与鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性相关的SNP分子标记及其应用

摘要

本发明涉及分子标记技术领域，具体公开了与鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性相关的SNP分子标记及其应用。本发明的与鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性相关的SNP分子标记，其含有如SEQ ID NO.1所示序列第166位多态性为A/C的核苷酸序列。所述SNP分子标记的多态性位点为A，对应于地克珠利敏感；多态性位点为C，对应于地克珠利耐药。经鸡柔嫩艾美耳球虫不同临床耐药虫株的验证，该SNP位点可用于鉴别地克珠利耐药的鸡柔嫩艾美耳球虫和敏感的鸡柔嫩艾美耳球虫，具有较高的地克珠利耐药性检测准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体地说，涉及与鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

艾美耳属(Eimeria)球虫隶属于顶复门，广泛寄生于鸡、兔、鸭和鹅等动物的肠道或肝脏、肾脏等部位。寄生于鸡肠道内的艾美耳球虫有7个种，分别是柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、毒害艾美耳球虫(E.necartrix)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)和早熟艾美耳球虫(E.praecox)。鸡球虫病对养禽业危害极大。每年需要高额药费用于抗球虫。

自20世纪40年代以来，各国一直使用有效的药物防治鸡球虫病。但早在1945年就已从田间分离到了对磺胺类药物具有抗药性的虫株，1954年又从鸡场分离出对磺胺类药物有抗药性的虫株。到了60年代，相继出现不同药物的不同抗药株。迄今为止，几乎所有的抗球虫药均有抗药虫株的出现，且抗药虫株表现出对与该药同类或作用机理相同的其他药物一定程度的交叉抗药性。

地克珠利(diclazuril)是一种抗球虫药，由比利时扬森公司于1986年开发，其化学名为氯嗪苯乙氰。地克珠利对鸡、火鸡、鸭、鹅、孔雀、鹌鹑、兔等多种畜禽的球虫病具有良好的防治效果，地克珠利属于非离子载体型抗球虫药，是目前用量最小，抗球虫谱广，高效的抗球虫药。地克珠利对感染鸡的6种重要的艾美耳球虫都有效。然而，在该药物投入使用一段时间后，针对地克珠利的耐药性球虫不断出现。目前，对地克珠利耐药性的检测方法仍停留在笼饲实验，虽然这种方法的检测结果较为可靠，但是其过程较为复杂且耗时长，需要大量新鲜的球虫卵囊及实验动物。所以，亟待开发一种能够快速检测鸡球虫地克珠利耐药的方法，以便指导临床球虫病用药，降低养殖业损失。

发明内容

本发明的目的是提供一种与鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性相关的SNP分子标记及利用该SNP分子标记检测鸡球虫地克珠利耐药性的方法。

第一方面，本发明提供的与鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性相关的SNP分子标记，其含有如SEQ ID NO.1所示序列第166位多态性为A/C的核苷酸序列。

所述SNP分子标记的多态性位点为A，对应于地克珠利敏感；多态性位点为C，对应于地克珠利耐药。

本发明通过提取地克珠利耐药的鸡球虫和敏感的鸡球虫的基因组，进行100×的重测序，分析重测序后的结果发现，在EVM0004287基因第166位的SNP位点，敏感虫株的SNP位点为A，耐药虫株的SNP位点为C。通过分离获得大量的鸡球虫样本，进行临床耐药虫株的验证，发现该SNP位点可用于筛选、鉴别地克珠利耐药的鸡柔嫩艾美耳球虫和敏感的鸡柔嫩艾美耳球虫，其鉴定结果与笼饲实验的鉴定结果一致。

第二方面，本发明提供用于扩增上述SNP分子标记的引物对，其核苷酸序列如SEQID NO.2-3所示。

第三方面，本发明提供含有上述引物对的试剂盒。

第四方面，本发明提供上述SNP分子标记或引物对或试剂盒在检测鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性中的应用、在筛选鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药虫株中的应用、在指导鸡抗柔嫩艾美耳球虫药物使用中的应用。

第五方面，本发明提供一种检测鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性的方法，其以待测鸡柔嫩艾美耳球虫的DNA或RNA为模板，采用SEQ ID NO.2-3所示引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的序列判断待测鸡柔嫩艾美耳球虫是否具有地克珠利耐药性。

