一类Toll样受体激动剂瑞喹莫德衍生物及其制备与应用

摘要

本发明属于医药的技术领域，公开了一类Toll样受体激动剂瑞喹莫德衍生物及其制备与应用。所述Toll样受体激动剂瑞喹莫德衍生物为以下结构中一种。方法：由瑞喹莫德R848与酰氯化合物反应得到，酰氯化合物含有酸酐、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯。本发明的Toll样受体激动剂瑞喹莫德衍生物用于制备Toll样受体7/8激动剂和抗癌药物，瑞喹莫德衍生物通过键合的方式制备抗癌药物。本发明的瑞喹莫德衍生物不仅保持了原有的药物活性，并且其高活性反应基团有利于瑞喹莫德的键合及易于递送至肿瘤部位，改善了瑞喹莫德的不良药代动力学，提高了生物利用度。

说明书

技术领域

本发明属于医学材料的技术领域，具体涉及一类Toll样受体激动剂衍生物及其制备与应用。

背景技术

瑞喹莫德(Resiquimod，R848)作为小分子激动剂，可以有效激活作为先天免疫和适应性免疫强效激活因子的内体Toll样受体(endosomal toll-like receptor，TLRs)7和8。TLR7/8受体的激活在相关研究中具有诱导巨噬细胞极化为M1表型巨噬细胞，并将TAMs从促肿瘤生长的M2表型重新极化为抗肿瘤生长的M1表型，促进有效的抗肿瘤免疫应答的能力。事实上，一些小分子TLR7/8激动剂正在进行临床前研究或已经得到临床批准(如咪喹莫特)。然而该类激动剂水溶性较差致使生物利用度低，单次给药难以达到理想药效，而剂量限制和停药后的不良反应阻碍了反复全身给药，限制了在临床上的应用。

本发明针对瑞喹莫德的不理想药动学性质，提供了一种R848衍生物，该衍生物具有高活性反应基团，能够实现R848的键合，优化R848递送改善生物利用度。本发明通过引入可在生理条件下易水解的共价键进行药物结构修饰，实现改善循环，靶向特定生理条件释放的结果。同时本发明的R848衍生物并未因引入高活性反应基团而丧失了R848原有的药物活性。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一类Toll样受体激动剂瑞喹莫德衍生物及其制备方法。本发明的衍生物不仅保持了原有的药物活性，并且引入的高活性反应基团有利于R848的键合及递送，具有极化及活化巨噬细胞的功能。

本发明的另一目的在于提供上述瑞喹莫德衍生物的应用。本发明的衍生物用作TLR7/8激动剂即Toll样受体7和8激动剂。本发明的衍生物还可以用于制备抗癌药物。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一类Toll样受体激动剂瑞喹莫德衍生物，为以下结构中一种：

所述Toll样受体激动剂瑞喹莫德衍生物的制备方法，包括以下步骤：由R848与酰氯化合物反应得到；

所述酰氯化合物为

所述反应以有机溶剂为反应介质，所述有机溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃中一种以上。

所述反应在催化剂的作用下进行，所述催化剂为三乙胺。

所述R848与酰氯化合物的摩尔比为1∶(1.5～6)；

所述反应的温度为室温，反应的时间为4～48h。

反应完成后，进行纯化，所述纯化是指柱层析分离纯化。

各原料先在低温的条件下混匀，然后在室温条件下反应。

所述酰氯化合物通过以下方法制备得到：

当酰氯化合物为

CDM：

所述二氯亚砜或草酰氯与CDM的摩尔比为(5～15)∶1；

所述活化在有机溶剂中进行，有机溶剂优选为二氯甲烷(DCM)或四氢呋喃(THF)中一种以上；活化前各原料先在冰浴条件下混匀，再在室温下反应，反应的时间为4～48h。

当酰氯化合物为

酰氯化合物为化合物1时，采用丙烯酰氯与2-羟基二硫化物中一端羟基反应；酰氯化合物为化合物2时，采用甲基丙烯酰氯与2-羟基二硫化物中一端羟基反应；酰氯化合物为化合物3时，采用丙烯酰氯与三缩四乙二醇中一端羟基反应；

所述含有丙烯酸酯基的化合物与三光气的摩尔比为(2～4.5)∶1。

采用丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯与二元醇中一端羟基反应，其中所述反应在有机溶剂中进行，有机溶剂优选为二氯甲烷(DCM)或四氢呋喃(THF)中一种以上；所述反应还需加入对苯二酚和三乙胺；各原料先在冰浴条件下混匀，再在室温下反应，反应的时间为10～48h。

丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯稀释后通过滴加的方式加入，在冰浴条件下滴加10min～1h。

采用三光气活化含有丙烯酸酯基的化合物中羟基，其中，所述活化在有机溶剂中进行，有机溶剂优选为二氯甲烷(DCM)或四氢呋喃(THF)中一种以上；各原料先在冰浴条件下混合，然后室温下反应30min～1h；活化完后产物采用油泵抽干待用；活化时所采用的催化剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)。

本发明制备瑞喹莫德衍生物的反应方程式：

所述R848衍生物末端为酸酐、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯结构，为高活性反应基团，可应用于R848的键合与递送；

一种Toll样受体7和8激动剂，包括上述瑞喹莫德衍生物中一种以上。

所述瑞喹莫德衍生物用作具有极化及活化巨噬细胞功能的Toll样受体7和8激动剂。

本发明的衍生物还可以用于制备抗癌药物。

所述Toll样受体激动剂瑞喹莫德衍生物用于制备抗癌药物，所述Toll样受体激动剂瑞喹莫德衍生物通过键合的方式制备抗癌药物。

所述抗癌药物为易于将R848递送至肿瘤部位的抗癌药物。

抗癌药物为具有极化及活化巨噬细胞功能的抗癌药物。

一种抗癌药物，包括上述瑞喹莫德衍生物中一种以上。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

本发明的R848衍生物不仅保持了原有的药物活性，并且其高活性反应基团有利于R848的键合及递送，改善了小分子R848的不良药代动力学，在生物医药等领域具有巨大的应用潜能。

附图说明

图1为HSEA的核磁氢谱图；

图2为HSEMA的核磁氢谱图；

图3为TEGA的核磁氢谱图；

图4为R848-HSEA的核磁氢谱图；

图5为R848-HSEMA的核磁氢谱图；

图6为R848-TEGA的核磁氢谱图；

图7为R848-CDM的核磁氢谱图；

图8为R848-HSEA的核磁碳谱图；

图9为R848-HSEMA的核磁碳谱图；

图10为R848-TEGA的核磁碳谱图；

图11为R848-CDM的核磁碳谱图；

图12为细胞水平验证R848衍生物重极化BMDMs的结果图；(a)通过流式细胞术检测各组表达CD86

图13为细胞水平验证R848衍生物活化BMDMs的结果图；(a)～(c)分别为流式检测BMDCs共刺激分子CD86，CD80和MHC-II的表达(n＝3)；

图14为细胞水平验证R848衍生物活化BMDCs的结果图；(a)为流式检测BMDMs共刺激分子CD86的表达；(b)为流式检测BMDMs共刺激分子CD80的表达(n＝3)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：R848-HSEA的制备

R848-HSEA是由R848氨基与三光气活化的HSEA反应制备。

HSEA的制备：

称取0.065mmol对苯二酚、20mmol三乙胺、13mmol 2-羟乙基二硫化物于反应容器中，加入200mL无水THF，在冰水浴中搅拌；用玻璃针抽取100mL的无水THF于恒压滴液漏斗中，称取13mmol丙烯酰氯，加入到恒压滴液漏斗中；在冰水浴中，缓慢滴加丙烯酰氯，大约滴加1h，滴加完毕后转移至室温下反应；反应24h后停止反应，过滤除去生成的盐，将溶剂旋干，加入二氯甲烷，使用饱和食盐水洗三次，再用纯水洗一遍，有机相用无水硫酸镁干燥后，浓缩，使用硅胶柱纯化(展开剂为正己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)，产率为42％，HSEA的核磁氢谱图结果如图1所示。

HSEA的结构：

R848-HSEA的制备：

取190.8μmol HSEA于反应容器中，再称取76.3μmol三光气溶于0.5mL无水二氯甲烷中，在冰浴条件下将三光气的溶液加入反应容器中，容器内始终保持氮气氛围；再加入318μmol 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，移至室温下活化40min；使用油泵抽干，约30min，除去未反应的三光气；取63.6μmol R848溶于无水四氢呋喃中，在冰浴条件下将R848的溶液加入反应容器中，再加入100μL三乙胺，冰浴下搅拌10min，再转至室温下搅拌反应24h，呈淡黄色溶液；反应结束后，将溶剂抽干，分散在二氯甲烷中，使用正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1进行柱层析分离纯化，产率为40％。R848-HSEA的核磁结果如图4(氢谱图，CDCl

