一种MYB基因上游34kb区域转录的lncRNA、表达载体及其应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了一种MYB基因上游34kb区域转录的lncRNA，其cDNA核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列。该lncRNA能够调控MYB基因的表达及白血病细胞的增殖。过表达会促进MYB基因表达及白血病细胞的增殖；通过抑制该lncRNA的表达，能够降低MYB基因表达及抑制白血病细胞的增殖。因此，这种MYB上游34kb区域转录的lncRNA可以为分子标志物或靶点应用于肿瘤尤其是白血病的检测治疗和药物开发，具有深远的临床意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种原癌基因MYB基因上游lncRNA及其应用。

背景技术

白血病是一种起源于造血干细胞的恶性增殖疾病，其特征是骨髓异常分化的造血细胞克隆性扩张，白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。

目前白血病的临床治疗方法主要以联合化疗和干细胞移植为主，尽管在一定程度能够缓解发病进程，但是总的来说，白血病患者的总生存率仍然较低，且白血病易复发，这也增加了治疗难度。因此，寻找早期而敏感的治疗靶点，并探索有效的治疗方法对有效控制白血病具有重要的意义。

原癌基因MYB是一种重要的转录因子，在造血细胞的增殖和分化中发挥重要作用。研究表明，在人的白血病癌细胞中MYB的表达显著升高。MYB能够直接调控多种与肿瘤转移相关的基因表达水平，对癌细胞侵袭、增殖均产生影响，参与白血病的发生、发展以及转移等过程。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是指长度大于200nt，没有编码能力的非编码RNA，lncRNA可以通过顺式(in cis)或反式(in trans)作用的方式调节RNA代谢、蛋白质功能活性、组蛋白修饰及染色质重塑等。近年来，长链非编码RNA越来越受到学者们的关注，已被证实，lncRNA参与多种肿瘤的发生发展过程，但lncRNA在白血病中的研究仍处于起步阶段。

已有研究发现，MYB的转录受其上游区域的非编码区调控，MYB启动子可以与MYB上游远端区域DNA序列形成DNA-loop，并募集转录因子Hoxa9、PU.1和结构蛋白等远端调控MYB的表达。而MYB上游区域转录生成的lncRNA对MYB基因的作用以及对白血病细胞增殖的影响研究目前尚不明确。

发明内容

针对目前白血病检测和治疗的缺陷和不足，本发明提供了一种lncRNA MYB-34KS，由MYB基因上游间区转录生成，对MYB的表达具有调控作用，并调控白血病细胞的增殖，可作为白血病检测的标志物和治疗的靶点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种MYB上游34kb区域转录的lncRNA，简称为MYB-34KS，位于人第六号染色体的MYB基因正义链上，其cDNA核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的序列。

优选的，lncRNA MYB-34KS的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID No.1:acacactttataattccatattgttccctcatgctagttcctctttgggaaatgttctgagtttctctcccatatgcttctactagtgccaacccagtatctcctcctctgtgaagtccttcatttgtgatcctttctcattcgtctgtgatccctgatacacactgttagcataggactgaccacaatatatcaacattcattataaacaacaactccctgactactggtctcctcaagtacaagaatctctgttactatttatctctgtatcaccaatatttagcactgatgataatgaatgagtaagtatacaagacagtcataacgtgatatagaaaagtctcaataaattcccatgacattgaagggaaagtgactattttttctgagtcaggcgtcaattgggttaacagtggttgaaagtggagcaaaaaagtagggtagcaataaagttaagaacacaagcagaatccttgcgtaagaacaaattcagaaagcagtacataccttccaaatacagataggtaaaatagaaaaagaagaagagaggaaggagaaggaggagaagatgaaggagaagaaaagggagaagaagatgaagacaacatgaggaaaactgtgaaggaaacagagacatgaggagagtatttgtatttacattctgtagctaaaaccattttcaaatgaagtcgtattgttcttacaattaaggaaagtcaatttcaggaattgtttataaaccaattcctctacattacagagataagaggttcaaattgccaaatgtatgttatggaaggaaaaacaaaaacaa

可通过RACE技术获取lncRNA MYB-34KS cDNA全长序列，步骤包括：

(1)以总RNA为模板，合成RACE第一链cDNA；

(2)以RACE第一链cDNA为模板，进行第一轮RACE-PCR；所采用的引物为通用引物UPM和5′-末端或3′-末端基因特异性引物；

第一轮RACE-PCR的5′-末端基因特异性引物序列为5′RACE-MYB-34KS-GSP：5′-accactgttaacccaattgacgcctgact-3′；