所述PCR扩增的反应程序包括：98℃，30-60s；98℃，15-30s；65℃，20-30s；72℃，25-35s，30-40个循环；72℃，5-10min。

优选的，采用的PCR扩增的反应程序为：98℃，30s；98℃，15s；65℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，10min。

鸡球虫的DNA/RNA可通过常规提取方法得到。PCR扩增产物的序列可采用测序等本领域常规方法进行分析。

其中，若PCR扩增产物中对应于SEQ ID NO.1所示序列第166位的核苷酸序列为A，则待测柔嫩艾美耳球虫为地克珠利敏感虫株，若PCR扩增产物中对应于SEQ ID NO.1所示序列第166位的核苷酸序列为C，则待测柔嫩艾美耳球虫为地克珠利耐药虫株。

本发明的上述用于检测柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性的试剂盒的使用方法，包括以常规方法提取待测虫株样品DNA/RNA模板的步骤、以提取的DNA/RNA为模板，利用所述试剂盒进行PCR扩增的步骤、并根据PCR扩增结果进行虫株地克珠利耐药性的验证。

本发明的有益效果至少在于：

本发明SNP分子标记可用于区分鉴别地克珠利敏感和耐药的鸡柔嫩艾美耳球虫，具有较高的地克珠利耐药性检测准确性。该SNP分子标记的检测引物以及利用该引物结合PCR技术检测鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性的方法，其鉴定结果与笼饲实验的鉴定结果一致，可作为地克珠利耐药虫株筛选及检测的依据。同时该方法不需要特殊设备，无需大量的实验动物和大量新鲜球虫卵囊，且整个实验不受场地等因素限制，与传统的笼饲实验相比，具有耗时短，特异性强以及操作简单，成本低等优势，可广泛用于地克珠利耐药性检测。

附图说明

图1为本发明实施例2中16株分离地方虫株在EVM0004287基因166位点的多态性。

图2为本发明实施例2和4中15株实验室诱导虫株在EVM0004287基因166位点的多态性。

图3为本发明实施例3中PCR扩增产物的凝胶电泳结果，其中，泳道1为DNA marker，AL5000；泳道2为以表1中的序列为引物，以柔嫩艾美耳球虫基因组cDNA为模板的扩增产物。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

本发明下述实施例中，涉及的设备及试剂包括：

pEASY-Blunt Simple Cloning Vector和感受态细胞Trans5α购自北京全式金生物有限公司；

DNA分子标准量Marker购自北京艾德莱生物科技有限公司；

Q5高保真DNA聚合酶购自NEB公司；

TRIZOL购自赛默飞公司；

玻璃珠购自Sigma公司；

反转录试剂盒购自北京全式金有限公司；

PCR仪、37℃恒温摇床、37℃培养箱、凝胶成像仪、凝胶电泳仪为常规设备。

实施例1与鸡球虫地克珠利耐药性相关的SNP分子标记的获得

通过田间分离和实验室诱导共获得31株柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药虫株。

田间分离耐药株：从全国各地采集了64份不同地区的鸡球虫样本，经过鸡只扩繁，并通过选取耐药性评价指标相对卵囊产量(ROP)、最适抗球虫活性百分率(POAA)、病变记分减少率(RLS)和抗球虫指数(ACI)(参考：Lan L,Sun B,Zuo B,Chen X,Du A.Prevalenceand drug resistance of avian Eimeria species in broiler chicken farms ofZhejiang province.China Poult Sci.2017,96:2104–2109.毕菲菲,韩贞艳,郝振凯,于咏兰,索勋,刘贤勇.鸡球虫抗药性检测方法研究进展[J].中国兽医杂志.2019,55(06):69-71.)，获得16株地克珠利完全耐药虫株。但考虑这几株虫株属于混合虫株，为保证后续重测序分析的SNP准确性以及降低二代测序产生的随机误差，通过分离肠道内容物以及分离多孢子囊的技术将16株地克珠利耐药株中的耐药柔嫩艾美耳球虫分离出来，再进行鸡只扩繁，最终获得足量的对地克珠利具有耐药性状的16株分离地方虫株。

本实施例选取耐药性评价指标为相对卵囊产量(ROP)、最适抗球虫活性百分率(POAA)、病变记分减少率(RLS)和抗球虫指数(ACI)。

相对卵囊产量(Relative oocysts production,ROP)＝(感染给药组的平均卵囊产量/感染对照组的平均卵囊产量)×100％，ROP<15％，耐药检测结果为阴性(-)，ROP≥15％，耐药检测结果为阳性(+)。

