一种莫西沙星母核中有关物质的检测方法

摘要

本发明涉及药物分析技术领域，具体公开一种莫西沙星母核中有关物质的检测方法。按照下述高效液相色谱条件进行检测：色谱柱：Welch UltimateXB‑Phenyl，4.6mm*250mm，5μm；流动相A：四丁基硫酸氢铵‑磷酸二氢钾的混合水溶液，pH为1.8‑2.1；流动相B：甲醇；检测波长286‑300nm，柱温：43‑50℃，梯度洗脱。采用本发明提供的方法实现了莫西沙星母核中6,8‑二甲氧基杂质、8‑乙氧基杂质、6‑甲氧基‑8‑氟杂质、杂质1、杂质M‑279五种杂质的有效检测，准确定性及定量检测莫西沙星母核中的杂质情况，从而有利于提高莫西沙星产品用药的临床安全性和有效性。

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种莫西沙星母核中有关物质的检测方法。

背景技术

莫西沙星是第四代喹诺酮类药物的重要代表，由拜耳公司研制，于1999年在德国首次上市，同年12月在美国上市；2002年9月在我国上市，包括片剂和输液剂两类。莫西沙星是一种具有广谱抗菌活性和杀菌作用很强的8-甲氧基氟喹诺酮类抗菌药，对革兰阳性菌，革兰阴性菌，厌氧菌，抗酸菌和非典型微生物如支原体，衣原体和军团菌等均有抗菌活性，具有较高的临床有效性和安全性。由于其优良的产品特性，在临床使用中颇受欢迎，用药量增长迅速。

环丙基-6,7-二氟-1,4-二氢-8-甲氧基-4-氧代喹啉-3-羧酸乙酯(简称莫西沙星母核)是莫西沙星合成的重要原料之一，其质量控制直接影响莫西沙星的合成质量。目前，仅有检测莫西沙星中其母核物质含量的相关文献报道。对于莫西沙星母核中有关物质检测的研究还未见报道。为了更好地监控莫西沙星产品的质量，保证莫西沙星产品质量的一致性和稳定性，有必要研发一种操作简便的莫西沙星母核中有关物质的检测方法。

发明内容

针对现有技术中不能对莫西沙星母核物质中有关物质进行有效检测的问题，本发明提供一种莫西沙星母核中有关物质的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种莫西沙星母核中有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：

色谱柱：Welch Ultimate XB-Phenyl，4.6mm*250mm，5μm；

流动相A：四丁基硫酸氢铵-磷酸二氢钾的混合水溶液，其中，所述混合水溶液的pH为1.8-2.1；

流动相B：甲醇；

柱温：43℃-50℃；

UV检测器，检测波长：245nm-255nm；

梯度洗脱，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

0min，65％-75％流动相A，35％-25％流动相B；

46min，65％-75％流动相A，35％-25％流动相B；

46.1min，30％流动相A，70％流动相B；

56min，65％-75％流动相A，35％-25％流动相B。

相对于现有技术，本发明提供的莫西沙星母核中有关物质的检测方法，采用WelchUltimate XB-Phenyl，4.6mm*250mm，5μm色谱柱，通过特定的流动相，以特定的梯度洗脱方式，实现了莫西沙星母核中6,8-二甲氧基杂质、8-乙氧基杂质、6-甲氧基-8-氟杂质、杂质1、杂质M-279五种杂质与莫西沙星母核主成分之间的有效分离，准确定性及定量检测莫西沙星母核中的杂质情况。且本发明提供的方法经专属性、灵敏度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏、准确、重现性较好，能够用更为简便的方法实现对莫西沙星母核中有关物质的定性和定量检测，从而为提高和更好地控制莫西沙星药品的质量提供有效保障，有利于保证莫西沙星产品质量的一致性和稳定性，从而有利于提高莫西沙星产品用药的临床安全性和有效性。

