1]～[5]中任一项的痘苗病毒。

[15]根据[14]的组合药物套装，其中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。

[16]根据[1]～[5]中任一项的痘苗病毒，其用于与免疫检查点抑制剂一起用于治疗癌症。

[17]根据[16]的痘苗病毒，其中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。

本说明书包括作为本申请优先权基础的日本专利申请号2019-91609号的公开内容。

发明效果

如果使痘苗病毒的K2L基因或HA基因等基因发生缺陷，则通过痘苗病毒引起感染细胞的细胞融合来提高抗癌效果。首先，通过增加病毒的增殖、传播能力来提高溶瘤能力，此外凋亡、坏死活跃发生。接着，通过融合，更有效地诱导ICD并且增强CD8 T细胞向给予侧、未给予侧的浸润。最后，通过改善给予侧、未给予侧的肿瘤内免疫环境，癌免疫变得更容易发挥作用。即，诱导细胞融合的溶瘤病毒与不诱导细胞融合的溶瘤病毒相比，通过更有效地使免疫难以发挥作用的冷肿瘤转变为易受免疫攻击的热肿瘤，从而发挥出更高的抗癌效果。

附图说明

图1是表示诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的结构图，图1A～C表示VGF-LucGFP/O1L-DsRed和源自其的诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的结构，图1D和E表示VGF-Luc/O1L-LacZ和源自其的诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的结构。

图2是表示诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的感染细胞图像的图。

图3-1是表示诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的感染细胞图像的图。

图3-2是表示诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的细胞毒性的图。

图3-3是表示诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的产生量的图。

图4-1表示10种肿瘤细胞中的诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的感染细胞图像的图。

图4-2表示10种肿瘤细胞中的诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒感染后的细胞存活率的图。

图5-1是表示因诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒导致的细胞死亡的图。图5-1A表示在A549中发生的凋亡，图5-1B表示坏死。

图5-2是表示因诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒导致的细胞死亡的图。图5-2A表示在CT26中发生的凋亡，图5-2B表示坏死。

图6是表示因诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒导致的免疫原性细胞死亡(ICD)的图。图6A表示A549的ICD，图6B表示CT26的ICD。

图7表示同种移植模型小鼠的实验品系的图。图7A表示病毒直接给予到单侧的肿瘤，图7B表示给予和检测日程。

图8-1表示同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的增殖的分布的图。

图8-2表示同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的增殖的定量的图。图8-2A表示给予侧中的痘苗病毒的增殖，图8-2B表示未给予侧中的痘苗病毒的增殖。

图9表示同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒治疗后的肿瘤体积的图。图9A表示给予侧的肿瘤体积，图9B表示未给予侧的肿瘤体积。

图10-1表示同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒治疗后的免疫学分析的结果图(其1)。

图10-2表示同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒治疗后的免疫学分析的结果图(其2)。

图11表示抑制CD8作用的同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒治疗后的肿瘤体积的图。图11A表示给予同种型对照(Isotype Control)的对照结果，图11B表示给予抗CD8抗体的结果。图11A和图11B左侧的曲线图表示给予侧的结果，右侧曲线图表示未给予侧的结果。

图12表示进展期的同种移植模型小鼠的实验品系的图。图12A表示病毒直接给予到单侧的肿瘤，图12B表示给予和检测日程。

图13-1表示进展期的同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的增殖的分布的图。

图13-2表示进展期的同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒的增殖的定量的图。

图14表示进展期的同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒治疗后的肿瘤体积的图。

图15-1是表示同时具有细胞融合能力和肿瘤靶向能力的痘苗病毒的结构图。

图15-2是表示同时具有细胞融合能力和肿瘤靶向能力的痘苗病毒感染后的细胞存活率的图(其1)。

图15-3是表示同时具有细胞融合能力和肿瘤靶向能力的痘苗病毒感染后的细胞存活率的图(其2)。

图15-4是表示同时具有细胞融合能力和肿瘤靶向能力的痘苗病毒感染后的免疫原性细胞死亡的图(其1)。

图15-5是表示同时具有细胞融合能力和肿瘤靶向能力的痘苗病毒感染后的免疫原性细胞死亡的图(其2)。

图16是表示利用诱导细胞融合的溶瘤病毒的提高抗癌效果的机理汇总图。

图17表示联合使用抗PD-1抗体的同种移植模型小鼠实验系的图。图17A表示病毒直接给予到单侧的肿瘤，图17B表示给予和检测日程。

图18表示联合使用抗PD-1抗体的同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒治疗后的肿瘤体积的图。图18A表示未使用抗PD-1抗体时的结果,图18B表示联合使用抗PD-1抗体时的结果。图18A和图18B左侧的曲线图表示给予侧的结果，右侧曲线图表示未给予侧的结果。

图19表示联合使用抗PD-1抗体的同种移植模型小鼠中诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒治疗后的存活率图。

图20是表示利用诱导细胞融合的基因重组痘苗病毒和抗PD-1抗体对肿瘤得到缓解的小鼠进行再移植肿瘤后的肿瘤体积的图。

具体实施方式

下面，详细地说明本发明。

本发明的痘苗病毒是突变为具有细胞融合能力的痘苗病毒。这里，细胞融合能力是指痘苗病毒在感染了细胞时，能够引起受感染细胞之间的细胞融合。以具有细胞融合能力地进行突变的痘苗病毒是抑制痘苗病毒本来所具有的细胞融合能力的基因的功能发生缺陷、或者插入表达促进细胞融合的基因的痘苗病毒。

作为参与到细胞融合中并抑制细胞融合能力的痘苗病毒本来所具有的基因，可举出K2L基因和HA(A56R)基因，本发明的痘苗病毒是K2L基因或HA基因、或者K2L基因和HA基因的功能发生了缺陷，因此以具有细胞融合能力地表型发生改变。如Wagenaar et al.,Journal of Virology,Vol.82,No.11,June 2008,p.5153-5160的第5159页图8所示，痘苗病毒在受感染细胞中，HA(A56R)蛋白与K2L蛋白的复合物经由HA的跨膜区固定在细胞膜上。由多种病毒蛋白(A21L，A28L，G3L，H2R，J5L，L5R)构成的入侵融合复合物(EFC)与病毒蛋白G9R和A16L一起协同固定在成熟病毒的膜上。认为该G9R和A16L通过作用于细胞膜上的HA和K2L，抑制了病毒与受感染细胞间的融合。由此，因HA和K2L的功能障碍，能够无抑制功能地诱导细胞融合。因此，作为参与到细胞融合中和抑制细胞融合能力的痘苗病毒本来所具有的基因，除了编码病毒蛋白的K2L或HA之外，还可举出A16L、A21L、A25L、A26L、A28L、G3L、G9R、H2R、J5L、L5R基因等。例如，对于G9R，通过使第44位的H突变为Y，即使抑制融合的分子为正常，也会诱导融合。因此，通过使这些一个或多个功能发生缺陷、或者导入突变，能够诱导或增强细胞融合。作为组合的例子，可举出使K2L缺陷且使G9R第44位的H突变为Y等。

具有融合能力的病毒蛋白已知有多种，可以通过将该基因插入含不同溶瘤病毒的病毒中来表达，以具有细胞融合能力地进行突变。作为这样的基因，可举出编码源自麻疹病毒(measles virus)的H(血凝素，hemagglutinin)蛋白和F(融合，fusion)蛋白的基因。进一步如美国专利第7,635,752号说明书所示，也可以通过H基因的改良引起与特定的细胞发生融合，并通过使其表达于腺病毒或水胞性口炎病毒(vesicular stomatitis virus(VSV))中，也证明了可以应用于治疗癌症(Nakamura et al.,NATURE BIOTECHNOLOGY,VOLUME 22,NUMBER 3,MARCH 2004,pp.331-336)。此外，也可举出编码源自长臂猿白血病病毒(Gibbonape leukemia virus(GaLV))的GaLV包膜的基因，并通过使其表达于疱疹病毒、腺病毒、慢病毒中，也证明了可以应用于治疗癌症(Krabee et al.,Cancers 2018,10,216；doi:10.3390/cancers10070216)。

其他的报告有表达源自呼肠孤病毒(Reovirus)的FAST蛋白的VSV、表达源自HIV的HIV包膜的腺病毒、表达源自新城疫病病毒(NDV)的F蛋白的VSV、表达源自SV5的F蛋白的腺病毒(Krabee et al.,Cancers 2018,10,216；doi:10.3390/cancers10070216)。

即，作为促进细胞融合的基因，也可举出编码源自呼肠孤病毒的FAST蛋白的基因、编码源自HIV的HIV包膜的基因、编码源自NDV的F蛋白的基因、编码源自SV5的F蛋白的基因等。

