一种在猪上诱导高效表达外源基因的方法

摘要

本发明涉及一种在猪上诱导高效表达外源基因的方法。所述方法包括在猪基因组内的开放性位点Rosa26和安全性位点Hipp11进行基因修饰，所述基因修饰包括将rtTA表达盒敲入Rosa26位点，将TRE3G启动的报告基因表达盒敲入Hipp11位点。本发明通过在猪细胞水平实现双位点定点敲入Tet‑on系统同时引入phiC31/att系统，进一步通过SCNT获得Dox诱导外源基因表达猪模型，利用该猪模型，在细胞、胚胎和体内水平实验验证结果表明此双位点定点敲入Tet‑on系统能高效稳定的实现Dox调控外源基因的表达与关闭，未检测到不受调控的表达泄漏。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种在猪上诱导高效表达外源基因的方法。

背景技术

基因编辑猪是指人为的对猪基因组特定位点的DNA序列进行某种突变获得的基因修饰猪，并且这种基因突变可以稳定的遗传给后代，从而建立起有特定表型的基因修饰猪种群。

由于技术限制，最开始研究人员无法进行精确的基因工程改造，最早发展出来的基因修饰技术是随机转基因技术，1981年研究人员将HSV-TK质粒载体通过显微注射到小鼠受精卵内，然后移植到代孕母鼠体内，最后成功构建了携带外源基因的转基因小鼠，此研究首次证实利用原核显微注射技术(PNI)可构建转基因动物(参见：Ralph L.Brinster,HowardY.Chen,Myrna Trumbauer,et al.Somatic expression of herpes thymidinekinase in mice following injection ofa fusion gene into eggs[J].Cell,1981.)，首次证实利用原核显微注射技术(PNI)可构建转基因动物，随后研究人员利用原核显微注射技术成功制备了转基因兔，羊和猪等其他转基因动物。

近年来，新型高效基因编辑技术人工核酸酶的出现，使基因编辑猪的培育发生了革命性的变化。人工核酸酶是指可识别基因组内特定位点并对其切割的人为改造后的核酸内切酶，在基因组内特定位点引入双链断裂缺口，可以高效产生基于非同源重组的基因敲除，并能大大提高基于同源重组修复方式的基因敲入动物的制备效率，目前已发展出三代人工核酸酶，包括锌指人工核酸酶(ZFN)第一代人工核酸酶、TALEN第二代人工核酸酶和CRISPR/Cas9第三代人工核酸酶。不同于ZFN和TALEN通过蛋白质对特定DNA序进行识别与结合，CRISPR/Cas9是通过向导RNA对特定DNA序列进行识别与结合，利用Cas9核酸酶进行切割DNA序列，Hai等(2014)将Cas9 mRNA和gRNA注入猪受精卵获得了vWF基因敲除猪，制备了血管性血友病基因编辑猪模型。

基因的突变会带来不同表型，有些基因在动物发育过程中过表达或缺失是致死的，还有些基因只在特定发育阶段、特定的组织或器官中表达，传统的基因编辑动物模型无法满足研究此现象的特定要求，因此需要建立条件性基因编辑动物模型，对基因的表达进行时空调控，但由于昂贵的成本、较长的时间周期以及较高技术难度等方面的限制，条件性基因编辑猪模型的报导相对较少。

四环素诱导系统(tet-on)由两个元件组成，其中一个元件是rtTA，由突变的Tet抑制子融合VP16组成，另一个元件和tTA系统相同，由tetO序列组合Pcmv并且在下游连接目的基因，在多西环素(Doxcycline，Dox)不存在的情况下，rtTA很难或者基本不结合到tetO序列从而无法启动下游目的基因表达，在供给Dox的情况下，rtTA能识别结合Dox然后其构象发生改变从而可以实现特异性结合到tetO序列，从而活化Pcmv来激活下游目的基因表达。有报道(MR Park,SK Cho,EK Lee,et al.Egfp Gene Expression in Nuclear Transfer-Derived Embryos and The Production of Cloned Transgenic Pig from Fetus-Derived Fibroblasts[J].Reproductive&Developmental Biology.)利用一个包含tet-on系统所有元件的慢病毒载体感染猪胎儿成纤维细胞，将基因编辑细胞用于体细胞核移植，成功获得了四环素诱导EGFP基因表达的转基因猪。