实施例2：R848-HSEMA的制备：

R848-HSEA是由R848氨基与三光气活化的HSMEA反应制备。

HSEMA的制备：

称取0.065mmol对苯二酚、20mmol三乙胺、13mmol 2-羟乙基二硫化物于反应容器中，加入200mL无水THF，在冰水浴中搅拌；用玻璃针抽取100mL的无水THF于恒压滴液漏斗中，称取13mmol甲基丙烯酰氯，加入到恒压滴液漏斗中；在冰水浴中，缓慢滴加甲基丙烯酰氯，大约滴加1h，滴加完毕后转移至室温下反应；反应24h后停止反应，过滤除去生成的盐，将溶剂旋干，加入二氯甲烷，使用饱和食盐水洗三次，再用纯水洗一遍，有机相用无水硫酸镁干燥后，浓缩，使用硅胶柱纯化(展开剂为正己烷∶乙酸乙酯＝3∶1)，产率为40％，HSEMA的核磁氢谱图结果如图2所示。

HSEMA的结构为

R848-HSEMA的制备：

取190.8μmol HSEMA于反应容器中，再称取76.3μmol三光气溶于0.5mL无水二氯甲烷中，在冰浴条件下将三光气的溶液加入反应容器中，反应容器内始终保持氮气氛围；再加入318μmol DMAP，移至室温下活化40min；使用油泵抽干，约30min，除去未反应的三光气；取63.6μmol R848溶于无水四氢呋喃中，在冰浴条件下将R848的溶液加至反应容器内，再加入100μL三乙胺，冰浴下搅拌10min，再转至室温下搅拌反应24h，呈淡黄色溶液；反应结束后，将溶剂抽干，分散在二氯甲烷中，使用正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1进行柱层析分离纯化，产率为40％。R848-HSEMA的核磁结果如图5(氢谱图，CDCl

实施例3：R848-TEGA的制备

R848-TEGA是由R848氨基与三光气活化的TEGA反应制备。

TEGA的制备：

称取0.065mmol对苯二酚、20mmol三乙胺、13mmol三缩四乙二醇于反应容器中，加入200mL无水THF，在冰水浴中搅拌；用玻璃针抽取100mL的无水THF于恒压滴液漏斗中，称取13mmol丙烯酰氯，加入到恒压滴液漏斗中；在冰水浴中，缓慢滴加丙烯酰氯，大约滴加1h，滴加完毕后转移至室温下反应；反应24h后停止反应，过滤除去生成的盐，将溶剂旋干，加入二氯甲烷，使用饱和食盐水洗三次，再用纯水洗一遍，有机相用无水硫酸镁干燥后，浓缩，使用硅胶柱纯化(展开剂为正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)，产率为38％，TEGA的核磁氢谱图结果如图3所示。

TEGA的结构为

R848-TEGA的制备：

取190.8μmol TEGA于反应容器中，再称取95.4μmol三光气溶于0.5mL无水二氯甲烷中，在冰浴条件下将三光气的溶液加入至反应容器内，反应容器内始终保持氮气氛围；再加入318μmol DMAP，移至室温下活化40min；使用油泵抽干，约30min，除去未反应的三光气；取63.6μmol R848溶于无水四氢呋喃中，在冰浴条件下将R848的溶液加至反应容器内，再加入100μL三乙胺，冰浴下搅拌10min，再转至室温下搅拌反应24h，呈淡黄色溶液；反应结束后，抽干溶剂，DCM溶解后分别用饱和NaCl溶液、纯水各洗涤一遍，使用1％甲醇体系进行柱层析分离纯化，产率为61％。R848-TEGA的核磁结果如图6(氢谱图，CDCl