第一轮RACE-PCR的3′-末端基因特异性引物序列为3′RACE-MYB-34KS-GSP：5′-ccctgatacacactgttagcataggactg-3′；

(3)以第一轮RACE-PCR产物为模板，进行第二轮RACE-PCR；所采用的引物为通用引物UPM和5′-末端或3′-末端基因特异性引物；

第二轮RACE-PCR的5′-末端基因特异性引物序列为5′RACE-MYB-34KS-NGSP：5′-ggagatactgggttggcactagtagaag-3′；

第二轮RACE-PCR的3′-末端基因特异性引物序列为3′RACE-MYB-34KS-NGSP：5′-ctgagtttctctcccatatgcttctacta-3′。

经测序鉴定，该序列位于人6号染色体，且位于MYB基因正义链的上游34kb区域。

步骤(1)中，总RNA取自K562细胞。

本发明的另一个技术方案为，用于扩增lncRNA MYB-34KS或者其cDNA序列的引物，其上游和下游序列分别包括如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。

MYB-34KS-F：5′-acacactttataattccatattgttccctcatg-3′(SEQ ID NO.2)

MYB-34KS-R：5′-ttgtttttgtttttccttccataacatacatttg-3′(SEQ ID NO.3)

优选的，用于扩增lncRNA MYB-34KS或者其cDNA序列的引物，其上游和下游序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

一种检测MYB上游34kb区域转录的lncRNA的表达丰度或者其cDNA的试剂盒，含有上述用于扩增的引物。

一种重组载体，含有上述lncRNA MYB-34k的cDNA序列。优选的，所述的重组载体为过表达重组载体或敲降重组载体。

构建过表达重组载体时，选用的载体为pLVX-IRES-Neo质粒。

优选的，过表达重组载体为pLVX-MYB-34KS，过表达重组载体的构建方法为：RACE技术扩增出lncRNA MYB-34KS的cDNA全长序列后，连接到T载体上，经过测序验证后，进行酶切位点PCR反应将lncRNA MYB-34KS的cDNA全长序列从T载体上转移到过表达载体pLVX-IRES-Neo上。

用于构建lncRNA MYB-34KS过表达载体质粒的引物，其序列如下：

MYB-34KS-EcoRI-F：5′-ggaattcacacactttataattccatattgttccctcatg-3′

MYB-34KS-XbaI-R：5′-gctctagattgtttttgtttttccttccataacatacatttg-3′

优选的，构建敲降重组载体时，选用的载体为pLKO.1-TRC cloning质粒。敲降重组载体为sh-MYB-34KS，构建方法为：RACE技术扩增出lncRNA MYB-34KS的cDNA全长序列后，连接到T载体上，经过测序验证后，进行酶切位点PCR反应将lncRNA MYB-34KS的cDNA全长序列从T载体上转移到敲降载体pLKO.1-TRC cloning上。

用于构建敲降重组载体的shRNA引物序列如下所示：

MYB-34KS-shRNA-F：

5′-ccggcataggactgaccacaatatactcgagtatattgtggtcagtcctatgtttttg-3′

MYB-34KS-shRNA-R：

5′-aattcaaaaacataggactgaccacaatatactcgagtatattgtggtcagtcctatg-3′

一种转染载体，含有上述重组载体。转染载体包括病毒或重组菌。病毒优选为慢病毒。

经过慢病毒转染白血病细胞过表达质粒或敲降质粒，提取细胞中的蛋白质，检测MYB蛋白的表达量，或者检测白血病细胞的增殖；结果显示lncRNA MYB-34KS的过表达会促进MYB基因表达、促进白血病细胞的增殖，而敲降则MYB的表达降低，白血病细胞的增殖被抑制。尤其是对白血病细胞中的MYB基因有特异性的调节作用。