K2L基因作为丝氨酸蛋白酶抑制剂而被已知，但其功能尚不清楚。HA基因是在感染细胞表面被诱导的糖蛋白，作为红细胞凝集素而被已知。野生型的K2L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，野生型的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。

痘苗病毒的K2L基因或HA基因的功能缺陷是指K2L基因或HA基因不表达、或者其表达蛋白即使表达也不能保留K2L蛋白或HA蛋白的正常功能。为了使痘苗病毒的K2L基因或HA基因的功能发生缺陷，只要使K2L基因或HA基因的全部或一部分缺失即可。此外，可以通过替换、缺失或增添碱基使基因发生突变，使正常的K2L蛋白或HA蛋白不能表达。此外，也可以在K2L基因或HA基因中插入外源基因。予以说明，虽然是由K2L与HA的缺陷引起细胞融合，但本发明所引起的细胞融合对于抗癌效果很重要，并且也可以是除此以外的病毒基因的缺陷。

基因的功能缺陷例如可以通过公知的基因组编辑、同源重组、RNA干扰法、反义法、基因插入法、人工突然突变法、利用病毒载体的PTGS法等来进行。本发明中，在基因通过缺失和突变不能表达正常的基因产物时，称其为基因发生缺陷。

同源重组是指在细胞内两个DNA分子通过相同核苷酸序列相互发生重组的现象，是经常用于具有如痘苗病毒这样的巨大基因组DNA的病毒的重组方法。首先，通过以作为靶标的痘苗病毒的K2L基因或HA基因位点的序列为中心切割的形式，构建与其他DNA连接而成的质粒(称为转移载体)，如果将其导入感染了痘苗病毒的细胞中，则在病毒复制的过程中裸露的病毒DNA与转移载体上的相同序列部分之间发生替换，将夹在其中的DNA整合到病毒基因组的靶基因中，使该基因发生功能缺陷。作为这时使用的细胞，可使用BSC-1细胞、HTK-143细胞、Hep2细胞、MDCK细胞、Vero细胞、HeLa细胞、CV1细胞、COS细胞、RK13细胞、BHK-21细胞、原代兔肾细胞等能够感染痘苗病毒的细胞。此外，载体向细胞的导入可以通过磷酸钙法、阳离子核糖体法、电穿孔法等公知的方法来进行。

基因组编辑是利用位点特异性核酸酶修饰靶基因的方法。作为基因组编辑的方法，根据所使用的核酸酶，可举出ZFN(锌指核酸酶，zinc finger nuclease)法(Urnov,Fyodor D.et al.,Natur,Vol 435,2June 2005,pp.642-651)、TALEN(TALE核酸酶，Talenuclease)法(Mahfouz,Magdy M et al.,PNAS February 8,2011,108(6),pp.2623-2628)、CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats)/Cas9(CRISPR相关蛋白，Crispr Associated protein 9)(Jinek,Martin,et al.,Science,Vol 337,17August 2012,pp.816-821)、CRISPR/Cas3等利用CRISPR/Cas系统的方法等。这些方法中也包括使用切口酶修饰型Cas的方法等修饰核酸酶的方法。其中，优选利用CRISPR/Cas9系统的方法。在CRISPR/Cas9系统中，通过向导RNA(crRNA、tracrRNA)和作为核酸酶的Cas9切割任意的序列，所述向导RNA包含与通过切割使想要功能发生缺陷的基因的靶序列互补的序列。在基因组切割后，通过NHEJ(非同源性末端接合)进行修复，诱导碱基的缺陷等，从而能够敲除基因。或者，在基因组切割后，通过HDR(同源重组修复)，能够通过同源重组对靶基因诱导突变。在通过基因组编辑破坏GBSS基因和/或SBE基因时，选择基因中的靶序列，设计包含与该序列互补的序列的向导RNA的序列即可。向导RNA的碱基长度优选为20个以上。在利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑时，只要共表达Cas9蛋白和向导RNA即可，例如导入使两者共表达的载体即可。利用CRISPR/Cas9的基因组编辑可以使用市售的CRISPR/Cas9工具来进行。

用于制备本发明的痘苗病毒的痘苗病毒的毒株没有限定，但可举出李斯特(Lister)株、由李斯特株构建的LC16株、LC16mO株、LC16m8株(桥爪壮，临床与病毒vol.3,No.3,269,1975等)、纽约市卫生局(New York City Board of Health)(NYBH))株、Wyeth株、哥本哈根株、西储(Western Reserve)(WR)株、改良的安卡拉痘苗(Modified VacciniaAnkara)(MVA)株、EM63株、池田株、大连株、天坛(Tian Tan)株等。LC16mO株是由Lister株经LC16株制作的株，LC16m8株是进一步由LC16mO株制作的在编码病毒膜蛋白基因即B5R基因中发现移码突变，通过使该蛋白表达、不再发挥作用从而是减毒化的株(蛋白质核酸酶，Vol.48No.12(2003),p.1693-1700)。

从确立给予人时的安全性这一点来看，本发明中使用的痘苗病毒优选减毒化且不具有病原性。作为这样的减毒化的株，可举出部分或完全缺失B5R基因的株。B5R基因存在于编码痘苗病毒的包膜的蛋白上，B5R基因产物参与到病毒的感染与增殖中。B5R基因产物存在于感染细胞的表面和病毒的包膜上，在病毒感染和传播到相邻的细胞或者宿主体内的其他部位时，起到提高感染效率的作用，也参与到病毒的空斑尺寸和寄主范围中。如果使B5R基因缺失，则在感染动物细胞时的空斑尺寸减小，痘疱尺寸也减小。此外，皮肤增殖能力降低，皮肤病原性下降。B5R基因部分或完全缺失的痘苗病毒其B5R基因的基因产物不具有其正常功能，皮肤增殖性也减小，在给予人时不发生副作用。作为B5R基因缺失的减毒化株，例如可举出由上述的LC16m8株完全缺失B5R基因而构建的m8Δ株(也称为LC16m8Δ株)。此外，也可以使用由LC16mO株完全缺失B5R基因而构建的mOΔ株(也称为LCmOΔ株)。这些部分或完全缺失B5R基因的减毒化的痘苗病毒株如国际公布第WO2005/054451号中记载，可以根据该记载而获得。痘苗病毒是否部分或完全缺失B5R基因，使B5R蛋白的功能缺失，例如，可以以下述为指标进行判断：感染RK13细胞时所形成的空斑尺寸、痘疱尺寸、Vero细胞中的病毒增殖性、兔中的皮肤病原性等。此外，也可以调查痘苗病毒的基因序列。

具有B5R基因的痘苗病毒在癌细胞中表达B5R基因，通过B5R蛋白的作用，导致癌细胞的杀伤。因此，本发明中使用的痘苗病毒期望表达完全的B5R基因。在使用如上所述不具有B5R基因、被减毒化且安全性确立的痘苗病毒时，在缺失该B5R基因的痘苗病毒中重新导入完全的B5R基因。在使用部分或完全缺失B5R基因的痘苗病毒时，也可以在该痘苗病毒基因组中插入B5R基因来使用即可。B5R基因插入痘苗病毒可以通过任何方法进行，例如可以通过公知的同源重组法来进行。此外，在这种情况下插入B5R基因的位置可以是原本存在B5R基因的B4R基因与B6R基因之间，也可以是痘苗病毒的基因组的任意位点。进一步，也可以预先构建B5R基因作为DNA构建体，并将其导入痘苗病毒中。

通过痘苗病毒的K2L基因或HA基因发生缺陷，K2L或HA的功能不起作用，由此病毒的增殖、传播能力提高，从而溶瘤能力提高，此外诱导受感染癌细胞的细胞死亡。这里，细胞死亡包括凋亡和坏死。此外，引起受感染癌细胞的细胞融合。通过引起细胞融合，免疫原性细胞死亡(ICD:Immunogenic cell death)诱导能力提高。其结果是CD8 T细胞浸润癌细胞活跃发生并攻击癌细胞。进一步，全身抗癌免疫活性得到提高。此外，还发现Treg、TAM、MDSC等免疫抑制细胞减少。

其结果是痘苗病毒的K2L基因或HA基因发生缺陷，K2L或HA的功能不起作用，从而痘苗病毒的抗癌效果提高。

如上所述，痘苗病毒在受感染细胞中，通过发生细胞融合，抗癌效果提高，其抗癌效果和ICD诱导能力无论有无肿瘤特异性都得到提高。然而，进一步在痘苗病毒具有肿瘤特异性时，抗癌效果协同地得到提高。因此，本发明中使用的痘苗病毒优选为具有肿瘤细胞特异性细胞溶解性，能够感染癌细胞而使癌细胞死亡的溶瘤病毒(oncolytic virus)。作为该方法，可以加入如下基因修饰：使特定蛋白质的功能发生缺陷，抑制特定基因或蛋白质的表达。