但已报道可以实现条件性调控基因表达猪模型的制备方法效率较低耗时长，并且已经建立的可以实现条件性调控基因表达猪模型采用随机转基因技术，存在转基因拷贝数不确定及转基因位点随机导致条件性调控基因表达水平不稳定甚至完全沉默的风险，因此，提供一种在猪中稳定高效实现件性调控诱导外源基因表达的方法，对于构建基因修饰动物具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种在猪上诱导高效表达外源基因的方法，所述方法将Tet-on系统两个元件同时分别敲入猪基因组，能够用于构建多西环素(Dox)诱导外源基因表达克隆猪模型，在猪上实现Dox诱导调控目的基因稳定表达。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种在猪上诱导高效表达外源基因的方法，所述方法包括在猪基因组内的开放性位点Rosa26和安全性位点Hipp11进行基因修饰，所述基因修饰包括将rtTA表达盒敲入Rosa26位点，将TRE3G启动的报告基因表达盒敲入Hipp11位点。

本发明中，同时将rtTA表达盒定点敲入Rosa26位点，将TRE3G启动的报告基因表达盒定点敲入Hipp11位点，内源启动子Rosa26启动rtTA表达，在多西环素(Doxcycline，Dox)不存在的情况下，rtTA很难或者基本不结合到TRE3G启动子，报告基因不表达，在Dox存在情况下，rtTA和Dox结合到TRE3G启动子，从而激活TRE3G启动子启动报告基因表达，即实现Dox诱导调控外源基因稳定表达。

优选地，所述报告基因表达盒中的报告基因两侧具有被phiC31重组酶特异性识别的attP位点。

优选地，所述rtTA表达盒敲入Rosa26位点的第一个内含子。

优选地，所述rtTA表达盒具有新霉素(NEO)抗性。

优选地，所述rtTA表达盒的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。

SEQ ID NO.1：

gtgacctgcacgtctagggcgcagtagtccagggtttccttgatgatgtcatacttatcctgtcccttttttttccacagctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtaagaattcctcgatcgagggacctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatattaagggttccgcaagcttgtttaaacgccaccatgtctagactggacaagagcaaagtcataaactctgctctggaattactcaatggagtcggtatcgaaggcctgacgacaaggaaactcgctcaaaagctgggagttgagcagcctaccctgtactggcacgtgaagaacaagcgggccctgctcgatgccctgccaatcgagatgctggacaggcatcatacccactcctgccccctggaaggcgagtcatggcaagactttctgcggaacaacgccaagtcataccgctgtgctctcctctcacatcgcgacggggctaaagtgcatctcggcacccgcccaacagagaaacagtacgaaaccctggaaaatcagctcgcgttcctgtgtcagcaaggcttctccctggagaacgcactgtacgctctgtccgccgtgggccactttacactgggctgcgtattggaggaacaggagcatcaagtagcaaaagaggaaagagagacacctaccaccgattctatgcccccacttctgaaacaagcaattgagctgttcgaccggcagggagccgaacctgccttccttttcggcctggaactaatcatatgtggcctggagaaacagctaaagtgcgaaagcggcgggccgaccgacgcccttgacgattttgacttagacatgctcccagccgatgcccttgacgactttgaccttgatatgctgcctgctgacgctcttgacgattttgaccttgacatgctccccgggtaaggatcccgcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataagcttgccacaaccatggctgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcggccgccagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgc。

