一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的引物组及其应用

摘要

本发明公开了一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的引物组及其应用，属于分子生物学技术领域。该引物组的序列如SEQ ID NO.1‑85所示，利用上述引物组对样本进行处理的步骤如下：(1)样本DNA提取；(2)富集扩增；(3)消化反应；(4)延伸反应；样本经过上述处理后可直接用于核酸质谱检测，并可获得较高的符合率。本发明的检测范围涵盖26种分枝杆菌特异性区间和一个分枝杆菌的高度保守的检测区间，可以同时检测出26种分枝杆菌；此外分枝杆菌的高度保守的检测区间，即可以作为阳性结果的质控，又可以检测出26种分枝杆菌外的其他分枝杆菌，提示有分枝杆菌感染。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的引物组及其应用。

背景技术

结核病是一种严重威胁人类健康的慢性呼吸道传染病。2017年WHO报道，2016年全球约有170万人死于结核病，新增患者1040万人。如果能够早期诊断结核病并且得到有效的治疗，大多数结核病患者能够免于死亡。虽然在2000年至2016年间，有约5300万诊断为结核病的患者通过治疗而被治愈，但是这仍与被检测出的结核病患者在数量上相差很大。

结核是常见并可致命的一种传染病，由分枝杆菌又称结核杆菌导致。结核通常感染并破坏肺以及淋巴系统，但其它器官如脑、中枢神经系统、循环系统、泌尿系统、骨骼、关节、甚至皮肤亦可受感染。其他的分枝杆菌，如牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、田鼠分枝杆菌亦可引起结核，但通常不感染健康成人。抗生素类药物是治疗结核病的主要手段，随着抗生素的广泛使用导致了耐药菌株的出现，特别是耐多药结核菌和广泛耐药结核菌的流行和传播引起了全球各国学者的极大关注。

在临床实验室检测分枝杆菌时，常用方法包括涂片法、培养法等传统的检测方法。但传统的检测方法已经不能准确、全面地判断病人的患病信息。如敏感性差，对于肿瘤和血液病患者，50％的血培养阴性最终发现侵袭性念珠菌感染；阳性培养结果仅反映真菌存在，不能区分定植和感染；培养周期长；某些样本难以获得等问题。因此，有必要建立快速、敏感、特异的理想诊断方法。

基质辅助光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术，是20世纪80年代末问世并迅速发展起来的一种质谱分析技术。MALDI-TOF-MS技术是一种新型的软电离生物分子质谱分析平台，通过激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量并传递给生物分子，促使生物分子电离并在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间来直接测算生物大分子的分子量，准确识别延伸引物是否连接上特定的碱基，进而准确分析样本中的特定基因位点信息。MALDI-TOF-MS技术具有灵敏度高、检测速度快、样本用量少、高通量等特点，可作为分枝杆菌菌种鉴定和耐药突变检测的诊断方法。

发明内容

本发明提供了一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的样本处理方法，其包括以下步骤：

1)根据专家共识和文献资料，确定常见的26种分枝杆菌作为检测目标，并根据流行病学将其分成2个pool，分开检测。Pool 1可以鉴定9种结合分枝杆菌，包含结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌；Pool 2可以鉴定剩余17种结合分枝杆菌，包含耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、猪分枝杆菌、土分枝杆菌、不产色分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、瘰疬分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、草分枝杆菌、次要分枝杆菌、胃分枝杆菌、母牛分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、新金色分枝杆菌、金色分枝杆菌。

2)根据文献资料，初步确立分枝杆菌的特异性基因，涉及16S、ITS1、gyrA、rpoB、gyrB、IS6110、IS1311、gnd、dnaA、dnaJ。为了保证方法的准确性，需要尽可能多的从NCBI数据库下载到分枝杆菌的上述基因序列，同时下载部分非分枝杆菌的同源基因作为对照序列。使用clustalx软件对下载的基因序列进行同源性比对，寻找不同分枝杆菌各自的特异性区间和位点，用于扩增引物和延伸引物的设计。例如gyrA基因同源性比对结果(参见图1)显示瘰疬分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、胃分枝杆菌、浅黄分枝杆菌七种分枝杆菌的gyrA基因比其他同源基因相比，在gyrA基因的5’端多出一段特异性的序列，可以作为扩增引物和延伸引物的设计区间。考虑到后续引物设计的不确定性，不能保证每个特异性区间都适合设计引物，还要考虑不同引物之间的引物二聚体，所以在筛选特异性的序列时，每种分枝杆菌应至少寻找到两个合适的特异性区间。