作为这样的基因，可举出红细胞凝集素(HA)基因；胸苷激酶(TK)基因；F片段；F3基因；痘苗病毒生长因子(VGF)基因(美国专利申请公开第2003/0031681号说明书)；O1L；出血区或A型包涵体区(美国专利第6,596,279号说明书)；Hind III F、F13L或Hind III M区(美国专利第6,548,068号说明书)；A33R、A34R或A36R基因(Katz et al.,J.Virology 77:12266-12275(2003))；SalF7L基因(Moore et al.,EMBO J.1992 11:1973-1980)；N1L基因(Kotwal et al.,Virology 1989 171:579-58)；M1基因(Child et al.,Virology,1990174:625-629)；HR、HindIII-MK、HindIII-MKF、HindIII-CNM、RR或BamF区(Lee et al.,JVirol.1992 66:2617-2630)；C21L基因(Isaacs et al.,Proc Natl Acad Sci USA.199289:628-632)等。这些基因之中，优选VGF基因、O1L基因、TK基因、HA基因、F片段。

另外，也可以组合多个基因修饰。作为多个基因修饰，可举出以下的修饰。

·TK和HA以及F14.5L的功能缺陷(Cancer Research,2007,Vol.67,p.10038-10046)·TK和B18R的功能缺陷(PLoS Medicine,2007,Vol.4,p.e353)

·TK和核糖核苷酸还原酶的功能缺陷(PLoS Pathogens,2010,Vol.6,p.e1000984)

·SPI-1和SPI-2的功能缺陷(Cancer Research,2005,Vol.65,p.9991-9998)

·SPI-1、SPI-2和TK的功能缺陷(Gene Therapy,2007,Vol.14,p.638-647)

·E3L和K3L区域中突变的导入(国际公布第2005/007824号)

将这些基因的功能发生了缺陷、具有溶瘤性的痘苗病毒称为溶瘤性痘苗病毒。

可以使多个这些基因发生缺陷。例如，也可以是VGF基因和O1L基因这两个基因发生缺陷。VGF基因和O1L基因这两个基因的功能发生缺陷的痘苗病毒如国际公布第WO2015/076422号中记载。

例如，如果TK基因的功能发生缺陷，则正常细胞中的痘苗病毒的增殖能力降低。另一方面，由于癌细胞中富含弥补该基因功能的酶，因此癌细胞中增殖能力不会降低。正常细胞中增殖能力降低意味着对正常细胞的病原性降低，即，应用于生物体时的安全性提高。此外，VGF基因和O1L基因这两个基因的功能发生缺陷的痘苗病毒在感染正常细胞时，由于正常细胞中ERK未被活化，因此细胞增殖没有被促进，其结果是痘苗病毒增殖显著下降。另一方面，癌细胞中，由于Ras/Raf/MEK/ERK代谢通路异常地活化，因此其弥补了因痘苗病毒的VGF和O1L，导致ERK的活化功能，所以痘苗病毒能够增殖。其结果是痘苗病毒在癌细胞中特异性增殖，破坏癌细胞并造成杀伤。

通过使用具有溶瘤性的痘苗病毒，与利用K2L基因或HA基因的缺陷的细胞融合能力的上升相互作用协同地使癌细胞导致细胞死亡的能力提高。

这些基因的缺陷可以通过上述的基因组编辑、同源重组、RNA干扰法、反义法、基因插入法、人工突变法、利用病毒载体的PTGS法等来进行。

利用痘苗病毒的癌症病毒治疗的对象癌没有限定，可举出卵巢癌、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌、肝癌、肝细胞癌、结肠癌、肛门/直肠癌、食道癌、子宫癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、头颈癌、脑/神经肿瘤、胸腺癌、淋巴瘤/白血病、骨/骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、黑色素瘤等所有的癌症。

含有本发明的痘苗病毒的治疗癌症用的药物组合物含有药物上有效剂量的本发明的痘苗病毒作为有效成分，可以是无菌的水性或非水性溶液、悬浮液或乳状液的形式。进一步，可以含有盐、缓冲剂、佐剂等药学上可接受的稀释剂、助剂、载体等。给予可以通过各种胃肠外途径，例如，皮下途径、静脉内途径、皮内途径、肌内途径、腹腔内途径、鼻内途径、经皮途径。此外，也可以向癌症部位进行局部给予。有效给予量可以根据受试者的年龄、性别、健康和体重等适当确定。例如，虽然没有限定，但对于成年人，每次给予约为10

本发明还包括癌症的治疗方法，其包括将上述的痘苗病毒给予癌症患者。

而且，本发明的痘苗病毒可以含有外源基因(外源DNA或外源多核苷酸)。作为外源基因(外源DNA或外源多核苷酸)，可举出标记基因、编码具有细胞毒性和免疫激活作用的产物的治疗用基因，进一步可举出编码癌症、病毒、细菌、原虫等蛋白抗原的DNA。标记基因也称为报告基因，可举出萤光素酶(LUC)基因、绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein；GFP)等荧光蛋白基因、红色荧光蛋白(DsRed)等荧光蛋白基因、β葡萄糖醛酸苷酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、β-半乳糖苷酶(LacZ)基因等。含有这些外源基因的溶瘤性痘苗病毒可称为痘苗病毒载体。

治疗用基因是能够用于癌症和感染性疾病等特定疾病的治疗的基因，可举出编码p53、Rb等肿瘤抑制基因、白细胞介素1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-17、IL-18、IL-24、趋化因子2(CCL2)、CCL5、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CD40L、CD70、CD80、CD137L、OX-40L、GITRL、LIGHT、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮他丁、METH-1、METH-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、MIP1a、FLT3L、HPGD、TRIF、DAI、肿瘤坏死因子等生理活性物质的基因、编码具有CTLA4、PD1、PD-L1抑制作用的抗体等基因。表达萤光素酶和GFP的痘苗病毒可以简单、快速检测出作为其感染细胞的癌细胞。在将本发明的痘苗病毒用于治疗癌症时，针对癌症的治疗用基因可以与痘苗病毒所具有的溶瘤性同时发挥癌症治疗效果。

通过导入编码病毒、细菌、原虫和癌症等抗原的DNA作为外源基因(外源DNA)，可以将导入外源基因的痘苗病毒载体用作针对各种病毒、细菌、原虫和癌症的疫苗。例如，导入编码人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、分枝杆菌、疟原虫、重症急性呼吸综合征(SARS＝萨斯)病毒等感染保护性抗原(中和抗原)、或者WT1、MART-1、NY-ESO-1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、KIF20A、存活蛋白、AFP-1、gp100、MUC1、PAP-10、PAP-5、TRP2-1、SART-1、VEGFR1、VEGFR2、NEIL3、MPHOSPH1、DEPDC1、FOXM1、CDH3、TTK、TOMM34、URLC10、KOC1、UBE2T、TOPK、ECT2、MESOTHELIN、NKG2D、P1A、5T4、B7-H6、BCMA、CD123、CD133、CD138、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD38、CD44、CEA、cMet、CS1、EGFR、EGFRvIII、EphA2、ErbB2、FAP、FR-α、HER2、IL13Ra2、MUC1、MUC16、NKG2D、PSCA、PSMA、ROR1、TARP、DLL3、PRSS21、密封蛋白18.2、密封蛋白18、CAIX、L1-CAM、FAP-α、CTAG1B、FR-α等蛋白、GD2、GM2等糖脂等的癌抗原的基因即可。

这些外源基因例如可通过使用同源重组的方法进行导入。同源重组可以按照上述方法来进行。例如，制作要导入的位点的DNA序列中连接需导入的外源基因而成的质粒(转移载体)，将其导入被痘苗病毒感染的细胞中即可。外源基因的导入区域优选在对痘苗病毒的生命周期不是必需的基因中。

另外，当导入外源基因时，希望在外源基因上游以发挥适当启动子功能的形式进行连接。启动子没有限制，但可使用上述的PSFJ1-10、PSFJ2-16、p7.5K启动子、p11K启动子、T7.10启动子、CPX启动子、HF启动子、H6启动子、T7杂合启动子等。本发明的痘苗病毒载体中导入外源基因的方法可以通过构建重组痘苗病毒载体的公知方法来进行，例如可按照別冊実験医学ザ·プロトコールシリーズ遺伝子導入&発現解析実験法(附册实验医学操作指南系列基因导入与表达分析实验法)，齐藤泉等人编辑，羊土社(1997年9月1日发行)、或者D.M.Glover等人编、加藤郁之进为翻译负责人的DNAクローニング4－哺乳類のシステム－(DNA克隆4-哺乳动物系统-)(第2版)TaKaRa、EMBO Journal(1987年6卷p.3379-3384等的记载。