优选地，所述报告基因表达盒具有嘌呤霉素(Puro)抗性。

优选地，所述报告基因表达盒的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。

SEQ ID NO.2：

ttactccctatcagtgatagagaacgtatgaagagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgcagactttactccctatcagtgatagagaacgtataaggagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgaccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatctacagtttactccctatcagtgatagagaacgtatatccagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgaggtaggcgtgtacggtgggcgcctataaaagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagcaattccacaacacttttgtcttatacttgctagcgagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcccgggagtagtgccccaactggggtaacctttgagttctctcagttgggggcgtagggtcggaattcagatctctcgagggtaccggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttcatgtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgattacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggcaccaacttcccccccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccaccaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagaccatctacatggccaagaagcccgtgcaactgcccggctactactacgtggacaccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgctccgagggccgccaccacctgttcctggggcatggcaccggcagcaccggcagcggcagctccggcaccgcctcctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttcatgtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgattacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggcaccaacttcccccccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccaccaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagaccatctacatggccaagaagcccgtgcaactgcccggctactactacgtggacaccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgctccgagggccgccaccacctgttcctgtacggcatggacgagctgtacaagtaggcggccgccgaccctacgcccccaactgagagaactcaaaggttaccccagttggggcactactcccgtctagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaaggatccgtcgacgtttaaacaaaaaaggcgcgccataacttcgtataatgtatgctatacgaagttataagcttaattaagaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcagcttgatatcgaattaattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttctactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctgcagccaacgccaccatggggaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtcccccgggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgacccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgccggatccatgcccacgctactgcgggtttatatagacggtcctcacgggatggggaaaaccaccaccacgcaactgctggtggccctgggttcgcgcgacgatatcgtctacgtacccgagccgatgacttactggcaggtgctgggggcttccgagacaatcgcgaacatctacaccacacaacaccgcctcgaccagggtgagatatcggccggggacgcggcggtggtaatgacaagcgcccagataacaatgggcatgccttatgccgtgaccgacgccgttctggctcctcatatcgggggggaggctgggagctcacatgccccgcccccggccctcaccctcatcttcgaccgccatcccatcgccgccctcctgtgctacccggccgcgcgataccttatgggcagcatgaccccccaggccgtgctggcgttcgtggccctcatcccgccgaccttgcccggcacaaacatcgtgttgggggcccttccggaggacagacacatcgaccgcctggccaaacgccagcgccccggcgagcggcttgacctggctatgctggccgcgattcgccgcgtttacgggctgcttgccaatacggtgcggtatctgcagggcggcgggtcgtggcgggaggattggggacagctttcggggacggccgtgccgccccagggtgccgagccccagagcaacgcgggcccacgaccccatatcggggacacgttatttaccctgtttcgggcccccgagttgctggcccccaacggcgacctgtacaacgtgtttgcctgggccttggacgtcttggccaaacgcctccgtcccatgcacgtctttatcctggattacgaccaatcgcccgccggctgccgggacgccctgctgcaacttacctccgggatggtccagacccacgtcaccacccccggctccataccgacgatctgcgacctggcgcgcacgtttgcccgggagatgggggaggctaactgagctctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgg。

优选地，所述方法还包括将所述报告基因表达盒中的报告基因替换为目的基因的步骤。

优选地，将所述报告基因表达盒中的报告基因替换为目的基因的步骤包括：

利用phiC31重组酶介导的位点特异性重组反应以及基因盒式置换方法将所述报告基因表达盒中的报告基因替换为目的基因。

本发明中，在报告基因表达盒中的报告基因两侧引入了可以被phiC31重组酶特异性识别的attP位点，在phiC31重组酶以及带有attB位点的供体DNA模版存在的条件下，phiC31重组酶识别介导attP与attB位点发生重组，最后形成不可以再被phiC31重组酶识别的attR以及将供体DNA上的基因整合到基因组内，基于phiC31介导的位点特异性重组反应以及基因盒式置换方法，在Dox诱导报告基因表达系统的基础之上，可通过两条路径获得Dox诱导其他目的基因表达的猪模型(示意图如图1A和1B所示)，其中一条路径是在细胞水平进行重组酶介导的盒式交换(recombinase mediated cassette exchanc，RMCE)，获得加Dox不表达报告基因的细胞克隆，然后将这些细胞作为供体细胞进行体细胞核移植和胚胎移植最终获得Dox诱导其他目的基因表达的猪模型，另外一条路径是在克隆胚胎或受精卵上直接进行RMCE之后进行胚胎移植获得Dox诱导其他目的基因表达的猪模型。

优选地，所述目的基因包括KRAS

优选地，所述报告基因表达盒中的报告基因包括tdTomato。

优选地，所述tdTomato的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。

SEQ ID NO.3：

atggtgagcaagggcgaggaggtcatcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttcatgtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgattacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggcaccaacttcccccccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccaccaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagaccatctacatggccaagaagcccgtgcaactgcccggctactactacgtggacaccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgctccgagggccgccaccacctgttcctggggcatggcaccggcagcaccggcagcggcagctccggcaccgcctcctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaagagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttcatgtacggctccaaggcgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgattacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggcaccaacttcccccccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccaccaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagaccatctacatggccaagaagcccgtgcaactgcccggctactactacgtggacaccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgagcgctccgagggccgccaccacctgttcctgtacggcatggacgagctgtacaagtag。