3)除了上述每种分枝杆菌的特异性区间外，还需要增加两个质控片段，一个是人类基因组片段，检测样本携带有人基因组背景，新增一个人类基因组检测区间可以用于质控样本的质量和实验操作流程；一个是分枝杆菌的高度保守的检测区间，即可以作为阳性结果的质控，又可以检测出26种分枝杆菌外的其他分枝杆菌，提示有分枝杆菌感染。

4)基于每个检测区间进行扩增引物和延伸引物的设计。引物设计过程中特异性区间少的分枝杆菌优先设计，两个质控片段放在最后。设计引物的过程中要保证引物3’端和延伸碱基的特异性，设计出来的引物要跟前面设计好的引物进行引物二聚体分析，可以借助Multiple PrimerAnalyzer程序进行多重引物分析，存在严重的引物二聚体或引物3’端非特异性结合现象就剔除，重新设计。

5)以临床样本和国家参考品为模板，对设计好的扩增引物和延伸引物进行筛选和验证。其中扩增引物以毛细管电泳技术为检测方法，检测是否存在目的扩增片段，是否有明显的非特异片段；延伸引物则以核酸质谱技术为检测方法，检测是否存在目的延伸产物，是否有非特异延伸，最终确认的引物序列如下：

所述一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的样本处理方法对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品、痰液样品、细胞样品DNA同样的扩增和检测能力。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明基于基质辅助光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术，能够同时进行26种分枝杆菌菌种鉴定。

(1)本发明基于核酸质谱平台，整体流程包含三轮PCR扩增和最终的质谱上机检测。仅需简单的加样、离心的操作即可完成PCR扩增流程，而质谱上机检测流程则由仪器自动化检测，因此本发明操作简便，手动操作时间短，当天即可得到检测结果；

(2)本发明的检测范围涵盖26种分枝杆菌特异性区间和一个分枝杆菌的高度保守的检测区间。可以同时检测出26种分枝杆菌；此外分枝杆菌的高度保守的检测区间，即可以作为阳性结果的质控，又可以检测出26种分枝杆菌外的其他分枝杆菌，提示有分枝杆菌感染。

(3)本发明从原料筛选开始，构建了一套适用于核酸质谱平台的检测体系，降低检测成本。

附图说明

图1为gyrA基因同源性比对结果图。

图2a为实施例1中最低检出量参考品S1的检测结果图。

图2b为实施例1中最低检出量参考品S2的检测结果图。

图2c为实施例1中最低检出量参考品S3的检测结果图。

图2d为实施例1中最低检出量参考品S4的检测结果图。

图3a为实施例3样本15ng/μL浓度梯度的检测结果图。

图3b为实施例3样本12ng/μL浓度梯度的检测结果图。

图3c为实施例3样本11ng/μL浓度梯度的检测结果图。

图3d为实施例3样本10.5ng/μL浓度梯度的检测结果图。

具体实施方式

实施例1

本实施例通过国家参考品《结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品》验证方法的检测性能。

1、样本提取

《结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品》一共包含15支阳性参考品、15支阴性参考品、10支精密性参考品、4支最低检出量参考品，共44支参考品。使用美基的通用型DNA抽提试剂盒进行样本提取。由于细菌含量较少，样本不需要进行浓度测定，直接使用核酸原液进行检测。