最适抗球虫活性百分率(Percent of optimum anticoccidial activity,POAA)＝(感染给药组GSR-感染不给药组GSR)/(不感染不给药组GSR-感染不给药组GSR)×100％，其中GSR(Growth and survival ratio)＝组末均重/组初均重。POAA>50％，耐药检测结果为阴性(-)，POAA≤50％，耐药检测结果为阳性(+)。

病变记分减少率(Reduction of lesion scores,RLS)＝(感染不给药组的平均病变记分-感染给药组的平均病变记分)/感染不给药组的平均病变记分×100％，RLS≥50％，耐药检测结果为阴性(-)，RLS<50％，耐药检测结果为阳性(+)。

抗球虫指数(Anticoccidia indexes，ACI)＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值),ACI判定标准:≥180，完全敏感性；≤150，完全抗药性。

对鸡球虫耐药性进行评定时，结合上面提到的4种指标进行综合评定：4个指标均为耐药性阴性时，判断为对药物敏感；1个指标为阳性时，判断为轻度耐药；2个指标为阳性时，判定为中度耐药；3个或4个指标为阳性时判定为完全耐药。

实验室诱导耐药株：本实施例采用药物浓度递增的方法，以0.02ppm为起始诱导浓度，经过20代，最终获得15株对地克珠利耐药的柔嫩艾美耳球虫。

选取遗传背景相同且对地克珠利敏感的柔嫩艾美耳球虫豪顿株(E.tenellaHoughton(H)stain)作为母源虫株(Chapman HD，Shirley MW.The Houghton strain ofEimeria tenella:a review of the type strain selected for genomesequencing.Avian Pathol.2003，32(2):115-27.)，将该虫株的卵囊平分成20组，选用7-14日龄无球虫感染的AA肉鸡传代鸡球虫，每组每只无球虫鸡按照1×10

将上述31株地克珠利耐药株提取基因组后做二代高通量测序，测序深度为100×，将重测序的数据比对(BWA)到参考基因组(GCF_000499545.2_ETH001)上，结合GATK callSNP以及SnpEff注释基因等策略，注释突变基因。同时利用群体固化指数(Fst)杂合度(HP)两种参数将突变基因锚定在EVM0004287基因上。为了避免高通量测序产生的错误，利用高保真DNA聚合酶扩增的方法进一步验证EVM0004287基因扩增产物测序，发现球虫EVM0004287基因第166位的SNP位点，该SNP位点A对应于地克珠利敏感，该SNP位点C对应地克珠利耐药。

实施例2基于SNP分子标记检测用于重测序的样品的地克珠利耐药性

将用于重测序的实施例1中记载的16株分离地方虫株的EVM0004287基因分别导入APE软件中，通过序列比对发现，这16株分离地方虫株在166位点为C，而参考敏感株(WT)为A，即16株分离地方虫株在166位点多态性由A突变为C，都为耐药株。具体参见图1。其鉴定结果与笼饲实验的鉴定结果一致。

将用于重测序的实施例1中记载的15株实验室诱导虫株的EVM0004287基因分别导入APE软件中，通过序列比对发现，这15株实验室诱导虫株在166位点为C，而参考敏感株(WT)为A，即15株实验室诱导虫株在166位点多态性由A突变为C，都为耐药株。具体参见图2。其鉴定结果与笼饲实验的鉴定结果一致。

实施例3与鸡球虫地克珠利耐药性相关的SNP分子标记的检测引物设计

在引物设计和筛选过程中，由于柔嫩艾美耳球虫EVM0004287基因存在两段内含子序列，为了获得能够高效特异性扩增含有上述SNP位点的DNA片段，该模板应该为反转录的cDNA样品。针对这样的序列，引物设计也应针对cDNA。在EVM0004287基因的上、下游设计引物，经筛选，获得了能够高效特异扩增含有上述SNP位点的DNA片段的引物，并委托北京瑞博兴科生物技术有限公司合成引物，引物序列(SEQ ID NO.2和3)具体如下表1。

表1

以柔嫩艾美耳球虫基因组cDNA为模板，通过上述表1中的引物进行PCR扩增。

具体PCR反应体系及程序如下：

PCR反应体系：上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，dNTP溶液1μL，5×Reactionbuffer溶液10μL，Q5酶0.5μL，用去离子水补足50μL；