本发明也包括具有细胞融合能力的痘苗病毒与免疫检查点抑制剂的联合使用治疗。

免疫检查点抑制剂包括抗PD-1(程序性死亡受体1，Programmed cell death 1)抗体、抗PD-L1(程序性死亡配体1，Programmed cell-death ligand 1)抗体、抗CTLA-4抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂等。这些之中优选抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体。作为抗PD-1抗体，可举出纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、斯巴达珠单抗(Spartalizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、替雷利珠单抗(Tislelizumab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)等，作为抗PD-L1抗体，可举出阿维鲁单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)等。

免疫检查点抑制剂可以通过公知的方法进行给予。免疫检查点抑制剂的给予量根据症状、年龄、体重和其他状态而变化，例如，0.001mg～100mg的用量每隔数天、数周或数月通过皮下注射、肌内注射、静脉内注射等进行给予。

免疫检查点抑制剂可以包括在制剂领域中常用的载体、稀释剂、赋形剂等。例如，作为片剂用的载体、赋形剂，可使用乳糖、硬脂酸镁等。作为注射用水溶液，可使用含生理盐水、葡萄糖和其他助剂的等渗液等，也可以联合使用酒精、丙二醇等多元醇、非离子表面活性剂等增溶剂。作为油状液体，也可以联合使用芝麻油、大豆油等，苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶剂。

本发明的具有细胞融合能力的痘苗病毒和免疫检查点抑制剂可以在癌症治疗中起到协同效果。在联合使用具有细胞融合能力的痘苗病毒和免疫检查点抑制剂时的癌症治疗效果显著高于单独使用具有细胞融合能力的痘苗病毒时或单独使用免疫检查点抑制剂时的癌症治疗效果。

给予本发明的具有细胞融合能力的痘苗病毒可以与免疫检查点抑制剂的给予同时或分开、或连续地进行。给予具有细胞融合能力的痘苗病毒也可以在免疫检查点抑制剂的给予前或给予后进行。优选地，给予具有细胞融合能力的痘苗病毒在免疫检查点抑制剂的给予前进行。

本发明还包括含有具有细胞融合能力的痘苗病毒和免疫检查点抑制剂的组合、组合制剂或组合药物套装。

本发明还包括在用于治疗癌症的药品的制备中组合使用具有细胞融合能力的痘苗病毒和免疫检查点抑制剂的方法。

本发明还包括含有具有细胞融合能力的痘苗病毒和免疫检查点抑制剂的药物。

本发明进一步包括用于与免疫检查点抑制剂联合使用的具有细胞融合能力的痘苗病毒。

实施例

通过下面的实施例来具体说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例1具有细胞融合能力的痘苗病毒的结构

在VGF与O1L这两者均不起作用的促分裂原活化蛋白激酶依赖性基因重组痘苗病毒(国际公布第W02015/076422号)中，为了插入到与VGF基因和O1L基因不同的外源基因的表达单元中，以pTagBFP-N(FP172，Evrogen公司)的DNA为模板，通过2个引物(SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2)扩增BFP基因区域。各自PCR产物用限制性内切酶SfiI和EcoRI进行酶切，将其克隆在pTK-SP-LG载体(国际公布第WO2015/076422号)的相同限制性内切酶位点中，构建在合成痘苗病毒启动子(Hammond JM.et al.,Journal of Virological Methods.1997；66(1):135-138)下游连接BFP而成的pTNshuttle/TK-SP-BFP。接着，pTNshuttle/TK-SP-BFP用限制性内切酶SphI和EcoRI进行酶切，在平端化处理后，将该SP-BFP片段克隆到pUC19-VGF载体(国际公布第WO2015/076422号)用限制性内切酶AccI酶切并进行平端化处理的位点或pUC19-O1L载体(国际公布第WO2015/076422号)用限制性内切酶XbaI酶切并进行平端化处理的位点，构建用于使与VGF反向地表达BFP的穿梭载体pTNshuttle/VGF-ST-BFP或用于使与O1L反向地表达BFP的pTNshuttle/O1L-SP-BFP。另一方面，按照与国际公布第WO2015/076422号相同的方法，不在合成痘苗病毒启动子而在p7.5K启动子下游，构建用于与O1L同向地表达DsRed的pUC19-O1L-P-DsRed。使VGF-LucGFP/O1L-DsRed以MOI＝0.1～0.5感染在24孔板中培养至达到80％汇合度时的CV1细胞，室温下吸附1小时。然后，将与FuGENE HD(Roche)混合的转移载体质粒pTNshuttle/O1L-SP-BFP按照操作手册添加到细胞中并使其摄入，37℃下培养2～3天。收集细胞并冻融后，进行超声波处理，对基本达到汇合度时的BSC1细胞进行适当稀释并接种，加入含0.5％甲基纤维素的Eagle MEM、5％FBS培养基，37℃下培养2～4天。除去培养基，用吸头尖刮取表达BFP的蚀斑，悬浮于opti-MEM培养基(Invitrogen)中。用BSC1细胞进一步重复3次以上的该操作，纯化蚀斑。对纯化蚀斑后选取的蚀斑悬浮液进行超声处理，然后取其200μL使用高纯度病毒核酸纯化试剂盒(High PureViral Nucleic Acid Kit)(Roche)并按照操作手册提取基因组DNA，供PCR筛选用。对于O1L，通过2个引物(SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4)进行PCR，对于检测出了预定大小的PCR产物的克隆，通过直接测序来确认PCR产物的核苷酸序列。选择核苷酸序列无问题的病毒克隆VGF-LucGFP/O1L-BFP，用A549细胞扩增，然后供用RK13细胞测定病毒效价的实验用。基于该痘苗病毒(VGF-LucGFP/O1L-BFP)和转移载体质粒DNA (pUC19-O1L-P-DsRed)，并以DsRed的表达为指标，按照与上述相同的方法收集重组病毒，制成VGF-LucGFP/O1L-DsRed。

在制作该基因重组痘苗病毒的步骤中，以极高的频率出现通常看不到的具有细胞融合能力的病毒。因此，除去培养基，用吸头尖刮取融合性状的蚀斑，悬浮于opti-MEM培养基(Invitrogen)中。用BSC1细胞进一步重复3次以上的该操作，通过纯化蚀斑获得2个具有细胞融合能力的病毒克隆。这两个克隆进行利用下一代测序仪PacBio RSII(PacificBioscience公司)或PCR的直接测序，从得到的序列信息中发现K2L或HA基因中的突变，具有如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。K2L是全长1110bp的基因，其中第762bp的鸟嘌呤突变为腺嘌呤。由此，可知第254位的氨基酸从色氨酸突变为终止密码子，发生了无义突变。此外，HA是全长933bp的基因，第70bp的腺嘌呤发生缺陷。由此可知发生了移码突变。综上所述，获得的2个具有细胞融合能力的病毒克隆相对于作为亲本病毒的VGF-LucGFP/O1L-DsRed(国际公布第W02015/076422号)(图1A)，称为VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed和VGF-LucGFP/O1L-BFP/HAmut(图1B和图1C)，各重组病毒在A549细胞中大量培养并纯化后，用RK13细胞测定病毒效价，供实验用。

接着，以pGL4.20(F6751，Promega公司)的DNA为模板，通过2个引物(SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8)扩增Luc2基因区域。各自PCR产物用限制性内切酶BspEI和NheI进行酶切，将其以替换为BFP基因的方式克隆在pTNshuttle/VGF-SP-BFP载体的AgeI与NheI限制性内切酶位点中，从而构建成pTNshuttle/VGF-SP-Luc。另一方面，以智人(H.sapiens)中密码子最佳化的方式合成的大肠杆菌LacZ基因(SEQ ID NO:9)用限制性内切酶AgeI和NheI进行酶切，将其以替换为BFP基因的方式克隆在pTNshuttle/O1L-SP-BFP载体的相同限制性内切酶位点中，从而构建成pTNshuttle/O1L-SP-LacZ。

为了收集如图1B所示的具有病毒基因组的重组痘苗病毒，基于痘苗病毒(VGF-LucGFP/O1L-DsRed或VGF-LucGF P/K2Lmut/O1L-DsRed)和转移载体质粒DNA(pTNshuttle/VGF-SP-Luc)，并以GFP表达消失为指标，按照与上述相同的方法收集重组病毒，制成VGF-Luc/O1L-DsRed或VGF-Luc/K2Lmut/O1L-DsRed。基于该痘苗病毒(VGF-Luc/O1L-DsRed或VGF-Luc/K2Lmut/O1L-DsRed)和转移载体质粒DNA(pTNshuttle/O1L-SP-LacZ)，并以DsRed表达消失为指标，按照与上述相同的方法收集重组病毒，供PCR筛选用。关于VGF，通过2个引物(SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11)，关于K2L，通过2个引物(SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13)进行PCR，对于检测出了预定大小的PCR产物的克隆，通过直接测序来确认PCR产物的核苷酸序列。制成核苷酸序列无问题的病毒克隆VGF-Luc/O1L-LacZ或VGF-Luc/K2Lmut/O1L-LacZ(图1D和E)。各重组病毒在A549细胞中大量培养并纯化，然后用RK13细胞测定病毒效价，供实验用。