2、反应液配制

依据配方表配置富集反应液、消化反应液、延伸反应液；其中PCR缓冲液(pH7.5)含有100mM(NH

表1每人份富集反应液1配方

表2每人份富集反应液2配方

表3每人份消化反应液配方

表4每人份延伸反应液1配方

表5每人份延伸反应液2配方

3、富集扩增

按照“3μL的富集反应液+0.05μL的Taq酶”的比例各配置46人份的富集反应体系1和富集反应体系2，混匀离心后按照每人份3μL的体积分装至96孔板中；

加有富集反应体系1的反应孔标记Pool1，加有富集反应体系2的反应孔标记Pool2，每个参考品需分别取2μL核酸原液加入到标记Pool1和Pool2的反应孔中，每两孔检测一份样本；

贴上封膜后快速离心，注意避免气泡；将96孔板放入PCR仪反应槽中，打开PCR仪设置界面，按照下表设置扩增程序，执行PCR扩增。

表6富集反应PCR扩增程序

4、消化反应

按照“1.5μL的消化反应液+0.5μL的SAP酶”的比例分别配置92人份的消化反应体系，混匀后快速离心待用；

取出上一步反应结束的96孔板，快速离心后轻轻揭开封膜，往每个反应孔中依次加入2μL上述消化反应体系；

贴上封膜后快速离心，注意避免气泡；将96孔板放入PCR仪反应槽中，打开PCR仪设置界面，按照下表设置扩增程序，执行PCR扩增。

表7消化反应PCR扩增程序

5、延伸反应

按照“2.8μL的延伸反应液+0.25μL的UEP酶”的比例分别配置46人份的延伸反应体系1和延伸反应体系2，混匀后快速离心待用；

取出上一步反应结束的96孔板，快速离心后轻轻揭开封膜，往标记Pool1的反应孔中依次加入3μL延伸反应体系1，往标记Pool2的反应孔中依次加入3μL延伸反应体系2；

贴上封膜后快速离心，注意避免气泡；将96孔板放入PCR仪反应槽中，打开PCR仪设置界面，按照下表设置扩增程序，执行PCR扩增。

表8延伸反应PCR扩增程序

6、上机检测

反应结束后取出96孔板，快速离心后轻轻揭开封膜，往每个反应孔中依次加入40μL无核酸酶水，吹打混匀，避免产生气泡；

将96孔板转移至DR MassARRAY全自动化系统上，进行上机检测分析；

仪器运行结束后，打开“Typer 4.0”软件，通过质谱仪自带分析软件“TyperAnalyzer”，对结果进行判读，若某一单碱基延伸引物出现产物峰且转化效率大于0.2时，则对应的菌种类型判读为阳性；否则判读为阴性。

7、结果分析

检测结果参见表9，其中15支阳性参考品检测结果均为结核分枝杆菌阳性，检测结果一致；阴性参考品N1～N10均为分枝杆菌，除了N3施氏分枝杆菌和N5亚洲分枝杆菌为检测范围外样本仅检测出为分枝杆菌属，其余8个分枝杆菌均检测出对应的菌种类型，检测结果一致；阴性参考品N11～N15为非分枝杆菌样本，检测结果均为阴性，检测结果一致；10支精密性参考品检测结果均为结核分枝杆菌阳性，检测CV值为3.21％，检测结果符合要求；4支最低检出量参考品中只有S1和S2检测结果为结核分枝杆菌阳性(参见图2a-2d)；表明最低检出量为10

表9结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品检测结果汇总

实施例2

本实施例收集100例疑似肺结核患者痰液样本，将本发明方法与结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(艾康生物技术(杭州)有限公司)进行双盲比较，验证本发明方法的临床性能。

1、本发明方法检测

使用美基的通用型DNA抽提试剂盒对临床痰液剩余样本进行核酸提取。由于痰液样本中的DNA含量较低，样本不需要进行浓度测定，直接取原液进行检测。

依据配方表1-5配置富集反应液、消化反应液、延伸反应液。

按照“3μL的富集反应液+0.05μL的Taq酶”的比例配置出富集反应体系，并分别取2μL核酸原液加入到富集反应体系中，每两孔检测一份样本。按照表6设置扩增程序，进行富集扩增。