因此，MYB上游34kb区域转录的lncRNA或者其cDNA可以作为肿瘤的分子标志物或者药物靶点，用于制备或筛选治疗肿瘤的药物，或者用于制备检测肿瘤的诊断试剂。

上述治疗肿瘤的药物通过调控lncRNA MYB-34KS的表达，抑制原癌基因MYB来发挥其作用。

扩增上述lncRNA或者其cDNA序列的引物也可以用于制备或筛选治疗肿瘤的药物，或者用于制备检测肿瘤的诊断试剂。

检测MYB上游34kb区域转录的lncRNA或者其cDNA的试剂盒可以用于制备或筛选治疗肿瘤的药物，或者用于制备检测肿瘤的诊断试剂。

含有上述lncRNA MYB-34KS的cDNA序列的重组载体或者转染载体也可以用于制备或筛选治疗肿瘤的药物，或者用于制备检测肿瘤的诊断试剂。

上述所述肿瘤为白血病。

本发明在MYB上游34kb区域发现了转录生成的lncRNA MYB-34KS，这种lncRNA对MYB基因的作用以及对白血病细胞增殖有影响。通过RACE技术克隆得到上述lncRNA MYB-34KS全长序列，并构建过表达和敲降载体。结果发现，lncRNA MYB-34KS的过表达可促进白血病细胞系K562中MYB基因的转录和蛋白合成，而抑制lncRNA MYB-34KS的表达后，MYB的表达也相应降低。此外，本发明中提升lncRNA MYB-34KS的表达水平后，能促进白血病细胞的生长，敲降lncRNA MYB-34KS后显著抑制了白血病细胞的增殖、迁移和侵袭。这些结果表明，降低lncRNA MYB-34KS的表达水平具有抑制白血病的效果。因此lncRNA MYB-34KS可作为分子标志物或靶点应用于肿瘤尤其是白血病的检测治疗和药物开发，具有深远的临床意义。

附图说明

图1是lncRNA MYB-34KS RACE克隆图；

图2是lncRNA MYB-34KS在人6号染色体上的位置示意图；

图3是lncRNA MYB-34KS在白血病细胞系中的表达水平图；

图4是Western-blot分析lncRNA MYB-34KS过表达/敲降对MYB基因表达的影响；

图5是lncRNA MYB-34KS过表达/敲降对白血病细胞系增殖的影响。

具体实施方式

以下实施例进一步清楚、完整地描述本发明的内容，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，不应理解为对本发明的限制。在没有做出创造性劳动的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1克隆lncRNA MYB-34KS全长序列

用RACE技术获取lncRNA MYB-34KS cDNA全长序列，通过RACE扩增出未知序列的两端，再经过下一步扩增、测序验证具体序列。

方法如下：

(1)总RNA提取

使用Trizol法提取K562细胞总RNA。

(2)RACE第一链cDNA合成

该步骤主要由Takara公司提供的

生成的3’-RACE-Ready cDNA和5’-RACE-Ready cDNA加一倍的灭菌H

(3)RACE-PCR反应

RACE-PCR第一轮反应，利用通用引物UPM分别和5′-末端或3′-末端基因特异性引物(gene-specific primer，GSP)进行PCR扩增。

lncRNA MYB-34KS的PCR引物序列：

5′RACE-MYB-34KS-GSP：5′-accactgttaacccaattgacgcctgact-3′；

3′RACE-MYB-34KS-GSP：5′-ccctgatacacactgttagcataggactg-3′；

反应体系：15.5μL PCR-Grade H

RACE-PCR第一轮反应程序：94℃ 30s，72℃ 2min，5个循环；94℃ 30s，72℃ 30s，72℃ 2min，5个循环；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 2min，30个循环。

第二轮反应，以第一轮的PCR产物稀释50倍为模板，Universal Primer short(UPMshort)为通用引物进行扩增。

所用引物的核苷酸序列如下：

5′RACE-MYB-34KS-NGSP：5′-ggagatactgggttggcactagtagaag-3′；

3′RACE-MYB-34KS-NGSP：5′-ctgagtttctctcccatatgcttctacta-3′；

反应体系：15.5μL PCR-Grade H

反应程序：94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min，40个循环。

1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果如图1所示。

(4)目的片段凝胶回收及纯化

用刀片小心切下含有目的片段的凝胶，用QIAGEN公司的凝胶回收试剂盒QIAquickGel Extraction Kit进行目的片段的回收。用Nanodrop 2000测定目的片段的浓度和纯度，并储存于-20℃备用。

(5)目的片段与载体连接

使用全式金公司的pEASY-Blunt Zero Cloning Kit试剂盒进行T载体连接。

克隆反应体系：

反应条件：25℃，15min。

(6)转化和鉴定

将步骤(5)连接产物转入Trans1-T1感受态细胞，筛选并用LB培养后，挑取单克隆进行菌液PCR验证，挑选阳性菌液进行测序。最终得到了lncRNA的5’端和3’端片段信息。具体步骤如下：