本发明中所述有关物质是指莫西沙星母核中的潜在杂质6,8-二甲氧基杂质、8-乙氧基杂质、6-甲氧基-8-氟杂质、杂质1和杂质M-279，各已知杂质的结构式如下。

优选的，流动相A中，每1L所述混合水溶液中含有四丁基硫酸氢铵0.45g-0.55g，磷酸二氢钾0.8g-1.2g。

进一步优选的，流动相A中，每1L所述混合水溶液中含有四丁基硫酸氢铵0.50g，磷酸二氢钾1.0g，所述混合水溶液的pH为2.0。

优选的流动相在不产生基线干扰的前提下，能够更好地分离莫西沙星母核中的杂质，利于有关物质的检出，并且有效改善峰形，使检测结果的准确度及精密度更高。

优选的流动相的pH值，可以减少谱带拖尾，改善峰形，从而有利于提高各组分之间的分离度。

优选的，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：

0min，72％流动相A，28％流动相B；

46min，72％流动相A，28％流动相B；

46.1min，30％流动相A，70％流动相B；

56min，72％流动相A，28％流动相B。

优选的梯度洗脱顺序，可以提高主成分与杂质峰之间的分离度和检测的灵敏度，使检测结果定量准确，且精密度高。

优选的，检测波长为250nm。

优选的，柱温为45℃。

优选的，流速为1.2mL/min-1.4mL/min。

进一步优选的，流速为1.3mL/min。

优选的，进样体积为10μL。

优选的检测条件可使莫西沙星母核中各杂质之间达到更高的分离度，可以保证各种杂质的有效检出，从而达到有效准确控制莫西沙星母核中有关物质含量的目的。

优选的，供试品溶液的浓度为1.0mg/mL。

优选的，供试品溶液的制备方法为：取莫西沙星母核供试品用溶剂配制成浓度约为1.0mg/mL的供试品溶液。

优选的供试品浓度有利于使主成分及杂质的峰形更好，柱效高，积分更准确，从而有利于对供试品中杂质的含量进行更准确的计算。

优选的，系统适用性溶液的制备方法为：将6,8-二甲氧基杂质对照品、8-乙氧基杂质对照品、6-甲氧基-8-氟杂质对照品、杂质1对照品、杂质M-279对照品和莫西沙星母核对照品适量，用溶剂配制成每1mL中各杂质约含1μg和莫西沙星母核约含1mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

可选的，所述溶剂为乙腈。

本发明提供的检测方法，能够实现莫西沙星母核中的6种已知杂质和主成分之间的有效分离，准确定性及定量检测莫西沙星母核原料中杂质情况，有利于对莫西沙星母核原料的质量进行有效控制，从而保证莫西沙星产品的质量，具有较高的实用价值。

附图说明

图1为实施例1中1.3项下使用赛默飞Hypersil Gold PFP色谱柱检测系统适用性溶液的色谱图；

图2为实施例1中1.3项下使用Kromasil 100-5-Phenyl色谱柱检测系统适用性溶液的色谱图；

图3为实施例1中1.3项下使用YMC Triare Phenyl色谱柱检测系统适用性溶液的色谱图；

图4为实施例2中系统适用性项下的系统适用性溶液的色谱图；

图5为实施例2中系统适用性项下的空白溶剂的色谱图；

图6为对比例1中系统适用性溶液的色谱图；

图7为对比例2中系统适用性溶液的色谱图；

图8为对比例3中系统适用性溶液的色谱图；

图9为对比例4中系统适用性溶液的色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1.1材料与方法：

仪器：高效液相色谱仪，紫外检测器，量瓶，电子天平。

试剂：乙腈、磷酸二氢钾、四丁基硫酸氢铵、莫西沙星母核对照品(含量99.5％)，6,8-二甲氧基杂质对照品(含量98.6％)、8-乙氧基杂质对照品(含量98.99％)、6-甲氧基-8-氟杂质对照品(含量99.88％)、杂质1对照品(含量99.74％)、杂质M-279对照品(含量98.6％)。

本发明中所用乙腈为市售色谱纯，磷酸二氢钾为市售分析纯，四丁基硫酸氢铵为色谱级。杂质对照品和莫西沙星母核对照品均为市售产品。

1.2溶液的配制

(1)空白溶剂：乙腈。

(2)系统适用性溶液：精密称取6,8-二甲氧基杂质对照品、8-乙氧基杂质对照品、6-甲氧基-8-氟杂质对照品、杂质1对照品、杂质M-279对照品和莫西沙星母核对照品适量，用乙腈溶解并稀释制成每1mL中各杂质约含1μg、莫西沙星母核约含1mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