实施例2具有细胞融合能力的痘苗病毒的特性分析

为了比较不具有细胞融合能力的VGF-LucGFP/O1L-DsRed与具有细胞融合能力的VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed和VGF-LucGFP/O1L-BFP/HAmut，进行各病毒的感染。首先在96孔板中将各种癌细胞(人卵巢癌RMG1细胞、人结肠癌CaCO2细胞、人肺癌A549细胞、小鼠结肠癌CT26细胞)以RMG1和CaCO2为2.0×10

接着，使用VGF-LucGFP/O1L-DsRed和VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed验证了是否由于发生细胞融合变化而对抗癌效果产生影响。首先，在96孔板中以1.0×10

实施例3具有细胞融合能力的痘苗病毒的抗癌效果

接着，使用各种人、小鼠癌细胞研究了除了A549以外的细胞存活率。将人卵巢癌细胞(SKOV3：2.0×10

这时，如果观察感染图像，则在VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed中可确认到细胞融合感染图像，显示出在广泛的癌症中与VGF-LucGFP/O1L-DsRed不同的感染图像(图4-1)。进一步，在细胞存活率中，可见VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed中以t检验与VGF-LucGFP/O1L-DsRed相比显著性减少(SKOV3：**P＝0.0021，Panc1：***P-＝0.0003，CaCO2：***P<0.0001，MDA-MB-231：***P＝0.0004，A549：***P<0.0001，PC3：*P＝0.0284，A431：*P＝0.0480，B16-F10：***P＝0.0004，CT26：**P＝0.0030，TC1：***P-＝0.0006)。由此，显示出VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed在广泛的癌症中抗肿瘤效果得到提高(图4-2)。

实施例4在体外(In vitro)的具有细胞融合能力的痘苗病毒的抗癌效果机理分析

使用凋亡/坏死/健康细胞检测试剂盒(Apoptotic/Necrotic/Healthy CellsDetection Kit)(宝生物)验证了在人肺癌细胞株(A549)与小鼠结肠癌细胞株(CT26)中是否显著发生了凋亡、坏死。首先，将A549或CT26在96孔板中以1.0×10

实施例5具有细胞融合能力的痘苗病毒在体内(In vivo)的治疗效果

接着，使用同种移植模型，进行了病毒在生物体内的增殖、传播和病毒的治疗效果研究。

将小鼠结肠癌细胞株(CT26)以5.0×10

实施例6具有细胞融合能力的痘苗病毒在体内的治疗效果机理分析

接着，为了分析在体内的治疗效果提高的机理，使用流式细胞仪进行了免疫学分析。将小鼠结肠癌细胞株(CT26)以5.0×10

通过免疫学分析的结果，表明CD8 T细胞的浸润对病毒未给予侧的治疗效果很重要，因此通过抑制剂抑制了CD8 T细胞的作用。将小鼠结肠癌细胞株(CT26)以5.0×10

实施例7具有细胞融合能力的痘苗病毒在进展期的荷瘤模型小鼠中的治疗效果

通过同种移植模型考察了在小鼠生物体内肿瘤体积进一步增大时在病毒的生物体内的增殖、传播与病毒的治疗效果研究。

将小鼠结肠癌细胞株(CT26)以5.0×10

实施例8同时具有细胞融合能力和肿瘤靶向能力的痘苗病毒的抗癌效果

关于利用细胞融合的抗癌效果提高，为了证实上述的K2L突变中不仅通过细胞融合，而且通过所有的突变和缺失或外源基因插入得到应用，以及不仅利用使上述的VGF和O1缺失的肿瘤特异性，而且能够与所有的方法进行组合，从而制作以下各种同时具有细胞融合能力和肿瘤靶向能力的痘苗病毒，比较评价了在体外的抗癌效果。

作为同时具有细胞融合能力和肿瘤靶向能力的痘苗病毒，使用了以下克隆。

VGF-LucGFP/ΔK2L-BFP/O1L-DsRed(图15-1A)

K2L缺陷且具有细胞融合能力，并且VGF和O1L缺陷且保证肿瘤特异性的克隆

VGF-LucGFP(图15-1B)

通过VGF缺陷而保证肿瘤特异性的克隆

TK-GFP(图15-1C)

通过TK缺陷而保证肿瘤特异性的克隆

未修饰病毒(图15-1D)

K2L、VGF、O1L和TK均不缺陷的克隆

VGF-LucGFP/K2L-BFP(图15-1E)

K2L缺陷且具有细胞融合能力，并且通过VGF缺陷而保证肿瘤特异性的克隆

K2L-BFP/TK-GFP(图15-1F)

K2L缺陷且具有细胞融合能力，并且TK缺陷而保证肿瘤特异性的克隆

K2L-BFP(图15-1G)

K2L缺陷且具有细胞融合能力的克隆

这些克隆的制作方法如下所示。

为了制作完全缺失K2L基因的基因重组痘苗病毒，在K2L基因及其5'和3'侧翼区(SEQ ID NO:14)中，制作了具有将K2L基因替换为BFP基因的序列(SEQ ID NO:15)的质粒pTNshuttle/ΔK2L-BFP。基于痘苗病毒(VGF-LucGFP/O1L-DsRed)和转移载体质粒DNA(pTNshuttle/ΔK2L-BFP)，并以BFP的表达为指标，按照与上述相同的方法收集重组病毒，供PCR筛选用。对于K2L，通过与上述相同的引物(SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13)进行PCR，对于检测出了预定大小的PCR产物的克隆，通过直接测序确认PCR产物的核苷酸序列，制成VGF-LucGFP/ΔK2L-BFP/O1L-DsRed(图15-1A)。为了插入到与K2L基因不同的外源基因的表达单元中，以LC16mO株的基因组DNA为模板，通过2个引物(SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:17)扩增K2L基因区域。其PCR产物用限制性内切酶XbaI和MfeI进行酶切，将其克隆在pUC19载体的限制性内切酶位点XbaI与EcoRI中，构建了pUC19-K2L。接着，pTNshuttle/TK-SP-BFP用限制性内切酶SphI和EcoRI进行酶切，在平端化处理后，将该SP-BFP片段克隆到pUC19-K2L载体被限制性内切酶ClaI酶切并进行平端化处理的位点中，构建了pTNshuttle/K2L-SP-BFP。基于痘苗病毒(未进行基因重组的无改良的未修饰病毒的LC16mO株)和转移载体质粒DNA(pTNshuttle/K2L-SP-BFP)，并以BFP的表达为指标，按照与上述相同的方法收集重组病毒，供PCR筛选用。对于K2L，通过与上述相同的引物(SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13)进行PCR，对于检测出了预定大小的PCR产物的克隆，通过直接测序确认PCR产物的核苷酸序列，制成K2L-BFP(图15-1G)。为了插入到与TK基因不同的外源基因的表达单元中，由pEGFP-N1(KRONTEC株式会社)用限制性内切酶AgeI和NotI进行酶切，将其以替换为BFP基因的方式克隆在pTNshuttle/TK-SP-BFP载体的相同限制性内切酶位点中，从而构建成pTNshuttle/TK-SP-GFP。基于痘苗病毒(未进行基因重组的无改良的未修饰病毒的LC16mO株)和转移载体质粒DNA(pTNshuttle/TK-SP-GFP)，并以GFP的表达为指标，按照与上述相同的方法收集重组病毒，供PCR筛选用。对于TK，通过2个引物(SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19)进行PCR，对于检测出了预定大小的PCR产物的克隆，通过直接测序确认PCR产物的核苷酸序列，制成TK-GFP(图15-1C)。为了制作同时具有细胞融合能力和肿瘤靶向能力的痘苗病毒，基于VGF不起作用的基因重组痘苗病毒VGF-LucGFP(国际公布第W02015/076422号)或上述的TK不起作用的基因重组痘苗病毒TK-GFP和转移载体质粒DNA(pTNshuttle/K2L-SP-BFP)，并以BFP的表达为指标，按照与上述相同的方法收集重组病毒，供PCR筛选用。关于VGF，通过与上述相同的引物(SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11)，关于K2L，通过与上述相同的引物(SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13)，对于TK，通过与上述相同的引物(SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19)进行PCR，对于检测出了预定大小的PCR产物的克隆，通过直接测序确认PCR产物的核苷酸序列，制成VGF-LucGFP/K2L-BFP(图15-1E)或K2L-BFP/TK-GFP(图15-1F)。各重组病毒在A549细胞中大量培养，然后用RK13细胞测定病毒效价，供实验用。