Trans1-T1感受态细胞冰上解冻，将连接产物加入到50μL的感受态细胞中，冰浴30min。

42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min。

加250μL LB液体培养基，200rpm、37℃培养1h。

1500g离心1min，弃掉部分上清，保留100μL，滴加到含抗生素的LB固体培养基上，用涂布器涂抹均匀。

37℃恒温培养箱，培养过夜12-14h。

过夜培养的固体LB培养基从37℃恒温培养箱中取出，挑取单克隆进行菌液PCR验证。

菌液PCR，反应体系：菌液1μL，2×Taq plus Master Mix 10μL，M13F 0.5μL，M13R0.5μL，ddH

反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，30个循环；72℃ 10min。

经菌液PCR检测后挑选阳性菌液进行克隆和测序。

(7)lncRNA克隆

RACE得到lncRNA的5’端和3’端片段信息后，在两端设计引物对拼接好的lncRNA全长cDNA序列进行了PCR扩增，并测序验证。克隆测序获得lncRNA MYB-34KS的全长cDNA序列，该序列在人6号染色体上的位置示意图见图2，位置在MYB基因正义链上游34k区域。具体cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，长度为817个核苷酸。

所用引物的核苷酸序列如下：

MYB-34KS-F：5′-acacactttataattccatattgttccctcatg-3′(SEQ ID NO.2)

MYB-34KS-R：5′-ttgtttttgtttttccttccataacatacatttg-3′(SEQ ID NO.3)

PCR反应程序为：95℃，30s预变性。95℃，5s变性；60℃，30s扩增，共35个循环。PCR扩增结束后，目的片段纯化、与T载连接、转化和鉴定参照上述(4)、(5)、(6)步骤的相应方法进行。

(8)质粒提取

转化后的菌株接种到含抗生素的LB培养液中培养后，使用OMEGA公司的EZNAEndo-free Plasmid DNA Mini kit试剂盒进行T载质粒提取。

实施例2 lncRNA MYB-34KS在白血病细胞系中的表达水平检测

(1)细胞培养

人红白血病K562细胞、人急性髓系白血病U937细胞、人早幼粒急性白血病HL60细胞、Hela细胞以及293T细胞均购买自ATCC(American Type Culture Collection)。K562、U937、HL60细胞用RPMI 1640basic(Gibco,#C11875500BT)培养基培养，添加终浓度10％的胎牛血清(Gibco,#10099-141C)和终浓度1％的链霉素和青霉素(HyClone,#SV30010)。Hela和293T细胞用DMEM(Gibco,#C11965500BT)培养基加10％胎牛血清和1％链霉素和青霉素进行培养。接种好的细胞置于温度为37℃、CO

(2)总RNA提取

用Trizol法提取各细胞总RNA。

细胞培养于10cm细胞培养皿中，K562、U937、HL60细胞为悬浮细胞，长满后，取对数生长期的细胞，离心、加入trizol试剂裂解，提取总RNA。Hela和293T细胞为贴壁细胞，长满后，倒掉培养基，加入trizol试剂裂解，提取总RNA。

提取的总RNA加入RNase-free H

(3)逆转录反应

使用Takara公司的反转录试剂盒PrimeScript

去除基因组DNA反应：按下表于冰上配制反应混合液，将装有反应液的PCR管放置于PCR仪中，42℃、2min，然后4℃保存；

反转录反应：将下表中的成分按照相应的使用量加到PCR管中配制反应液，于冰上进行实验操作，反应体系配好后混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

cDNA合成反应条件：37℃、15min，85℃、5s，4℃保存。

(4)RT-qPCR反应

实时荧光定量PCR使用iTaq Universal SYBR Green supermix试剂在Bio-RadCFX96平台上进行。反应体系如下所示：

lncRNA特异性引物序列为：

上游lncRNA MYB-34KS-F：5′-acacactttataattccatattgttccctcatg-3′(SEQ IDNo.2)

下游lncRNA MYB-34KS-R：5′-ttgtttttgtttttccttccataacatacatttg-3′(SEQ IDNo.3)

PCR反应程序为：95℃，30s预变性。95℃，5s变性；60℃，30s扩增，共35个循环。采用2

结果如图3所示，说明lncRNA MYB-34KS在白血病相关细胞中有特异性的表达。

实施例3 lncRNA MYB-34KS过表达和敲降载体构建

本实施例3中，使用从实施例1中所获得的lncRNA MYB-34KS全长序列，构建过表达和敲降载体。将实施例1中T载体质粒稀释至1ng/μL，以此为模板进行亚克隆PCR。