作为优选的技术方案，所述在猪上诱导高效表达外源基因的方法包括：

将具有新霉素抗性的rtTA表达盒敲入猪基因组内的Rosa26位点的第一个内含子，将具有嘌呤霉素抗性的TRE3G启动的报告基因表达盒敲入猪基因组内的Hipp11位点。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明采用将Tet-on系统两个元件同时分别敲入猪安全性位点Rosa26和开放性位点Hipp11的双位点定点敲入策略，实现Dox诱导调控报告基因稳定表达，结合体细胞核移植技术成功构建Dox诱导报告基因表达克隆猪模型，从成体猪分离获得的耳朵成纤维细胞、F1代猪胎儿成纤维细胞水平、体细胞核移植克隆胚胎水平以及猪各个组织器官水平进行实验分析，发现均能实现Dox诱导调控目的基因稳定表达；

(2)本发明将attP位点引入TRE3G启动子下游报告基因两侧，从而可用phiC31重组酶介导基因置换，因此在Dox诱导报告基因表达猪的基础上，可以直接通过phiC31重组酶介导胚胎水平效率高达20％或者细胞水平基因置换结合体细胞核移植来获得Dox诱导其他目的基因表达的猪模型；

(3)本发明成功构建Dox诱导其他目的基因(KRAS

附图说明

图1A为CRISPR/Cpf1介导的rtTA表达盒定点敲入Rosa26位点策略图；

图1B为CRISPR/Cpf1介导的TRE3G启动报告基因表达盒(TRE3G-attP-tdTomato-attP)定点敲入Hipp11位点策略图；

图2为模型猪中Dox诱导目的基因表达示意图；

图3A为PhiC31介导将Dox诱导调控的基因进行盒式置换示意图；

图3B为在Dox诱导tdTomato表达猪模型基础上应用RMCE获得其他猪模型示意图；

图4A为Dox诱导tdTomato表达克隆猪成体的耳朵成纤维细胞在Dox诱导时的荧光图，其中D0、D1、D2、D3、D4，代表培养第0、1、2、3、4天，+Dox代表添加Dox；

图4B为Dox诱导tdTomato表达克隆猪成体的耳朵成纤维细胞在无Dox诱导时的荧光图，其中D0、D1、D3、D5、D7，代表撤掉Dox培养第0、1、3、5、7天，-Dox代表撤掉Dox。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例通过CRISPR/Cpf1技术，在猪细胞水平实现双位点定点敲入Tet-on系统同时引入phiC31/att系统，构建示意图如图1A和图1B所示，具体构建过程如下所示：

(1)构建打靶载体，针对之前文献已报道的在猪基因组内的开放性位点Rosa26和安全性位点Hipp11分别设计了gRNA和打靶载体，同时将带有NEO抗性的rtTA表达盒(SEQ IDNO.1)定点敲入Rosa26位点的第一个内含子(图1A)，将带有Puro抗性的TRE3G启动tdTomato基因表达盒(SEQ ID NO.2)定点敲入Hipp11位点，并且将phiC31/att系统的一对attP位点分别引入tdTomato基因上游和下游(图1B)；

(2)细胞筛选，利用上述构建的打靶载体，首先按照文献已报道的方式，在B超检测到巴马小型猪(购买于东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司)妊娠35天，解剖获取子宫，在实验室分离并冻存猪胎儿成纤维细胞，然后在此猪胎儿成纤维细胞上同时进行双位点定点敲入，共筛选挑取细胞克隆120个，经PCR鉴定，其中Rosa26位点定点敲入克隆16个，Hipp11位点定点敲入克隆30个，而双位点同时发生基因定点敲入的克隆有2个；

(3)体细胞核移植构建Dox诱导tdTomato表达猪模型，将上述细胞筛选获得的两株阳性克隆混合作为供体细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植，将1140枚克隆胚胎移植到5头受体母猪(购买于东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司)，B超检查发现有一头受体母猪怀孕，最终产下4头克隆猪仔，提取这4头克隆猪仔耳朵组织基因组，经过PCR分别鉴定Rosa26位点，Hipp11位点基因敲入情况，证明成功获得3头双位点定点基因敲入克隆猪，这三头猪在Hipp11位点均是单等位基因敲入，而在Rosa26位点有2头猪是双等位基因敲入，一头猪是单等位基因敲入。

构建的模型猪中Dox诱导目的基因表达示意图如图2所示，此外，进行细胞、胚胎及体内水平实验，具体过程如下：

(1)Dox诱导tdTomato表达模式，内源启动子Rosa26启动rtTA表达，在Dox存在情况下，rtTA和Dox结合到TRE3G启动子，从而激活TRE3G启动子启动报告基因tdTomato表达(图2)；