按照“1.5μL的消化反应液+0.5μL的SAP酶”的比例分别配置消化反应体系，取2μL加入到富集扩增产物中，按照表7设置扩增程序，进行消化反应。

按照“2.8μL的延伸反应液+0.25μL的UEP酶”的比别配置延伸反应体系；并分别取3μL加入到消化产物中。按照表8设置扩增程序，进行单碱基延伸反应。

反应结束后取出96孔板，快速离心后轻轻揭开封膜，往每个反应孔中依次加入40μL无核酸酶水，吹打混匀，避免产生气泡；

将96孔板转移至DR MassARRAY全自动化系统上，进行上机检测分析；

仪器运行结束后，打开“Typer 4.0”软件，通过质谱仪自带分析软件“TyperAnalyzer”，对结果进行判读，若某一单碱基延伸引物出现产物峰且转化效率大于0.2时，则对应的菌种类型判读为阳性；否则判读为阴性。

2、对比方法检测

依据试剂盒的说明书对临床痰液剩余样本进行核酸提取，取4μL核酸提取的上清液加入到PCR反应体系中，按照表10设置扩增程序，进行荧光PCR扩增。

表10荧光PCR扩增程序

7、结果分析

100例痰液样本中本发明方法检测出了结核分枝杆菌阳性样本37例，非结核分枝杆菌阳性样本5例，阴性样本58例；对照试剂盒检测出了结核分枝杆菌阳性样本38例，阴性样本62例。两个检测结果进行一致性分析，阳性符合率为97.4％、阴性符合率为92.0％、总符合率为94％，Kappa值为0.88≥0.75，总体一致性好。

检测结果不一致的样本中，其中有5例样本本发明方法检测结果为非结核分枝杆菌阳性，对比试剂的检测结果为阴性，通过一代测序验证确认为3例胞内分枝杆菌、1例鸟分枝杆菌、1例脓肿分枝杆菌，与本发明方法检测结果相一致；另外1例不一致样本可能是由于痰液样本中菌浓度偏低，导致分样时各管取样的菌量有随机误差。

表11检测结果对比表

实施例3

1、样本提取

本实施例收集3例临床结核分枝杆菌阳性的石蜡包埋组织样本，考察同一样本不同浓度的检测结果，验证本发明方法的石蜡包埋组织样本加样量。

使用美基的石蜡切片DNA提取试剂盒对石蜡包埋组织样本进行核酸提取。所提取的样本DNA使用紫外分光光度计测定样本纯度，要求OD

2、扩增反应

依据配方表1-5配置富集反应液、消化反应液、延伸反应液。

按照“3μL的富集反应液+0.05μL的Taq酶”的比例配置出富集反应体系，并分别取2μL核酸原液加入到富集反应体系中，每两孔检测一份样本。按照表6设置扩增程序，进行富集扩增。

按照“1.5μL的消化反应液+0.5μL的SAP酶”的比例分别配置消化反应体系，取2μL加入到富集扩增产物中，按照表7设置扩增程序，进行消化反应。

按照“2.8μL的延伸反应液+0.25μL的UEP酶”的比别配置延伸反应体系；并分别取3μL加入到消化产物中。按照表8设置扩增程序，进行单碱基延伸反应。

3、上机检测

反应结束后取出96孔板，快速离心后轻轻揭开封膜，往每个反应孔中依次加入40μL无核酸酶水，吹打混匀，避免产生气泡；

将96孔板转移至DR MassARRAY全自动化系统上，进行上机检测分析；

仪器运行结束后，打开“Typer 4.0”软件，通过质谱仪自带分析软件“TyperAnalyzer”，对结果进行判读，若某一单碱基延伸引物出现产物峰且转化效率大于0.2时，则对应的菌种类型判读为阳性；否则判读为阴性。