1、pLVX-MYB-34KS过表达载体的构建

(1)使用pLVX-IRES-Neo质粒构建pLVX-MYB-34KS过表达载体。首先根据pLVX-IRES-Neo质粒和MYB-34KS的序列选取两个限制性内切酶位点，分别为EcoRI和XbaI。然后设计加酶切位点的亚克隆引物，序列如下：

MYB-34KS-EcoRI-F:5′-ggaattcacacactttataattccatattgttccctcatg-3′

MYB-34KS-XbaI-R:5′-gctctagattgtttttgtttttccttccataacatacatttg-3′

(2)加酶切位点PCR

反应体系：

反应条件：98℃变性10s，55℃ 5s、72℃ 1min，循环30次。

待反应完毕后，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物并回收。

(3)目的片段与pLVX-IRES-Neo质粒双酶切

双酶切体系(50μL)：

反应条件为37℃、4h，65℃、20min。双酶切完成以后将双酶切产物切胶回收。

(4)连接

连接体系(20μL)：

反应条件为16℃、20h，65℃、10min。

连接完成后，转化、鉴定、质粒提取参照实施例1的相应方法进行，最终得到pLVX-MYB-34KS质粒。

2、sh-MYB-34KS敲降质粒的构建

(1)使用pLKO.1-TRC cloning质粒构建sh-MYB-34KS敲降载体。分别以EcoRI和AgeI为限制性内切酶位点。

(2)特异性shRNA设计，构建载体的shRNA序列如下所示：

MYB-34KS-shRNA-F：

5′-ccggcataggactgaccacaatatactcgagtatattgtggtcagtcctatgtttttg-3′

MYB-34KS-shRNA-R：

5′-aattcaaaaacataggactgaccacaatatactcgagtatattgtggtcagtcctatg-3′

(3)引物退火

如下配置退火体系(50μL)：

95℃、5min，随后70℃、10min，让其温度缓慢降至室温。

(4)pLKO.1-TRC cloning vector双酶切

双酶切反应体系：

设置酶切条件为：37℃、4h；65℃、20min。双酶切完成以后将双酶切产物切胶回收。

(5)连接

连接体系(20μL)：

反应条件为16℃、20h，65℃、10min。

连接完成后，转化、鉴定、质粒提取参照实施例1的相应方法进行，最终得到sh-MYB-34KS质粒。

实施例4 lncRNA MYB-34KS过表达/敲降对MYB表达的影响

(1)慢病毒包装

293T细胞种植培养传2-3代后，待细胞汇合度达70-80％时，转染质粒。

使用病毒包装质粒(pCMV-dR8.91)、包膜蛋白质粒(pCMV-VSVG)和pLVX-MYB-34KS或sh-MYB-34KS共18.9μg进行转染，质粒比例为pCMV-dR8.91：pCMV-VSVG：pLVX-MYB-34KS/sh-MYB-34KS＝10：1：10。

将上述质粒加入到720μL无血清无双抗的DMEM培养基中，并加入40μL转染试剂Turbofect Transfection Reagent，涡旋混匀后，短暂离心，室温孵育15-20min。

将孵育好的混合物轻轻滴加到293T细胞中。轻轻混匀后置于37℃、5％CO

转染48h和72h后，分别收集细胞培养液，1500g离心10min去除细胞碎片，将得到的病毒上清分装存于-80℃或4℃临时保存。

(2)慢病毒感染K562细胞

将K562细胞接种于6cm细胞培养皿中，当细胞汇合度达到70-80％后用病毒上清进行感染，加入终浓度8μg/mL的Polybrene来增强病毒的感染效率。混匀后37℃、5％CO

(3)蛋白质提取

K562细胞800rpm离心5min，弃上清。加入2ml DPBS洗2次细胞，并弃掉DPBS，加入200μL细胞裂解液(RIPA：50xPI：100Mm PMSF＝97:2:1)，冰上裂解20-30min后超声,超声条件为超声5s，间隔10s后再次超声5s，重复进行4次。超声完成后，4℃ 12000g，离心10min，取最上层上清2μL用于测浓度，剩余上清转移至新的1.5mL离心管中。

(4)蛋白浓度测定(Bradford法测蛋白浓度)