(3)精密称取6,8-二甲氧基杂质对照品、8-乙氧基杂质对照品、6-甲氧基-8-氟杂质对照品、杂质1对照品、杂质M-279对照品各适量，分别加乙腈溶解并稀释制成每1mL约含各组分1μg的溶液，作为各杂质定性对照品溶液。

(4)供试品溶液：精密称取取莫西沙星供试品，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液。

(5)自身对照溶液：精密量取上述供试品溶液，用乙腈稀释制成每1mL中约含1μg的溶液，作为自身对照溶液。

1.3色谱柱的选择

在实验前期发明人尝试了多种方法，对上述系统适用性溶液进行检测，使用赛默飞Hypersil Gold PFP(4.6*250mm，5μm)、Kromasil 100-5-Phenyl(4.6*250mm，5μm)、YMCTriare Phenyl(4.6*250mm，5μm)色谱柱均无法实现五种已知杂质与主峰的有效分离(分离度达不到1.5)。发明人意外的发现Welch Ultimate XB-Phenyl(4.6*250mm，5μm)色谱柱可实现各色谱峰之间的有效分离，分离度和峰形良好，满足检测的要求，因此，选择此色谱柱作为检测莫西沙星母核中有关物质的色谱柱。

使用赛默飞Hypersil Gold PFP(4.6*250mm，5μm)的检测图谱如图1所示，从图1中可以看出杂质1与主成分完全重合，不能实现莫西沙星母核中有关物质的有效检测。图中从左向右依次是杂质M-276、杂质1与莫西沙星母核的重合峰、6,8-二甲氧基杂质、6-甲氧基-8-氟杂质和8-乙氧基杂质。

使用Kromasil 100-5-Phenyl(4.6*250mm，5μm)色谱柱的检测图谱如图2所示，从图2中可以看出，杂质M-276、杂质1、莫西沙星母核的重合峰、6,8-二甲氧基杂质、6-甲氧基-8-氟杂质五种物质无法有效分离。图中从左向右依次是杂质M-276，杂质1、莫西沙星母核、6,8-二甲氧基杂质、6-甲氧基-8-氟杂质的四种物质的重合峰，8-乙氧基杂质。

使用YMC Triare Phenyl(4.6*250mm，5μm)色谱柱的检测图谱如图3所示，从图3中可以看出，莫西沙星母核、6,8-二甲氧基杂质、6-甲氧基-8-氟杂质无法有效分离。图中从左向右依次是杂质M-276、杂质1、莫西沙星母核、6,8-二甲氧基杂质、6-甲氧基-8-氟杂质和8-乙氧基杂质。

使用Welch Ultimate XB-Phenyl(4.6*250mm，5μm)色谱柱的检测图谱如图4所示，从图中可以看出各杂质与主成分分离度良好，满足有关物质的检测要求。

1.4莫西沙星母核中有关物质的检测方法：

色谱柱：Welch Ultimate XB-Phenyl，4.6mm*250mm，5μm；

流动相A：四丁基硫酸氢铵-磷酸二氢钾的混合水溶液(取四丁基硫酸氢铵0.5g，磷酸二氢钾1.0g，加水1000mL，磷酸调节pH至2.0)；

流动相B：甲醇；

检测波长：250nm；

流速：1.3mL/min；

进样体积：10μL；

柱温：45℃；

梯度洗脱，洗脱程序如下：

计算方法：自身对照法计算杂质含量。

计算公式：

A

A

F：该杂质的校正因子。

校正因子测定：

由主成分与各杂质的线性回归方程计算各杂质的校正因子F，计算公式如下：杂质校正因子＝主成分斜率/杂质斜率。

实施例2

方法学验证：

2.1系统适用性

取空白溶剂(乙腈)、上述系统适用性溶液、自身对照溶液和各杂质定性对照品溶液各10μL，分别按照上述条件进行高效液相色谱检测，记录色谱图，空白溶剂和系统适用性溶液的色谱图如图4-图5所示，结果如表1所示。

表1系统适用性试验结果

试验结果表明，基线平稳无干扰，8-乙氧基杂质、6-甲氧基-8-氟杂质、杂质1、杂质M-279、6,8-二甲氧基杂质、莫西沙星母核相互间无干扰，最小分离度1.9，系统适用性溶液中各杂质的保留时间与单独杂质定位溶液的保留时间一致，表明本方法专属性良好，适合有关物质的检查。