PCR反应程序：预变性98℃，时间30s；变性98℃，时间15s；退火温度65℃，时间30s；延伸温度72℃，时间30s；循环35次；最后72℃延伸10min。

经PCR扩增可得到表1所示长度的目标片段。结果见图3。实施例4SNP分子标记用于检测实验进化体系产生的地克珠利耐药性虫株与其母源虫株差异

利用实施例1获得的SNP分子标记及其扩增引物(SEQ ID NO.2和3)对实施例1中实验进化条件下产生的15株柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药虫株的地克珠利耐药性进行检测，具体方法如下：

1、DNA模板的制备

将最终浓度诱导的卵囊纯化后，每只鸡(13日龄AA肉鸡)接种2×10

具体方法如下：

在收集的二代裂殖子悬液中加入500μL CTAB缓冲液、40μL蛋白酶K，55℃金属浴消化2-3小时，期间数次颠倒混匀。加入40μL的RNA酶，37℃金属浴消化30min，期间颠倒混匀数次。加入等体积的CTAB溶液，剧烈震荡数次，1×10

于4℃，1×10

2、RNA模板制备及反转录

向二代裂殖子中加1mL TRIZOL，用移液枪反复吹打，直至裂殖子完全裂解，室温作用5min。加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，静置3min，4℃、12000rpm离心5min，取上层水相转至预冷的500μL异丙醇，沉淀水相中的RNA，静置10min；4℃、12000rpm离心15min，弃去上清，用75％乙醇洗涤沉淀，4℃、12000rpm离心15min，弃上清。挥发干净乙醇，按照沉淀量加入无酶无菌双蒸水，利用分光光度计测RNA浓度，-80℃冰箱保存RNA样品。

按照全式金试剂盒要求对RNA样品反转录，反转录体系如下表2。

表2反转录体系

3、PCR扩增

以步骤2得到的cDNA为模板，采用表1所示的引物进行PCR扩增，PCR反应体系及程序如下：

PCR反应体系：上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，dNTP溶液1μL，5×Reactionbuffer溶液10μL，Q5酶0.5μL，用去离子水补足50μL。

PCR反应程序：预变性98℃，时间30s；变性98℃，时间15s；退火温度65℃，时间30s；延伸温度72℃，时间30s；循环35次；最后72℃延伸10min。

4、PCR产物检测及连接转化后测序

PCR产物凝胶电泳检测：配置1.5％凝胶块，130V电压，电泳10min，凝胶成像。PCR产物大小为585bp。

切取条带后，回收并连接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，而后转化到感受态细胞Trans5α中，均匀涂布到含有20μg/ml的氨苄霉素的培养板中，于37℃培养箱中孵育过夜。挑取单克隆后，进行PCR鉴定，并选取阳性克隆委托北京瑞博兴科生物技术有限公司进行测序。

5、检测结果分析

将母源敏感虫株与诱导后的耐药虫株的PCR产物进行序列比对，结果如图2所示。结果显示，敏感虫株的EVM0004287基因的第166位为A，而耐药虫株则为C。将测序后的碱基序列通过软件翻译为氨基酸序列，结果显示，EVM0004287基因的第166位的A突变为C导致第56位氨基酸发生突变，敏感虫株的第56位氨基酸为丝氨酸，耐药虫株则为精氨酸。

实施例5基于SNP分子标记用于检测田间采集的混合鸡球虫样本的地克珠利耐药性

利用实施例1获得的SNP分子标记及其针对柔嫩艾美耳鸡球虫的扩增引物(SEQ IDNO.2和3)对采集自不同地区的12个艾美耳球虫混合样本(实验和分离方法参见：Geng T,YeC,Lei Z,Shen B,Fang R,Hu M,Zhao J,Zhou Y.Prevalence of Eimeria parasites inthe Hubei and Henan provinces of China.Parasitol Res.2021,120:655–663.)中柔嫩艾美耳球虫的地克珠利耐药性进行检测。先经形态学和PCR检测确认，12个混合样品中均含有柔嫩艾美耳球虫卵囊。之后，进一步进行基因组制备和PCR耐药性检测，具体方法如下：