使用1×PBS稀释BSA蛋白标准液(5mg/mL)至200μg/mL，按下表配制一定浓度梯度的标准蛋白。

将蛋白样品用1*PBS 40倍稀释。在96孔板上分别加入上表中1-8号管中各浓度的蛋白质溶液和样品稀释液各20μL，每个样3个重复。再在各孔中加入200μL的Bradford试剂，迅速震荡均匀。室温静置5min。以1号管为空白对照，在酶标仪上测各孔的A595吸光值，再根据标准曲线计算稀释浓度。

(5)Western blot实验

配制SDS-PAGE凝胶：配制8％分离胶和5％浓缩胶

SDS-PAGE电泳条件：上样前将蛋白样品加封口膜，沸水煮5min，12000g离心1min，每个泳道加30μg蛋白。电泳条件：第一阶段80V，30min；第二阶段150V，40min。

转膜：用活化后的NC膜，100V转膜1h。转膜结束后用1×丽春红染液染5min。

封闭：将NC膜用5％脱脂牛奶在摇床上封闭2h。

免疫反应：5％的脱脂牛奶稀释抗体，MYB一抗(1:2000)，β-actin抗体(1:4000)，将抗体与NC膜在摇床上4℃孵育过夜。TBST漂洗滤膜3次，每次10min。将带有辣根过氧化酶的二抗，用5％脱脂牛奶稀释(1:2000)，将二抗加到NC膜上后，室温孵育1～2h。孵育结束后，TBST清洗3次，每次10min。化学显影：按Peroside solution:Luminol/enhancer＝1:1在棕色管中配制显影液，将NC膜正面向上，均匀滴加显影液后孵育5min，曝光拍照进行检测。

结果如图4所示。图4A为转染过表达质粒pLVX-MYB-34KS及空白pLVX质粒(vector)的结果；图4B为转染敲降质粒sh-MYB-34KS及空白sh质粒(sh NC)的结果。

实施例5 lncRNA MYB-34KS过表达/敲降对白血病细胞系K562增殖和迁移的影响

(1)细胞培养和转染

K562细胞分别转染pLVX-MYB-34KS和sh-MYB-34KS质粒。参照实施例4的方法进行K562细胞培养与转染。

(2)CCK-8实验

转染的K562细胞计数后，向96孔板中每孔加入100μL细胞悬液(2000个细胞)。分别在转染0、24、48、72、96h后，每孔加入CCK-8 10μL，不含细胞的孔作为空白对照。继续孵育2h。酶标仪测定450nm处的吸光度。

结果如图5所示，图5A为转染过表达质粒pLVX-MYB-34KS及空白pLVX质粒(vector)的结果；图5B为转染敲降质粒sh-MYB-34KS及空白sh质粒(sh NC)的结果。

实施例4、5的结果显示，lncRNA MYB-34KS的过表达会促进MYB基因表达，促进白血病细胞系K562的增殖；而敲降则降低MYB的表达，抑制白血病细胞系K562的增殖。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 一种MYB基因上游34kb区域转录的lncRNA、表达载体及其应用

<130> W-21-1-02450

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 817

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acacacttta taattccata ttgttccctc atgctagttc ctctttggga aatgttctga 60

gtttctctcc catatgcttc tactagtgcc aacccagtat ctcctcctct gtgaagtcct 120

tcatttgtga tcctttctca ttcgtctgtg atccctgata cacactgtta gcataggact 180

gaccacaata tatcaacatt cattataaac aacaactccc tgactactgg tctcctcaag 240

tacaagaatc tctgttacta tttatctctg tatcaccaat atttagcact gatgataatg 300

aatgagtaag tatacaagac agtcataacg tgatatagaa aagtctcaat aaattcccat 360

gacattgaag ggaaagtgac tattttttct gagtcaggcg tcaattgggt taacagtggt 420

tgaaagtgga gcaaaaaagt agggtagcaa taaagttaag aacacaagca gaatccttgc 480

gtaagaacaa attcagaaag cagtacatac cttccaaata cagataggta aaatagaaaa 540

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gaagacaaca tgaggaaaac tgtgaaggaa acagagacat gaggagagta tttgtattta 660

cattctgtag ctaaaaccat tttcaaatga agtcgtattg ttcttacaat taaggaaagt 720

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<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acacacttta taattccata ttgttccctc atg 33

<210> 3

<211> 34

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<400> 3

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