(2)细胞水平Dox诱导目的基因表达验证，首先分离培养Dox诱导tdTomato表达克隆猪成体的耳朵成纤维细胞，然后在普通猪成纤维细胞培养基(成分如表1所示)中添加1μg/mLDox，在荧光显微镜下可以观察到不加Dox培养的细胞不表达红色荧光，而加Dox后细胞逐渐开始表达红色荧光(如图4A所示)，在第四天表达量达到峰值并稳定，之后撤掉Dox，红色荧光逐渐减少，直到在第7天基本全部消失(图4B)，Dox诱导tdTomato表达克隆猪性成熟之后，将其与野生型母猪交配，怀孕第35天时，剖开子宫获得9个F1猪胎儿，经过PCR鉴定其基因型，发现#5，6，7，8号胎儿为双位点单等位基因敲入猪胎儿，在细胞间分离培养并冻存F1代猪胎儿成纤维细胞，与上述耳朵成纤维细胞类似，在荧光显微镜下观察到加Dox诱导后tdTomato报告基因表达，而Dox不存在的情况下，没有观察到红色荧光泄漏；

表1

(3)胚胎水平Dox诱导目的基因表达验证，将上述分离培养的Dox诱导tdTomato表达克隆猪的耳朵成纤维细胞作为供体细胞，进行体细胞核移植构建重构胚胎，在重构胚胎培养基PZM3中添加1μg/mLDox，培养6天后，在荧光显微镜下观察到加Dox诱导后的囊胚表达红色荧光蛋白，而Dox不存在的情况下，没有观察到红色荧光表达；

(4)猪成体水平Dox诱导目的基因表达验证，在Dox诱导tdTomato表达克隆猪三个月大时，按照50mg Dox/kg/天给猪喂药，对照猪喂水，三天之后，在暗室观察猪体内荧光表达情况，在绿色激光照射下，肉眼观察到实验猪全身可见明显的红色荧光，而对照猪则没有观察到，将性成熟的Dox诱导tdTomato表达克隆猪与野生型母猪交配，获得了6头F1代Dox诱导tdTomato表达猪模型，经过PCR鉴定，其中F1-1，F-6是同时双位点单等位定点敲入猪，用F1-1与F1-6进行体内Dox诱导基因表达实验，即按照50mg Dox/kg/天给猪喂药一星期后，将F1-1与F1-6带回实验室，采血进行流式分析，发现裂红之后的血细胞表达tdTomato报告基因占比高达88.6％，随后将这两头猪处死，手术解剖分离各个组织器官，在暗室内，用激光灯绿波波长照射各个组织和器官，相机镜头加上红色滤光片，观察并拍摄各个器官或组织表达红色荧光蛋白照片，发现在检测的肠，肝，脊髓，胰腺，脑，脾脏，胸腺，舌头，胃，血管，骨骼肌，肾，心，食管，肺，皮肤，蹄和耳朵这些组织或器官均有明显的红色荧光蛋白表达。此外，将新鲜组织在液氮中速冻，进行冰冻切片，发现各个组织的冰冻切片也有明显的红色荧光蛋白表达，而不加Dox的对照猪内则没有检测到tdTomato报告基因的表达泄漏，并在mRNA水平分析Dox诱导tdTomato报告基因表达情况，对按照50mg Dox/kg/天连续喂药一个星期，然后撤药一个星期的实验组和对照组1个月龄大的F1代猪，进行连续14天的前腔静脉采血，将采集在抗凝管内的血样迅速转移至液体样品RNA提取稳定剂中，放在冰上带回实验室保存，样品全部采集完之后统一提取RNA，反转出cDNA，进行Q-PCR检测，结果表明在连续加Dox时，tdTomato报告基因转录本开始表达，第二天开始表达量维持较高水平，而在撤掉Dox之后，tdTomato报告基因转录本表达量逐渐降低，撤药之后第二天几乎就已经表达量很低。

综上所述，细胞、胚胎及体内水平实验结果表明，本发明在猪Rosa26位点和Hipp11位点双位点定点敲入Tet-on系统能高效稳定的实现Dox调控外源基因的表达与关闭，未检测到不受调控的表达泄漏。

实施例2

本实施例利用实施实1构建的模型猪进行目的基因替换，制备Dox诱导调控hKRAS

(1)重组酶介导的盒式置换，如图3A所示，在tdTomato报告基因两侧引入了可以被phiC31重组酶特异性识别的attP位点，在phiC31重组酶以及带有attB位点的供体DNA模版存在的条件下，phiC31重组酶识别介导attP与attB位点发生重组，最后形成不可以再被phiC31重组酶识别的attR并将供体DNA上的基因整合到基因组内，在细胞水平进行重组酶介导的盒式置换，通过将表达phiC31的质粒以及目的基因两侧包含attB的供体模版电转到Dox诱导tdTomato表达细胞中进行细胞筛选，获得加Dox不表达tdTomato红色荧光蛋白的细胞克隆，然后将这些细胞作为供体细胞进行体细胞核移植和胚胎移植最终获得Dox诱导其他目的基因表达的猪模型，也可以在克隆胚胎水平直接进行重组酶介导的盒式置换，之后进行胚胎移植获得Dox诱导其他目的基因表达的猪模型(图3B)；