接着，在体外对细胞存活率和ICD进行了研究。图15-2和15-3中表示感染10种病毒(VGF-LucGFP/O1L-DsRed(图1A)、VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed(图1B)、VGF-LucGFP/ΔK2L-BFP/O1L-DsRed(图15-1A)、VGF-LucGFP/O1L-BFP/HAmut(图1C)、VGF-LucGFP(图15-1B)、VGF-LucGFP/K2L-BFP(图15-1E)、TK-GFP(图15-1C)、K2L-BFP/TK-GFP(图15-1F)、未修饰病毒(图15-1D)和K2L-BFP(图15-1G))时的细胞存活率的结果。将1.0×10

由以上结果，显示出通过痘苗病毒引起细胞融合来提高抗癌效果。分析其机理时，发现是由以下三点造成的。首先，通过提高病毒的增殖、传播能力使溶瘤能力提高，此外凋亡、坏死活跃发生。接着，通过融合，更有效地诱导ICD并增强CD8 T细胞向给予侧、未给予侧的浸润。最后，通过改善给予侧、未给予侧的肿瘤内免疫环境，癌免疫变得更容易发挥作用。即，诱导细胞融合的溶瘤病毒与不诱导细胞融合的溶瘤病毒相比，通过更有效地使免疫难以发挥作用的冷肿瘤转变为易受免疫攻击热肿瘤，发挥更高的抗癌效果(图16)。

实施例8具有细胞融合能力的痘苗病毒与抗PD-1抗体的联合使用治疗效果

由于表明CD8 T细胞的作用对于病毒的治疗效果、特别是对未给予侧的治疗效果很重要，因此通过与作为免疫检查点抑制剂的抗PD-1抗体的联合使用来促进了CD8 T细胞的作用。将小鼠结肠癌细胞株(CT26)以5.0×10

在未给予抗体时，可知与图9同样地在病毒给予侧VGF-Luc/O1L-lacZ给予小鼠和VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ给予小鼠这两者中肿瘤体积得到抑制，通过双因素方差统计分析，与PBS给予小鼠相比，存在显著性差异(***P<0.001)。此外，未给予侧也与图9同样地通过给予VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ，PBS给予或VGF-Luc/O1L-lacZ给予时虽然获得了以上的肿瘤抑制效果，但在大多数的小鼠中并没有使肿瘤得到缓解。另一方面，在联合使用抗PD-1抗体时，在病毒给予侧给予病毒时的肿瘤抑制效果增强，在给予VGF-Luc/O1L-lacZ中3/5只、在给予VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ的全部(6/6只)小鼠中使给予的肿瘤得到缓解。进一步在病毒未给予侧，抗PD-1抗体的联合使用也大幅增强了病毒的治疗效果，但在VGF-Luc/O1L-lacZ给予小鼠中并没有使未给予侧的肿瘤得到缓解。另一方面，与VGF-Luc/O1L-lacZ给予小鼠相比，VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ给予小鼠显著性抑制了肿瘤体积可通过双因素方差统计分析得到确认(***<0.001)，在3/6只的小鼠中使给予与未给予侧两者的肿瘤得到缓解。图19中表示联合使用抗PD-1抗体的小鼠的给予病毒后的存活曲线。通过Log-rank统计分析，在未给予抗体时，与PBS给予小鼠相比，VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ给予小鼠显著性延长了存活时间(*：P＝0.0112)，但与VGF-Luc/O1L-lacZ给予小鼠相比，未显示出显著性差异。另一方面，在联合使用抗PD-1抗体时，与PBS给予小鼠和VGF-Luc/O1L-lacZ给予小鼠这两者相比，VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ给予小鼠也能够确认到显示出显著性的延长小鼠生命效果(***：P＝0.0007、**：P＝0.0066)。

接着，为了确认肿瘤完全治愈的小鼠有无对肿瘤的免疫记忆，向完全治愈小鼠进行肿瘤细胞的再移植。通过联合给予VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ与抗PD-1抗体，对于肿瘤缓解的小鼠，自给予病毒起在第101天将小鼠结肠癌细胞株(CT26)以5.0×10

综上所述，表明了抗PD-1抗体的联合使用可以大大增强具有细胞融合能力的痘苗病毒的治疗效果，促进抗肿瘤免疫的诱导和免疫记忆的形成。

工业上的可利用性

诱导受感染细胞的细胞融合的痘苗病毒可以用于治疗癌症。

本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用全文并入本说明书中。

序列表自由文本

1～4、7、8、10～13、16～19：引物。

序列表

<110> 国立大学法人鸟取大学

<110> 进化生物治疗有限公司

<120> 诱导细胞融合的溶瘤病毒

<130> PH-8396-PCT

<150> JP 2019-091609

<151> 2019-05-14

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 1

atggccggac cggccaccgg tcgccaccat gagcgag 37

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 2

tcgaattcgc tagcggccgc ttaattaagc ttgtgcccca g 41

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 3

acagggatta agacggaaag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 4

gtcaacaagc atcttccaac 20

<210> 5

<211> 1110

<212> DNA

<213> 痘苗病毒(Vaccinia virus)

<400> 5

atgattgcgt tattgatact atcgttagcg tgttcagcgt ccgcctatcg tctacaagga 60

tttaccaatg ccggtatagt agcgtataaa aatattcaag atgataatat tgtcttctca 120

ccgtttggtt attcgttttc tatgtttatg tcgctattgc ctgcatcagg taatactaga 180

atagaattat tgaagactat ggatttgaga aaaagagatc tgggtccagc atttacagaa 240

ttaatatcag gattagctaa gctgaaaaca tctaaatata cgtacactga tctaacttat 300

caaagtttcg tagataatac tgtgtgtatt aaaccgtcgt attatcaaca atatcataga 360

ttcggcctat atagattaaa ctttagacga gatgcggtta ataaaattaa ttctatagta 420

gaacgtagat ccggtatgtc taatgtagta gattctaata tgctcgacaa taatactcta 480

tgggcaatca ttaatactat atattttaaa ggtatatggc aatatccgtt tgatatcact 540

aaaacacgca atgctagttt tactaataag tacggtacga aaacggttcc catgatgaac 600

gtagttacta aattgcaagg aaatacaatc acaatcgatg acaaagaata tgacatggta 660

cgccttccgt ataaggatgc taatattagt atgtacctgg caataggtga taatatgacc 720

catttcacag attctatcac ggctgcaaaa ttagactatt gatcgtttca attagggaat 780

aaagtgtaca atcttaaact ccctaaattt tctatcgaaa ataagaggga tattaagtcg 840

atagccgaaa tgatggctcc tagtatgttt aatccagata atgcgtcgtt taaacatatg 900

actagggacc cattatatat ttataaaatg tttcagaatg caaagataga tgtcgacgaa 960

caaggaactg tagcagaggc atctactatt atggtagcta cggcgagatc atctcctgaa 1020

aaactggaat ttaatacacc atttgtgttc atcatcagac atgatattac tggatttata 1080

ttgtttatgg gtaaggtgga atctccttaa 1110

<210> 6

<211> 932

<212> DNA

<213> 痘苗病毒(Vaccinia virus)

<400> 6

atgacacgat taccaatact tttgttacta atatcattag tatacgctac accttctcct 60

cagacatcta aaaaataggt gatgatgcaa ctctatcatg taatcgaaat aatacaaatg 120

actacgttgt tatgagtgct tggtataagg agcccaattc cattattctt ttagctgcta 180

aaagcgacgt cttgtatttt gataattata ccaaggataa aatatcttac gactctccat 240

acgatgatct agttacaact atcacaatta aatcattgac tgctagagat gccggtactt 300

atgtatgtgc attctttatg acatcgccta caaatgacac tgataaagta gattatgaag 360

aatactccac agagttgatt gtaaatacag atagtgaatc gactatagac ataatactat 420

ctggatctac acattcaccg gaaactagtt ctgagaaacc tgattatata gataattcta 480

attgctcgtc ggtattcgaa atcgcgactc cggaaccaat tactgataat gtagaagatc 540

atacagacac cgtcacatac actagtgata gcattaatac agtaagtgca tcatctggag 600

aatccacaac agacgagact ccggaaccaa ttactgataa agaagaagat catacagtca 660

cagacactgt ctcatacact acagtaagta catcatctgg aattgtcact actaaatcaa 720

ccaccgatga tacgtacaat gataatgata cagtaccacc aactactgta ggcggtagta 780

caacctctat tagcaattat aaaaccaagg actttgtaga aatatttggt attaccgcat 840

taattatatt gtcggccgtg gcaatattct gtattacgta ttatatatgt aataaacgtt 900

cacgtaaata caaaacagag aacaaagtct ag 932

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 7

gctccggacg ccaccatgga agatgccaaa aac 33

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 8

gcgaattcgc tagcttacac ggcgatcttg ccgcccttc 39

<210> 9

<211> 3076

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(E.coli)