2.2检测限和定量限

精密量取莫西沙星母核对照品、6,8-二甲氧基杂质对照品、6-甲氧基-8-氟杂质对照品、8-乙氧基杂质对照品、杂质1对照品和杂质M-279杂质对照品各适量，溶解稀释配制成浓度为9.98μg/mL、9.81μg/mL、9.65μg/mL、11.39μg/mL、10.11μg/mL和9.52μg/mL的混合溶液，然后梯度稀释成系列溶液，按上述确定的色谱条件进行测定，信噪比为3：1时为检测限，信噪比为10:1时为定量限。将定量限溶液连续进样6次，计算峰面积的RSD值，检测结果如表2-表3所示。

表2检测限定量限测定结果

表3定量限重复进样峰面积测定结果

结果表明，杂质M-279定量限为0.190μg/mL，检测限为0.057μg/mL(0.006％)；莫西沙星母核定量限为0.200μg/mL，检测限为0.060μg/mL；杂质1定量限为0.202μg/mL，检测限为0.061μg/mL(0.006％)；6,8-二甲氧基杂质定量限为0.196μg/mL，检测限为0.059μg/mL(0.006％)；6-甲氧基-8-氟杂质定量限为0.193μg/mL，检测限为0.058μg/mL(0.006％)；8-乙氧基杂质定量限为0.228μg/mL，检测限为0.068μg/mL(0.007％)。定量限6次重复结果RSD最大为9.3％，以上结果表明该方法灵敏度高。

2.3线性范围

精密量取莫西沙星母核对照品、6,8-二甲氧基杂质对照品、6-甲氧基-8-氟杂质对照品、8-乙氧基杂质对照品、杂质1对照品和杂质M-279杂质对照品各适量，分别溶解稀释配制成浓度为9.98μg/mL、9.81μg/mL、9.65μg/mL、11.39μg/mL、10.11μg/mL和9.52μg/mL的混合溶液，然后分别精密量取混合溶液0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL，加入到10mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，取各溶液按上述色谱条件检测，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，各杂质浓度为横坐标，作莫西沙星母核和各杂质的线性回归曲线。结果如表4-表9所示。

表4莫西沙星母核线性试验结果

表5杂质M-279线性试验结果

表6杂质1线性试验结果

表7 6,8-二甲氧基杂质线性试验结果

表8 8-乙氧基杂质线性试验结果

表9 6-甲氧基-8-氟杂质线性试验结果

结果表明，母核在0.14μg/mL～1.20μg/mL间，浓度与峰面积线性关系良好，R

根据上述线性结果计算各杂质的校正因子，结果如表10所示。

表10校正因子结果

结果表明杂质M279、杂质1和8-乙氧基杂质校正因子均在0.9-1.1之间，因此，可采用不加校正因子的主成分自身对照法计算。6,8-二甲氧基杂质和6-甲氧基-8-氟杂质的校正因子均为0.7，如采用不加校正因子的主成分自身对照法控制，会严于加校正因子主成分自身对照法，因此，也采用不加校正因子的主成分自身对照法。因此，本发明采用自身对照法计算杂质含量。

2.4重复性

取莫西沙星母核，平行配制六份浓度约为1.0mg/mL的溶液，作为供试品溶液，按照上述液相色谱条件进样检测，记录色谱图，分别计算6份样品中杂质的含量及RSD值，结果如表11所示。

表11重复性试验结果

试验结果表明，同批样品配制6份溶液，各杂质含量通过自身对照法计算结果，RSD均小于10.0％，表明本法重复性良好。

2.5准确度

称取莫西沙星母核250mg，加入25mL容量瓶中，加乙腈溶解，作为母液。

分别量取上述母液1mL、2.3线性试验项下的混合溶液1mL，加入10mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，平行配制三份，作为高浓度回收率溶液。另取上述母液1mL、2.3线性试验项下的混合溶液0.5mL，加入10mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，平行配制三份，作为中浓度回收率溶液。另取上述母液2.5mL、2.3线性试验项下的混合溶液0.5mL，加入25mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，平行配制三份，作为低浓度回收率溶液。按照上述液相色谱条件进样检测，结果见表12-表16。