1、DNA模板的制备

将孢子化后的12株田间混合鸡球虫样品接种于适龄(7-14日龄)的无球虫鸡，接种剂量5×10

卵囊孢子化48小时后，进行纯化。将含有卵囊的重铬酸钾倒入干净的离心管中，3600rpm，离心5min，倒出上层液体，用PBS重悬沉淀，重复2-3次；用饱和食盐水重悬沉淀，3600rpm离心5min，将上层含有卵囊的液体导入另一个干净的离心管中，加入5倍体积的PBS，3600rpm离心5min；倒出上清，然后用次氯酸钠溶液重悬沉淀，置于冰上，时间不超过5min为宜，3600rpm离心5min后，吸取上层含有卵囊的液体到另一干净的离心管中，加入5倍体积的PBS离心，重复3-5次，直至无次氯酸钠残留的气味，沉淀即是纯化后的卵囊。

将2mm的玻璃珠用(总体积约为3ml)PBS冲洗2-3遍，并倒入上述卵囊中，在旋涡振荡器上作用5-10min；吸取上层液体并转入干净的EP管中，4℃、12000rpm离心5-10min；弃去上清，加入500ml CTAB溶液和40μL蛋白酶K，55℃作用2小时；待温度降至37℃后，再加入20μL的RNA酶，并于37℃作用30min；待温度降至室温后，加入DNA提取液(酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1)，剧烈震荡30s，然后1000rpm离心5min；弃去上清，加入等体积的异丙醇，-20℃静止30min，然后4℃、12000rpm离心15min；弃去上清，加入1ml浓度为75％的乙醇溶液，离心30s，待乙醇挥发完全后，加入200μL ddH

2、RNA模板制备及反转录

具体步骤如实施例4的步骤2。

3、PCR扩增

反应条件及反应体系同实施例4。

4、PCR产物检测及连接转化后测序

PCR产物检测及连接转化后测序方法同实施例4。

5、检测结果分析

将步骤4获得的混合虫株的PCR产物进行序列比对。结果显示，12株田间分离混合虫株中有4株的EVM0004287基因存在第166的A到C的突变。结果如下表3所示。

将以上鉴定得到的4株突变型混合虫株和8株野生型混合虫株进行笼饲实验，耐药表型验证指标(参考：Lan L,Sun B,Zuo B,Chen X,Du A.Prevalence and drugresistance of avian Eimeria species in broiler chicken farms of Zhejiangprovince.China Poult Sci.2017,96:2104–2109.毕菲菲,韩贞艳,郝振凯,于咏兰,索勋,刘贤勇.鸡球虫抗药性检测方法研究进展[J].中国兽医杂志.2019,55(06):69-71.)和结果见表4。结果显示，突变型混合虫株具有地克珠利耐药性而野生型混合虫株不具有耐药性，可见SNP分子标记的检测结果与笼饲实验结果一致。由此可见，本发明基于SNP分子标记的PCR检测方法不仅可以用于纯种柔嫩艾美耳球虫的地克珠利耐药性检测，也可以很好地应用于临床样品(混合虫株)的检测。

表3敏感虫株、耐药虫株和混合群体的序列比对结果

表4 4株突变型混合虫株和8株野生型混合虫株耐药表型验证指标和结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 与鸡柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药性相关的SNP分子标记及其应用

<130> KHP211119781.1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgcaaga agactgccct actgacagtt ggctgcgtgc cgagtttgtt gggcgagcca 60

gccggcgagc agatgtgcaa catattgccg accaatgaag ctgaggcaaa gggaaacgaa 120

ggcaatcacg ttgcgggtct cccactgttc gacagaataa ctgttagcgg cgcaaataat 180

cgtgccgttg acgtgcaagc gtgccaggag ccctcaaagg ccacgactct cccggaatct 240

cccaagaaaa ctcattgttg tgcattctgt cataagctga agctttggaa agaaaaccga 300

atgacatctc ttaagaccta ccctctgcct gaaccagtac gaaatgaagc tacaccgaag 360

ggttgggaaa aattttgtcc ccccgtcgac agcagtctct ctgaaggcgc ctactgtgca 420

ggagaggata caaacaggaa ccttctccta caaaggccat cgtacgaagg tttcgtggtc 480

agccaaacag ctggttccgt ggccaccacc gttattgtat tagggattat cgagcttgaa 540

gtaaaaggag atgatcattg gctgactgag tatcgacaat gctga 585

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcgcaaga agactgccct act 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcagcattgt cgatactcag tcag 24