<400> 9

accggtcgcc accatggacc cggtggtgct gcagaggcgg gattgggaga atcctggggt 60

gacgcagctg aatcggctgg ctgctcaccc accatttgca tcatggagaa attccgaaga 120

ggcccggacc gaccgcccct ctcagcagct cagaagtctt aatggagaat ggcgcttcgc 180

atggtttcct gctcccgagg ctgtaccgga aagttggctc gagtgcgatt tgcccgaggc 240

agataccgtc gtggttccct ccaactggca gatgcacggc tatgatgccc ctatctacac 300

caatgtcact taccctataa cagtgaaccc accctttgtg cctaccgaga atcccaccgg 360

atgctacagt ctgacattta acgtggacga gtcttggctg caggaaggcc agactagaat 420

catcttcgat ggtgtcaaca gcgcttttca tctgtggtgc aacgggcgtt gggtgggtta 480

cggccaagac agtaggctcc cttctgaatt cgatctctct gccttcctgc gggccggtga 540

gaatagactt gccgttatgg ttctgcgttg gagcgacggt tcctacctgg aggaccagga 600

tatgtggagg atgtctggca ttttccgaga tgtgagcctc cttcacaaac ctaccactca 660

aatctccgac tttcatgttg ccacaaggtt caacgacgac ttttcacgcg ctgttctgga 720

ggccgaggtc caaatgtgcg gcgaactgcg cgattatctg cgcgtgactg tgagcctttg 780

gcaaggagag acacaggtgg catcaggcac cgcacccttc ggcggagaaa tcatcgacga 840

acggggagga tatgctgata gggttactct taggctgaat gtagaaaacc ccaagctctg 900

gtctgcagaa atacctaacc tctatcgcgc agttgtggaa ctgcacacgg cagacgggac 960

cctgattgaa gccgaagcct gtgacgtcgg cttccgtgaa gtgcgcatcg agaatgggct 1020

gctccttctt aacggtaagc cactgttgat cagaggcgtg aataggcatg agcatcatcc 1080

gctccacgga caggtgatgg atgagcagac aatggttcag gacatactct tgatgaaaca 1140

gaacaacttc aatgccgtgc gctgtagcca ctaccctaat cacccactgt ggtataccct 1200

gtgtgacagg tacggcctgt atgtcgtgga tgaggcaaac attgaaactc atggcatggt 1260

gccaatgaat cggctgacag atgaccccag atggctgccc gccatgtcag agcgtgtgac 1320

caggatggta cagcgggaca gaaatcaccc cagtgtcata atctggtccc ttgggaacga 1380

atcagggcat ggtgcaaacc acgatgctct gtaccgctgg attaagagcg ttgaccctag 1440

tcggccagtg cagtatgaag gtggaggcgc cgataccact gcaactgaca ttatttgccc 1500

aatgtacgct cgggtcgacg aggatcaacc gttccctgcg gtcccaaagt ggagcattaa 1560

gaaatggctg tctttgcctg gagaaacacg cccgctgatt ctgtgcgaat atgcccacgc 1620

aatggggaac tccctgggcg ggtttgcaaa gtattggcag gcttttcgcc agtatccacg 1680

actgcaggga ggctttgtgt gggactgggt agatcagagc ctgatcaaat acgacgaaaa 1740

tggcaatcca tggtccgcct atggaggtga ctttggtgat acccctaatg acaggcagtt 1800

ttgcatgaac ggactcgtct ttgcagatcg aactccacat ccggccctga ctgaggccaa 1860

gcatcagcag caattcttcc agtttcggct gtctgggcag accattgagg tgacttccga 1920

gtacttgttt cgacacagcg acaatgagct gctgcactgg atggtggccc tcgatggcaa 1980

accactggcc tcaggagagg tgcccctgga tgtagcgccc caggggaaac agcttatcga 2040

gttgcccgaa ctgccccaac ccgagtctgc tgggcaactc tggcttaccg tgcgagtcgt 2100

tcagccaaat gccactgcct ggtccgaggc tggccacatt agcgcatggc agcagtggag 2160

actggctgag aacctcagcg ttacccttcc cgcagcctct cacgccatcc ctcacttgac 2220

cactagtgag atggacttct gtatcgagct gggcaacaaa cgctggcagt ttaacagaca 2280

gtcaggcttc ttgtcccaga tgtggattgg cgacaagaag cagctgttga cccctttgcg 2340

ggatcagttc acaagggcgc ctctggacaa tgacatcgga gtgagcgagg ctacacgaat 2400

agatccaaac gcgtgggtcg agaggtggaa ggcggctggg cactaccaag ctgaagcggc 2460

cctgttgcaa tgtaccgccg atacgctcgc cgatgccgtc ctcattacga cagcccacgc 2520

ttggcagcac cagggcaaaa cactgtttat ctcccgtaag acatacagaa tcgatggcag 2580

cggtcaaatg gccattacgg tagacgtgga agttgcgtca gatacacccc atcccgcgag 2640

gatcggactg aactgtcaat tggcccaagt cgcagagaga gtgaactggc tgggactcgg 2700

gcctcaggag aattatccag accggctcac agccgcttgc ttcgataggt gggaccttcc 2760

actctctgat atgtacaccc catacgtgtt cccctcagag aatggcctgc ggtgtgggac 2820

acgagaactg aactacggac cgcatcagtg gagaggggac ttccagttca acatcagccg 2880

gtatagtcag cagcagctga tggaaacgtc ccatagacat ctgctgcacg ctgaggaagg 2940

gacatggctg aacattgacg ggttccacat gggaataggt ggcgatgaca gctggtcccc 3000

tagcgtaagc gccgagtttc aactgagtgc tgggagatat cattaccaac tggtctggtg 3060

ccagaaatga gctagc 3076

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 10

ggtaacgcta tcgaaacgac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 11

ttagttcgtc gagtgaacct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 12

caaggcacta tgaccgttga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 13

gcgatgagat acaaccggaa 20

<210> 14

<211> 2110

<212> DNA

<213> 痘苗病毒(Vaccinia virus)