(2)胚胎水平验证重组酶介导的盒式置换，首先将Dox诱导tdTomato表达的克隆胚胎分成三组，每组100个，通过胚胎显微操作注射phiC31 mRNA浓度为100ng/μL，EGFP绿色荧光蛋白DNA模版浓度20ng/μL，在分别注射phiC31 mRNA，RMCE-donor以及phiC31mRNA和RMCE-donor的三组克隆胚胎中，观察到与不注射的对照克隆胚胎比较，囊胚率没有明显变化，即注射的mRNA或DNA没有毒性，并且最终只在同时注射phiC31和RMCE-donor的实验组中观察到存在表达EGFP绿色荧光蛋白的囊胚，经PCR检测重组后的基因组序列，以及通过sanger测序PCR的重组产物，可以发现在8个表达EGFP绿色荧光的囊胚中发生了phiC31介导的精确的基因盒式置换；

(3)细胞水平验证重组酶介导的盒式置换，在分离培养的35天猪胎儿成纤维细胞水平上，可以实现将红色荧光置换成绿色荧光，并且将表达红色荧光与绿色荧光的细胞图片合并(merge)之后，未发现黄色出现，即绿色荧光是由于进行了RMCE而不是发生了随机转基因，所以细胞只存在未发生重组酶介导的盒式置换，表达红色荧光蛋白，或者成功发生重组酶介导的盒式置换，表达绿色荧光蛋白的情况；

(4)通过细胞水平重组酶介导的盒式置换获得Dox诱导KRAS(G12D)表达细胞克隆，在Dox诱导红色荧光报告基因表达的猪胎儿成纤维细胞的基础之上，将表达phiC31的质粒以及KRAS(G12D)两侧包含attB的供体模版电转到Dox诱导tdTomato表达细胞中进行细胞筛选，获得不表达红色荧光的细胞克隆，经过PCR鉴定和sanger测序这些不发光的细胞克隆，发现实现了精确的单基因盒式置换；

(5)将筛选获得的Dox诱导KRAS(G12D)表达猪胎儿成纤维细胞克隆混合作为供体细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植，将412枚克隆胚胎移植到4头受体母猪，B超检查发现有4头受体母猪均怀孕，最后一共产下17头克隆猪仔，其中4头出生死亡，其他13头健康存活，提取这17头克隆猪仔耳朵组织基因组，经过PCR分别鉴定Rosa26位点，Hipp11位点基因敲入情况，这17头克隆猪仔在Rosa26位点均为单等位基因敲入，而在Hipp11位点只有一头克隆猪是野生型基因型，其余16头中有7头是双等位基因敲入，有9头是单等位基因敲入，获得了16头双位点同时定点敲入的Dox诱导KRAS(G12D)表达的克隆猪仔，其中有四头克隆猪出生时死亡，未进行Dox诱导实验前健康无异常。

所构建的Dox诱导调控hKRAS

此外，和体外的细胞肿瘤模型、利用传统的转基因或基因打靶技术以及病人来源肿瘤移植物建立的的肿瘤动物模型相比，药物诱导致使突变基因表达制备的肿瘤动物模型在以下方面更具有优势：(1)肿瘤在天然的组织微环境发生发展，与周围组织有正常的细胞通讯和互作；(2)体细胞表达突变基因驱动肿瘤的产生；(3)发展出肿瘤的动物拥有完整天然的免疫系统；(4)可通过药物调控突变基因表达情况达到控制肿瘤发展进程目的。

实施例3

本实施例利用实施实1构建的模型猪进行目的基因替换，制备Dox诱导调控CTLA4Ig-T2A-PDL1表达猪模型，具体过程如下：

(1)打靶载体构建以及细胞筛选，首先构建带有Puro抗性的TRE3G启动CTLA4Ig-T2A-PDL1基因表达盒定点敲入Hipp11位点供体模版，利用上述构建的打靶载体，在猪胎儿成纤维细胞上进行单位点定点敲入，Puro筛选后获得单位点敲入的阳性单细胞来源的克隆；