实施例4：R848-CDM的制备

R848-CDM是由R848氨基与二氯亚砜或草酰氯活化的CDM反应制备。

R848-CDM的制备：

称取127μmol 3-(4-甲基-2，5-二氧代-2，5-二氢呋喃-3-基)丙酸(CDM)放入已除水除氧的反应容器中，真空抽除3h后加入2.0mL无水二氯甲烷溶解后置于冰水浴条件下搅拌，称取1.27mmol二氯亚砜溶于无水四氢呋喃中后转移至支口烧瓶中，量取三乙胺100μL溶于无水四氢呋喃中后逐滴加入至支口烧瓶中；滴加完成后于室温条件下反应过夜，反应结束后，真空抽除溶剂，获得酰氯化合物；称取63.6μmol R848溶于1.0mL无水四氢呋喃，转移至反应中；量取DMF 100μL溶于无水四氢呋喃中后逐滴加入至支口烧瓶中，冲氮气条件下在冰水浴中反应10分钟后转至室温反应24h；反应结束后，抽干溶剂，二氯甲烷溶解后，使用1％甲醇-5％甲醇体系进行柱层析分离纯化，产率为60％；R848-CDM的核磁结果如图7(氢谱图，CDCl

酰氯化合物为

实施例5：细胞水平验证R848衍生物重极化BMDM

脱颈处死Balb/c小鼠，浸泡在75％乙醇中消毒。在无菌生物安全柜中用无菌手术器械剪开腿部皮肤与肌肉，分离股骨与胫骨，放入含有5mL DMEM完全培养基的培养皿中；剪开股骨与胫骨的两端，暴露骨髓腔，用1mL无菌注射器吸取培养基冲洗骨髓腔，将细胞悬液冲入细胞培养皿中；用移液器吸取细胞悬液经200目滤网滤至15mL离心管内，4℃，450g离心5min；弃上清，加入2mL红细胞裂解液重悬细胞，在4℃条件下裂解6min，加入PBS终止，450g离心5min；弃上清，加入1mLDMEM培养基重悬骨髓细胞，计数，调整细胞浓度为1×10

结论：细胞因子刺激后，M1组(由LPS与INF-γ极化)高度表达CD86，低表达CD206，与此相反的是M2组(由IL-4极化)CD86表达较低一些，但高表达CD206。将IL-4刺激的细胞与R848衍生物孵育24h后，R848衍生物能够显著提高CD86的表达(图12中(a)图)，并显著降低CD206的表达(图12中(b)图)。可以发现R848的衍生物能够有效的将促肿瘤生长的M2巨噬细胞极化成抗肿瘤生长的M1巨噬细胞。此外，R848衍生物的效果与游离R848效果相当。综上结果表明，R848经过修饰后依旧能够有效地在体外将M2型巨噬细胞重极化为M1型。

实施例6：细胞水平验证R848衍生物活化BMDMs

脱颈处死Balb/c小鼠，浸泡在75％乙醇中消毒。在无菌生物安全柜中用无菌手术器械剪开腿部皮肤与肌肉，分离股骨与胫骨，放入含有5mL DMEM完全培养基的培养皿中；剪开股骨与胫骨的两端，暴露骨髓腔，用1mL无菌注射器吸取培养基冲洗骨髓腔，将细胞悬液冲入细胞培养皿中；用移液器吸取细胞悬液经200目滤网滤至15mL离心管内，4℃，450g离心5min；弃上清，加入2mL红细胞裂解液重悬细胞，在4℃条件下裂解6min，加入PBS终止，450g离心5min；弃上清，加入1mL DMEM培养基重悬骨髓细胞，计数，调整细胞浓度为1×10

从图13中可知：R848及R848衍生物均可以增强BMDCs激活标记如CD86、CD80和主要组织相容性复合物II类(MHC-II)的表达，证明了R848经过修饰后依旧能够有效地在体外活化BMDCs。

实施例7：细胞水平验证R848衍生物活化BMDCs

脱颈处死Balb/c小鼠，浸泡在75％乙醇中消毒，在无菌生物安全柜中用无菌手术器械剪开腿部皮肤与肌肉，分离股骨与胫骨，放入含有5mL完全培养基的培养皿中；剪开股骨与胫骨的两端，暴露骨髓腔，用1mL无菌注射器吸取培养基冲洗骨髓腔，将细胞悬液冲入细胞培养皿中；用移液器吸取细胞悬液经200目滤网滤至15mL离心管内。4℃，450g离心5min；弃上清，加入2mL红细胞裂解液重悬细胞，在4℃条件下裂解6min，加入PBS终止，450g离心5min；弃上清，加入1mLRPMI1640培养基重悬骨髓细胞，计数，调整细胞浓度为1×10

从图14中可知：R848及R848衍生物孵育后增加了BMDMs活化标记CD80的表达，但是除了R848-HSEA外，CD86的表达并无差异。