<400> 14

cttgtcatca aattgtgaat catccagtcc actgaatagc aaaatcttta ctattttagt 60

atcttccaat gtggctgcct gatgtaatgg aaattcattc tctagaagat ttttcaatgc 120

tccagcgttc aacaacgtac atactagacg cacgttatta tcagctattg cataatacaa 180

ggcactatga ccgttgatat ccgccttaaa tgcatctttg ctagagagaa agcttttcag 240

ctgcttagac ttccaagtat taattcgtga cagatccatg tctgaaacaa gacgctaatt 300

agtgtatatt ttttcatttt ttataatttt gtcatattgc accagaatta ataatatctc 360

taatagatct gattagtaga tacatggcta tcgcaaaaca acatatacac atttaataaa 420

aataatattt attaagaaaa ttcagatttc acgtacccat caatataaat aaaataatga 480

ttccttacac cgtacccata ttaaggagat tccaccttac ccataaacaa tataaatcca 540

gtaatatcat gtctgatgat gaacacaaat ggtgtattaa attccagttt ttcaggagat 600

gatctcgccg tagctaccat aatagtagat gcctctgcta cagttccttg ttcgtcgaca 660

tctatctttg cattctgaaa cattttataa atatataatg ggtccctagt catatgttta 720

aacgacgcat tatctggatt aaacatacta ggagccatca tttcggctat cgacttaata 780

tccctcttat tttcgataga aaatttaggg agtttaagat tgtacacttt attccctaat 840

tgaaacgacc aatagtctaa ttttgcagcc gtgatagaat ctgtgaaatg ggtcatatta 900

tcacctattg ccaggtacat actaatatta gcatccttat acggaaggcg taccatgtca 960

tattctttgt catcgattgt gattgtattt ccttgcaatt tagtaactac gttcatcatg 1020

ggaaccgttt tcgtaccgta cttattagta aaactagcat tgcgtgtttt agtgatatca 1080

aacggatatt gccatatacc tttaaaatat atagtattaa tgattgccca tagagtatta 1140

ttgtcgagca tattagaatc tactacatta gacataccgg atctacgttc tactatagaa 1200

ttaattttat taaccgcatc tcgtctaaag tttaatctat ataggccgaa tctatgatat 1260

tgttgataat acgacggttt aatacacaca gtattatcta cgaaactttg ataagttaga 1320

tcagtgtacg tatatttaga tgttttcagc ttagctaatc ctgatattaa ttctgtaaat 1380

gctggaccca gatctctttt tctcaaatcc atagtcttca ataattctat tctagtatta 1440

cctgatgcag gcaatagcga cataaacata gaaaacgaat aaccaaacgg tgagaagaca 1500

atattatcat cttgaatatt tttatacgct actataccgg cattggtaaa tccttgtaga 1560

cgataggcgg acgctgaaca cgctaacgat agtatcaata acgcaatcat gattttatgg 1620

tattaataat taaccttatt tttatgttcg gtataaaaaa attattgatg tctacacatc 1680

cttttgtaat tgacatctat atatcctttt gtataatcaa ctctaatcac tttaactttt 1740

acagttttcc ctaccagttt atccctatat tcaacatatc tatccatatg catcttaaca 1800

ctctctgcca agatagcttc agagtgagga tagtcaaaaa gataaatata tagagcataa 1860

tcattctcgt atactctgcc ctttattaca tcacccgcat tgggcaacga ataacaaaat 1920

gcaagcatct tgttaacggg ctcgtaaatt gggataaaaa ttatgttttt attgtcttat 1980

atctatttta ttcaagagaa tattcaggaa tttctttttc cggttgtatc tcatcgcagt 2040

atatatcatt tgtacattgt tttatatttt ttaatagttt acacctttta gtaggactag 2100

tatcgtacaa 2110

<210> 15

<211> 1702

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 合成的

<400> 15

cttgtcatca aattgtgaat catccagtcc actgaatagc aaaatcttta ctattttagt 60

atcttccaat gtggctgcct gatgtaatgg aaattcattc tctagaagat ttttcaatgc 120

tccagcgttc aacaacgtac atactagacg cacgttatta tcagctattg cataatacaa 180

ggcactatga ccgttgatat ccgccttaaa tgcatctttg ctagagagaa agcttttcag 240

ctgcttagac ttccaagtat taattcgtga cagatccatg tctgaaacaa gacgctaatt 300

agtgtatatt ttttcatttt ttataatttt gtcatattgc accagaatta ataatatctc 360

taatagatct gattagtaga tacatggcta tcgcaaaaca acatatacac atttaataaa 420

aataatattt attaagaaaa ttcagatttc acgtacccat caatataaat aaaataatga 480

ttccttacac cgtacccata ttaattaagc ttgtgcccca gtttgctagg gaggtcgcag 540

tatctggcca ctgccacctc gtgctgctcg acgtaggtct cgttgttggc ctccttgatt 600

ctttccagtc tgtagtccac atagtagacg ccaggcatct tgaggttctt agcgggtttc 660

ttggatctat atgtggtctt gatgtttgcg atcagatggc tcccgcccac gagcttcagg 720

gccatgtcgt ttctgccttc caggccgccg tcagcggggt acagcgtctc ggtgaaggcc 780

tcccagccga gtgttttctt ctgcatcaca gggccgttgg atgtgaagtt cacccctctg 840

atcttgacgt tgtagatgag gcagccgtcc tggaggctgg tgtcctgggt agcggtcagc 900

acgcccccgt cttcgtatgt ggtgactctc tcccatgtga agccctcagg gaaggactgc 960

ttgaagaagt cggggatgcc ctgggtgtgg ttgatgaagg tcttgctgcc gtagaggaag 1020

ctagtagcca ggatgtcgaa ggcgaagggg agagggccgc cctcgaccac cttgattctc 1080

atggtctggg tgccctcgta gggcttgcct tcgccctcgg atgtgcactt gaagtgatgg 1140

ttgtccacgg tgccctccat gtacagcttc atgtgcatgt tctccttaat cagctcgctc 1200

atgattttat ggtattaata attaacctta tttttatgtt cggtataaaa aaattattga 1260

tgtctacaca tccttttgta attgacatct atatatcctt ttgtataatc aactctaatc 1320

actttaactt ttacagtttt ccctaccagt ttatccctat attcaacata tctatccata 1380

tgcatcttaa cactctctgc caagatagct tcagagtgag gatagtcaaa aagataaata 1440

tatagagcat aatcattctc gtatactctg ccctttatta catcacccgc attgggcaac 1500

gaataacaaa atgcaagcat cttgttaacg ggctcgtaaa ttgggataaa aattatgttt 1560

ttattgtctt atatctattt tattcaagag aatattcagg aatttctttt tccggttgta 1620

tctcatcgca gtatatatca tttgtacatt gttttatatt ttttaatagt ttacaccttt 1680

tagtaggact agtatcgtac aa 1702

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 16

ttaacatccg ttgatggaag 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 17

ttagtcgcca tgactatctc 20

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 18

atttctccgt gataggtatc gatg 24

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的(Artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 19

aacggtttac gttgaaatgt cc 22

<210> 20

<211> 1110

<212> DNA

<213> 痘苗病毒(Vaccinia virus)

<400> 20

atgattgcgt tattgatact atcgttagcg tgttcagcgt ccgcctatcg tctacaagga 60

tttaccaatg ccggtatagt agcgtataaa aatattcaag atgataatat tgtcttctca 120

ccgtttggtt attcgttttc tatgtttatg tcgctattgc ctgcatcagg taatactaga 180

atagaattat tgaagactat ggatttgaga aaaagagatc tgggtccagc atttacagaa 240

ttaatatcag gattagctaa gctgaaaaca tctaaatata cgtacactga tctaacttat 300

caaagtttcg tagataatac tgtgtgtatt aaaccgtcgt attatcaaca atatcataga 360

ttcggcctat atagattaaa ctttagacga gatgcggtta ataaaattaa ttctatagta 420

gaacgtagat ccggtatgtc taatgtagta gattctaata tgctcgacaa taatactcta 480

tgggcaatca ttaatactat atattttaaa ggtatatggc aatatccgtt tgatatcact 540

aaaacacgca atgctagttt tactaataag tacggtacga aaacggttcc catgatgaac 600

gtagttacta aattgcaagg aaatacaatc acaatcgatg acaaagaata tgacatggta 660

cgccttccgt ataaggatgc taatattagt atgtacctgg caataggtga taatatgacc 720

catttcacag attctatcac ggctgcaaaa ttagactatt ggtcgtttca attagggaat 780

aaagtgtaca atcttaaact ccctaaattt tctatcgaaa ataagaggga tattaagtcg 840

atagccgaaa tgatggctcc tagtatgttt aatccagata atgcgtcgtt taaacatatg 900

actagggacc cattatatat ttataaaatg tttcagaatg caaagataga tgtcgacgaa 960

caaggaactg tagcagaggc atctactatt atggtagcta cggcgagatc atctcctgaa 1020

aaactggaat ttaatacacc atttgtgttc atcatcagac atgatattac tggatttata 1080

ttgtttatgg gtaaggtgga atctccttaa 1110

<210> 21

<211> 933

<212> DNA

<213> 痘苗病毒(Vaccinia virus)

<400> 21

atgacacgat taccaatact tttgttacta atatcattag tatacgctac accttctcct 60

cagacatcta aaaaaatagg tgatgatgca actctatcat gtaatcgaaa taatacaaat 120

gactacgttg ttatgagtgc ttggtataag gagcccaatt ccattattct tttagctgct 180

aaaagcgacg tcttgtattt tgataattat accaaggata aaatatctta cgactctcca 240

tacgatgatc tagttacaac tatcacaatt aaatcattga ctgctagaga tgccggtact 300

tatgtatgtg cattctttat gacatcgcct acaaatgaca ctgataaagt agattatgaa 360

gaatactcca cagagttgat tgtaaataca gatagtgaat cgactataga cataatacta 420

tctggatcta cacattcacc ggaaactagt tctgagaaac ctgattatat agataattct 480

aattgctcgt cggtattcga aatcgcgact ccggaaccaa ttactgataa tgtagaagat 540

catacagaca ccgtcacata cactagtgat agcattaata cagtaagtgc atcatctgga 600

gaatccacaa cagacgagac tccggaacca attactgata aagaagaaga tcatacagtc 660

acagacactg tctcatacac tacagtaagt acatcatctg gaattgtcac tactaaatca 720

accaccgatg atacgtacaa tgataatgat acagtaccac caactactgt aggcggtagt 780

acaacctcta ttagcaatta taaaaccaag gactttgtag aaatatttgg tattaccgca 840

ttaattatat tgtcggccgt ggcaatattc tgtattacgt attatatatg taataaacgt 900

tcacgtaaat acaaaacaga gaacaaagtc tag 933