RNF31在调控YAP的泛素化水平中的应用

摘要

本发明属于生物技术领域，尤其涉及RNF31在调控YAP的泛素化水平中的应用。本发明通过在HEK293T细胞系转染RNF31质粒从而引起RNF31蛋白表达增高，同时转染YAP与泛素质粒，通过免疫共沉淀方式进行泛素化实验，利用western blot检测RNF31的蛋白表达水平和YAP蛋白的泛素化水平。本发明首次发现了RNF31蛋白表达与YAP蛋白的泛素化水平相关，通过检测受试细胞系中RNF31的表达，可以判断受试细胞YAP蛋白的泛素化水平的强弱。同时，通过在受试细胞中转染RNF31质粒，可以调控RNF31蛋白的表达量，从而调控YAP蛋白的泛素化水平。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及RNF31在调控YAP的泛素化水平中的应用。

背景技术

YAP是蛋白编码基因，是Hippo信号通路核心效应因子。人类YAP基因定位于11q22.1区域，相对分子质量为65KD。Hippo信号通路是重要的肿瘤信号通路之一，YAP是其主要的下游效应因子。Hippo信号通路对于发育和组织动态平衡有重要调控功能。在器官中，YAP/TAZ对于促进损伤后的组织修复至关重要。此外，YAP/TAZ的激活在许多人类肿瘤中普遍存在，已证实YAP/TAZ对癌症的发生、进展或转移起重要作用。正常器官功能的YAP/TAZ失活的偶然性与他们在同一器官中对癌症发展的绝对需求之间的鲜明矛盾是很有吸引力的，也凸显了以YAP/TAZ作为治疗靶标的可能性。此外，YAP/TAZ在肿瘤的癌症干细胞组分中具有活性，并且在功能上也是癌症干细胞扩展所必需的。YAP/TAZ实际上是将非干细胞重新编程成具有完全癌症干细胞属性的细胞。这表明YAP/TAZ可能在分子上定义癌症干细胞群体，而控制YAP/TAZ的输入可能与迄今为止尚不清楚的实体肿瘤中诱导癌症干细胞的信号相对应。与癌症干细胞的联系与YAP/TAZ调控的其他癌症相关特性一致。这些特性包括启动肿瘤形成、诱导化疗耐药和转移以及扩大未分化细胞群的能力。YAP/TAZ的衰减可以恢复肿瘤细胞对化学疗法和放射疗法的敏感性，这可能和YAP/TAZ作为癌症干细胞决定因素的作用有关。

YAP表达升高和核聚集在人类癌症中广泛存在，并已被证明是肿瘤启动、进展或转移的关键。在非小细胞肺癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌、胃癌、胰腺癌中YAP/TAZ的高表达/核定位与癌症的恶性特征，如组织学分级和淋巴结转移相关。

RNF31属于E3泛素连接酶的一种，根据目前的研究报道，E3泛素连接酶的功能涵盖了细胞生理功能的多个方面，包括细胞迁移、细胞增殖、DNA损伤和蛋白质运输。RNF31与RBCK1和SHARPIN一起形成线性泛素链组装复合物LUBAC，它促进了IKKγ和NF-κB信号转导的线性泛素化。RNF31在人类癌症中的功能尚未得到充分研究，目前，发现RNF31在乳腺癌中发挥其致癌作用，一般通过两种不同的模型发挥功能，一种是RNF31通过促进NF-κB途径发挥致癌作用，该途径已被证明是多种癌症中的关键致癌途径；另一个就是RNF31可能通过调节这些关键的核受体/转录因子(例如ERα和P53)而充当致癌基因。RNF31的缺失可以延缓前列腺癌细胞的增殖和转移，并且RNF31在前列腺癌组织中高表达，与一些临床特征如侵袭、Gleason评分和临床分期相关。此外，肾上腺皮质癌中RNF31可以相互作用并反抑制类固醇因子-1辅抑制因子功能，从而促进肾上腺皮质癌的发生。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了RNF31在调控YAP的泛素化水平中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，RNF31蛋白表达增强，提高YAP的泛素化水平。

进一步地，RNF31蛋白表达增强，促进YAP的K48位点多聚泛素化。

进一步地，RNF31蛋白表达增强，抑制YAP的K63位点多聚泛素化。

本申请还提供了一种调控YAP的泛素化水平的方法，包括调控体系中RNF31的表达水平。

进一步地，通过在细胞中转染RNF31质粒提升RNF31的表达。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明通过在HEK293T细胞系转染RNF31质粒从而引起RNF31蛋白表达增高，同时转染YAP与泛素质粒，通过免疫共沉淀方式进行泛素化实验，利用western blot检测RNF31的蛋白表达水平和YAP蛋白的泛素化水平。

本发明首次发现了RNF31蛋白表达与YAP蛋白的泛素化水平相关，通过检测受试细胞系中RNF31的表达，可以判断受试细胞YAP蛋白的泛素化水平的强弱。同时，通过在受试细胞中转染RNF31质粒，可以调控RNF31蛋白的表达量，从而调控YAP蛋白的泛素化水平。