表12杂质M-279回收率测定结果

表13杂质1回收率测定结果

表14 6,8-二甲氧基杂质回收率测定结果

表15 8-乙氧基杂质回收率测定结果

表16 6-甲氧基-8-氟杂质回收率测定结果

结果表明，杂质M-279的回收率在90.4％～108.6％，杂质1的回收率在93.2％～106.2％，6,8-二甲氧基杂质的回收率在90.6％～105.4％，8-乙氧基杂质的回收率在87.4％～95.6％，6-甲氧基-8-氟杂质的回收率在91.5％～103.5％，以上结果表明各杂质准确度高。

2.6溶液稳定性

精密称取6,8-二甲氧基杂质对照品、8-乙氧基杂质对照品、6-甲氧基-8-氟杂质对照品、杂质1对照品、杂质M-279对照品和莫西沙星母核对照品适量，用乙腈溶解并稀释制成每1mL中含各杂质均约为1μg、莫西沙星母核约为1mg的混合溶液，按照上述高效液相色谱条件，在不同时间测试并记录峰面积，结果如表17所示。

表17溶液稳定性试验结果

结果表明供试品溶液室温放置8h内稳定。

2.4耐用性

参照实施例1色谱条件，调节流动相起始比例、色谱柱控制温度、流速、检测波长，调整范围参见表18，分别对系统适用性溶液进行高效液相色谱分析，结果见表19。

表18有关物质检测方法耐用性条件

表19不同色谱条件系统适用性溶液中各成分峰分离度结果

结果表明，随着起始流动相比例变化、流速变化、柱温和波长变化，各组分的分离度变化不大。

流动相A中采用本发明限定的其他比例的四丁基硫酸氢铵与磷酸二氢钾作为流动相A，以及限定的其他pH条件下，也均可实现莫西沙星母核中上述5种杂质的有效分离。拟定的不同条件下整体分离效果良好，各杂质和莫西沙星母核之间以及各杂质之间皆能达到基线分离，方法耐用性良好。

对比例1

本对比例提供的莫西沙星母核中有关物质的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是调节柱温为40℃。取实施例1制备的系统适用性溶液进样检测，结果如图6所示。

从图中可以看出，杂质1与莫西沙星母核无法实现分离。图中从左向右依次为M-279峰，杂质1与母核重合峰、6,8-二甲氧基杂质与6-甲氧基-8-氟杂质重合峰，8-乙氧基杂质峰，各杂质未完全分离。

对比例2

本对比例提供的莫西沙星母核中有关物质的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是将梯度洗脱顺序替换为如下的梯度，检测结果如图7所示。

从图中可以看出，在此梯度下杂质1和莫西沙星母核峰完全重合，并且与6,8-二甲氧基杂质、6-甲氧基-8-氟杂质未能达到基线分离，无法实现莫西沙星母核中有关物质的有效检测。图中从左向右依次是M-279峰，杂质1、莫西沙星母核、6,8-二甲氧基杂质与6-甲氧基-8-氟杂质四个杂质的重合峰，8-乙氧基杂质峰。

对比例3

本对比例提供的莫西沙星母核中有关物质的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是将检测波长替换为293nm，检测结果如图8所示。

从图中可以看出，各杂质未完全分离。图中从左向右依次是M-279峰，杂质1、莫西沙星母核、6,8-二甲氧基杂质与6-甲氧基-8-氟杂质四个杂质的重合峰，8-乙氧基杂质峰，且各杂质的响应值很低。

对比例4

本对比例提供的莫西沙星母核中有关物质的检测方法与实施例1中完全相同，不同的仅是将梯度洗脱顺序替换为如下的梯度，检测结果如图9所示。

从图中可以看出，在此梯度下杂质1和莫西沙星母核峰完全重合，6,8-二甲氧基杂质与6-甲氧基-8-氟杂质完全重合，无法实现莫西沙星母核中有关物质的有效检测。图中从左向右依次是M-279峰，杂质1与莫西沙星母核重合峰，6,8-二甲氧基杂质与6-甲氧基-8-氟杂质重合峰，8-乙氧基杂质峰。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。