(2)体细胞核移植构建Dox诱导CTLA4Ig-T2A-PDL1表达猪模型，将上述细胞筛选获得阳性克隆混合作为供体细胞，进行体细胞核移植和胚胎移植，最终产下单位点敲入TRE3G启动CTLA4Ig-T2A-PDL1表达的克隆猪，TRE3G启动CTLA4Ig-T2A-PDL1表达的克隆猪性成熟之后，与上述携带Rosa26启动rtTA表达进行交配，成功获得全身性Dox诱导CTLA4Ig-T2A-PDL1表达猪模型。

综上所述，本发明通过在猪细胞水平实现双位点定点敲入Tet-on系统同时引入phiC31/att系统，进一步通过SCNT获得Dox诱导外源基因表达猪模型，利用该猪模型，在细胞、胚胎和体内水平实验验证结果表明此双位点定点敲入Tet-on系统能高效稳定的实现Dox调控外源基因的表达与关闭，未检测到不受调控的表达泄漏，同时利用phiC31介导的RMCE可以在猪细胞或SCNT克隆胚胎水平实现受Dox调控基因的替换，直接获得Dox诱导其他目的基因表达的细胞或胚胎，这些细胞或胚胎后续可简单直接用于制备Dox诱导其他目的基因表达猪模型。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院，生物岛实验室，三亚猪种质资源创新研究院

<120> 一种在猪上诱导高效表达外源基因的方法

<130> 20210915

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2534

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgacctgca cgtctagggc gcagtagtcc agggtttcct tgatgatgtc atacttatcc 60

tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc tttccagtaa 120

gaattcctcg atcgagggac ctaataactt cgtatagcat acattatacg aagttatatt 180

aagggttccg caagcttgtt taaacgccac catgtctaga ctggacaaga gcaaagtcat 240

aaactctgct ctggaattac tcaatggagt cggtatcgaa ggcctgacga caaggaaact 300

cgctcaaaag ctgggagttg agcagcctac cctgtactgg cacgtgaaga acaagcgggc 360

cctgctcgat gccctgccaa tcgagatgct ggacaggcat catacccact cctgccccct 420

ggaaggcgag tcatggcaag actttctgcg gaacaacgcc aagtcatacc gctgtgctct 480

cctctcacat cgcgacgggg ctaaagtgca tctcggcacc cgcccaacag agaaacagta 540

cgaaaccctg gaaaatcagc tcgcgttcct gtgtcagcaa ggcttctccc tggagaacgc 600

actgtacgct ctgtccgccg tgggccactt tacactgggc tgcgtattgg aggaacagga 660

gcatcaagta gcaaaagagg aaagagagac acctaccacc gattctatgc ccccacttct 720

gaaacaagca attgagctgt tcgaccggca gggagccgaa cctgccttcc ttttcggcct 780

ggaactaatc atatgtggcc tggagaaaca gctaaagtgc gaaagcggcg ggccgaccga 840

cgcccttgac gattttgact tagacatgct cccagccgat gcccttgacg actttgacct 900

tgatatgctg cctgctgacg ctcttgacga ttttgacctt gacatgctcc ccgggtaagg 960

atcccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg 1020

ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag 1080

ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc 1140

caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg 1200

aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag 1260

gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca 1320

gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt 1380

caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc 1440

tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aacgtctagg ccccccgaac 1500

cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataag cttgccacaa ccatggctga 1560

acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga 1620

ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg 1680

gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga 1740

ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt 1800

tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct 1860

gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct 1920

gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg 1980

agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca 2040

ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga 2100

tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt 2160

ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt 2220

ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct 2280

ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt 2340

cttctgagcg gccgccagcc ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct 2400

cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt 2460

tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 2520

atttttttca ctgc 2534

<210> 2

<211> 4804

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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cgtatgcaga ctttactccc tatcagtgat agagaacgta taaggagttt actccctatc 120

agtgatagag aacgtatgac cagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatctacagt 180

ttactcccta tcagtgatag agaacgtata tccagtttac tccctatcag tgatagagaa 240

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cgtcagatcg cctggagcaa ttccacaaca cttttgtctt atacttgcta gcgagctcgt 360

ttagtgaacc gtcagatcgc ccgggagtag tgccccaact ggggtaacct ttgagttctc 420

tcagttgggg gcgtagggtc ggaattcaga tctctcgagg gtaccggaag cggagctact 480

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gccaccatgg tgagcaaggg cgaggaggtc atcaaagagt tcatgcgctt caaggtgcgc 600