RNF31属于E3泛素连接酶，本发明通过在受试细胞系转染RNF31质粒引起RNF31蛋白表达的增强，设置对照组和实验组，每组细胞分别铺6孔板，分别转染RNF31质粒和对照质粒，同时转染YAP质粒和泛素质粒，通过免疫共沉淀的方式反映YAP蛋白的泛素化水平，通过Western blot的方式检测RNF31的蛋白表达水平及YAP蛋白的泛素化水平。

附图说明

图1是本发明试验例1中RNF31调控YAP蛋白的泛素化水平的效果；

图2是本发明试验例2中RNF31调控YAP蛋白在K48位点的泛素化水平的效果；

图3是本发明试验例3中RNF31调控YAP蛋白在K63位点的泛素化水平的效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了RNF31在调控YAP的泛素化水平中的应用，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例western blot检测YAP蛋白的泛素化水平的差异表达

1、本申请中所用细胞(HEK293T)购于上海中科院细胞库。本申请中所涉及的质粒、载体均可在Addgene平台可以获取。

转染HEK293T细胞的获取：将Flag-RNF31质粒或者Flag-tag空载体通过脂质体介导的转染方式转染HEK293T细胞。

细胞培养和转染详细步骤如下：

HEK293T细胞的培养和传代：细胞购于中科院细胞库，将细胞置于CO

转染RNF31质粒或空载体：将Flag-RNF31质粒作为实验组，Flag-tag空载作为对照组，各取2μg，分别加入到50μl减血清培养基(Opti-MEM)中进行稀释；取2μL脂质体Lipofectamine Lipo2000试剂加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)中进行稀释，然后将脂质体稀释液加入至Flag-RNF31质粒或Flag-tag空载稀释液中，充分混匀，置于室温条件下孵育20分钟。将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的6孔板中的培养基中，每孔加入100μl。

转染YAP质粒和泛素质粒：转染RNF31质粒或空载体6小时后，转染YAP质粒和泛素质粒。将Myc-YAP质粒或Myc-tag空载质粒与HA-Ub泛素质粒、或HA-K48 Ub泛素质粒、或HA-K63 Ub泛素质粒，各取1μL，同时加入到50μl减血清培养基(Opti-MEM)中进行稀释；取2μL脂质体Lipofectamine Lipo2000试剂加入50μL减血清培养基(Opti-MEM)中进行稀释，然后将脂质体稀释液加入至Flag-RNF31质粒或Flag-tag空载稀释液中，充分混匀，置于室温条件下孵育20分钟。将复合物按顺序分别加入上述步骤中已接种培养细胞的6孔板中的培养基中，每孔加入100μL。

2、加蛋白酶体抑制剂MG132

收蛋白前8小时，将转染过的6孔板的培养基弃去，加入混有蛋白酶体抑制剂MG132的培养基。

3、免疫共沉淀实验

弃去培养基，加入1mL细胞裂解液并将其放置于冰上，用剪去尖端的枪头按照统一的手法划动培养板的底部，收集至1.5ml EP管中，并置于冰上静置30分钟。以12000rpm的速度离心30分钟，离心后弃去下方细胞未裂解。的碎片，将上清液重新转移至新的1.5ml EP管中。取1.5mLEP管标记为Input组，加入90μL上清液和30μL 4×Loading buffer，将其放置于99℃金属浴中煮10分钟，结束后于80℃保存。取1.5mL EP管标记为IP组，均加入450μL上清。在IP管中加入0.5μg YAP的标签抗体和40μL Protein G琼脂糖珠，混匀后放置于旋转混匀摇床中，于4℃环境中缓慢孵育6小时。结束后离心，弃去上清后加入1mL PBS清洗珠子，重新离心弃去上清，重复3次。在管中加入40μL 2×Loading buffer，99℃金属浴煮10分钟，结束后于-80℃保存。

4、western blot

将制好的蛋白样用SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，一抗为RNF31抗体(abcam)，YAP抗体(CST)，HA抗体(CST)。

5、曝光

配制曝光液并转移至膜上，通过曝光机进行曝光并且保存数据。

实验结果

在HEK293T细胞中分别转染Flag质粒或Flag-RNF31质粒，6小时后统一转染HA-Ub和Myc-YAP质粒。1天后在细胞培养基中加入MG132试剂，6小时后通过泛素实验检测YAP的泛素化水平。如图1，结果显示，RNF31蛋白表达增强后YAP的泛素化水平也增强。

泛素由76个氨基酸组成，泛素分子内部含有7个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)。为了明确RNF31通过哪种泛素化类型的方式影响YAP蛋白稳定性，进行了HEK293T细胞中K48和K63泛素化位点实验，在HEK293T细胞中分别转染Flag质粒或Flag-RNF31质粒，6小时后统一转染HA-UbK48质粒或HA-UbK63质粒和Myc-YAP质粒。1天后在细胞培养基中加入MG132试剂，8小时后通过泛素实验检测YAP的泛素化水平。结果显示，RNF31可促进YAP的K48位点多聚泛素化，而抑制YAP的K63位点多聚泛素化(见图2和图3)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。