4、结果分析

检测结果显示临床样本1和样本3在0.5ng/μL的条件下，只检测出了人基因组内参产物峰，没有结核分枝杆菌的产物峰，检测结果为阴性(参见图3a-3d)，表明样本浓度越低，单位体积中存在的结核分枝杆菌阳性拷贝数越低，当阳性拷贝数低于试剂盒检测下限时，就会出现假阴性结果。同时当样本浓度高达10ng/μL的情况下，大量的人基因组背景并不会影响样本的检测结果，3个样本均检测出结核分枝杆菌阳性。因此，在使用本发明方法对石蜡包埋组织样本进行检测时，应尽量提高样本的上样浓度，建议浓度为5～10ng/μL。

表12石蜡包埋组织样本检测结果统计

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 厦门飞朔生物技术有限公司

<120> 一种基于核酸质谱技术检测分枝杆菌的引物组及其应用

<130> 2021.8.3

<141> 2021-09-07

<160> 85

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

actggtaatg acacataggt gaggtctgct 30

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

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<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

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<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

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<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

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<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

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<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

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<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

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<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

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<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

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<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<210> 16

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<210> 20

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<213> 人工序列()

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<212> DNA

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<212> DNA

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gaatatccaa ctcgttcagc ac 22

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<212> DNA

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cgtcagcaaa gaatttatag cc 22

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<212> DNA

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gccggcatct ccaaa 15

<210> 32

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<213> 人工序列()

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<212> DNA

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<213> 人工序列()

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<210> 38

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acgttggatg gttgtggata gtggttgcga 30

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<213> 人工序列()

<400> 45

acgttggatg acagttgtcg taggtctgga 30

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

acgttggatg ggggagtttt cgtgacttct 30

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

acgttggatg ggtgaggcaa catctctgtt 30

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

acgttggatg ggttgggctt tgagacaaca 30

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

acgttggatg acaatggcac cagacctatg 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

acgttggatg caccacaccc cacaccaaaa 30

<210> 51

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

acgttggatg gcgaacaaca acaagcttgc 30

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 52

acgttggatg aacttgggcc ctgagacaac 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 53

acgttggatg acgtgtgccc agcacaaaag 30

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 54

acgttggatg ctggcacatc aatttgtccg 30

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 55

acgttggatg tcgcaaccac tatccaatac 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 56

acgttggatg gttcttggtg cggttgatgt 30

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 57

acgttggatg tcgaaaaatg ggctggtgcc 30

<210> 58

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 58

acgttggatg agtcaacgcg ctttcgacc 29

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 59

acgttggatg ccagcgtacc tttcactatc 30

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 60

acgttggatg gacaaacgtt tgatgcggtg 30

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 61

acgttggatg cttgcgagca tctgaatgca 30

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 62

acgttggatg acggtcttct tcgtcttctc 30

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 63

acgttggatg gtctcgaagt cgtactgtgt 30

<210> 64

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 64

acgttggatg cgatccgagt ggttccaga 29

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 65

acgttggatg ctccgaacca gaatcgcttc 30

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 66

acgttggatg acctaatacc ggataggacc 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 67

acgttggatg gagactgcat gcgagtatca 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 68

acgttggatg tgatgtcgtt gagcttgctg 30

<210> 69

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 69

ctcatcccac accgc 15

<210> 70

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 70

gttcctgcag ccggcg 16

<210> 71

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 71

gctcgaggcc gacatata 18

<210> 72

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 72

tgaatcgcgg ccggcaacc 19

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 73

atatggacac cacttcaacc 20

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 74

ctatctctgt tggtttcggg 20

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 75

ccccatgagg caacacgctt t 21

<210> 76

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 76

ttactgtgtg gtttcgaaga t 21

<210> 77

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 77

aacggccagg agtccttggg gg 22

<210> 78

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 78

tcaacggccg gcagccacac tct 23

<210> 79

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 79

agcagaaaaa tttgcattac ataaaa 26

<210> 80

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 80

gaccatgggg cccacc 16

<210> 81

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 81

cgcaaaggtg agccg 15

<210> 82

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 82

ccctgcagtc ctcgacacg 19

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 83

ccccctgccg ggcaccgagt 20

<210> 84

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 84

ctacctttca ctatcccggt ggct 24

<210> 85

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 85

agtatcagaa aaatttgcat taca 24