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gacatccccg attacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 840

aacttcgagg acggcggtct ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcacg 900

ctgatctaca aggtgaagat gcgcggcacc aacttccccc ccgacggccc cgtaatgcag 960

aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg 1020

aagggcgaga tccaccaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc 1080

aagaccatct acatggccaa gaagcccgtg caactgcccg gctactacta cgtggacacc 1140

aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgagcgctcc 1200

gagggccgcc accacctgtt cctggggcat ggcaccggca gcaccggcag cggcagctcc 1260

ggcaccgcct cctccgagga caacaacatg gccgtcatca aagagttcat gcgcttcaag 1320

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cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggcgg ccccctgccc 1440

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gagttcaaga ccatctacat ggccaagaag cccgtgcaac tgcccggcta ctactacgtg 1860

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gccgccgacc ctacgccccc aactgagaga actcaaaggt taccccagtt ggggcactac 2040

tcccgtctag atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 2100

cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 2160

gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 2220

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atccgtcgac gtttaaacaa aaaaggcgcg ccataacttc gtataatgta tgctatacga 2340

agttataagc ttaattaaga agttcctatt ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg 2400

aacttcagct tgatatcgaa ttaattctac cgggtagggg aggcgctttt cccaaggcag 2460

tctggagcat gcgctttagc agccccgctg ggcacttggc gctacacaag tggcctctgg 2520

cctcgcacac attccacatc caccggtagg cgccaaccgg ctccgttctt tggtggcccc 2580

ttcgcgccac cttctactcc tcccctagtc aggaagttcc cccccgcccc gcagctcgcg 2640

tcgtgcagga cgtgacaaat ggaagtagca cgtctcacta gtctcgtgca gatggacagc 2700

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ctcaggggcg gggcgggcgc ccgaaggtcc tccggaggcc cggcattctg cacgcttcaa 2880

aagcgcacgt ctgccgcgct gttctcctct tcctcatctc cgggcctttc gacctgcagc 2940

caacgccacc atggggaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt 3000

cccccgggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac 3060

cgtcgacccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg 3120

cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg 3180

gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc 3240

cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca 3300

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caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa 3540

gcccggtgcc ggatccatgc ccacgctact gcgggtttat atagacggtc ctcacgggat 3600

ggggaaaacc accaccacgc aactgctggt ggccctgggt tcgcgcgacg atatcgtcta 3660

cgtacccgag ccgatgactt actggcaggt gctgggggct tccgagacaa tcgcgaacat 3720

ctacaccaca caacaccgcc tcgaccaggg tgagatatcg gccggggacg cggcggtggt 3780

aatgacaagc gcccagataa caatgggcat gccttatgcc gtgaccgacg ccgttctggc 3840

tcctcatatc gggggggagg ctgggagctc acatgccccg cccccggccc tcaccctcat 3900

cttcgaccgc catcccatcg ccgccctcct gtgctacccg gccgcgcgat accttatggg 3960

cagcatgacc ccccaggccg tgctggcgtt cgtggccctc atcccgccga ccttgcccgg 4020

cacaaacatc gtgttggggg cccttccgga ggacagacac atcgaccgcc tggccaaacg 4080

ccagcgcccc ggcgagcggc ttgacctggc tatgctggcc gcgattcgcc gcgtttacgg 4140

gctgcttgcc aatacggtgc ggtatctgca gggcggcggg tcgtggcggg aggattgggg 4200

acagctttcg gggacggccg tgccgcccca gggtgccgag ccccagagca acgcgggccc 4260

acgaccccat atcggggaca cgttatttac cctgtttcgg gcccccgagt tgctggcccc 4320

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gctgcaactt acctccggga tggtccagac ccacgtcacc acccccggct ccataccgac 4500

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atgg 4804

<210> 3

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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ggctccatga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 120

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cccgattaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 300

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tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc 900

tgggacatcc tgtcccccca gttcatgtac ggctccaagg cgtacgtgaa gcaccccgcc 960

gacatccccg attacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 1020

aacttcgagg acggcggtct ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcacg 1080

ctgatctaca aggtgaagat gcgcggcacc aacttccccc ccgacggccc cgtaatgcag 1140

aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg 1200

aagggcgaga tccaccaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc 1260

aagaccatct acatggccaa gaagcccgtg caactgcccg gctactacta cgtggacacc 1320

aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgagcgctcc 1380

gagggccgcc accacctgtt cctgtacggc atggacgagc tgtacaagta g 1431