一种同时检测动物性食品中多种兴奋剂的方法

摘要

本发明涉及动物性食品检测技术领域，尤其涉及一种同时检测动物性食品中多种兴奋剂的方法。本发明的筛选方法为(1)在缓冲溶液中加入动物性食品，得到混合液；(2)在混合液中加入分解酶，酶解动物性食品后，加入提取液和盐析剂，提取得到含有兴奋剂的提取液；(3)将含有兴奋剂的提取液与C18吸附剂混合，氮气吹干，复溶剂定容，过膜，得到待测动物性食品；(4)利用UPLC‑QExactiveOrbitrap高分辨质谱技术对待测动物性食品进行分析，外标法进行定量，得到动物性食品中兴奋剂的含量。该方法灵敏度高，稳定性好，对104种动物源食品中兴奋剂实现了快速筛查。

说明书

技术领域

本发明涉及动物性食品检测技术领域，尤其涉及一种同时检测动物性食品中多种兴奋剂的方法。

背景技术

目前兽药多残留的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法，以及应用逐渐普遍的高分辨质谱技术(如Orbitrap、TOF等)。国家食品标准中的兽药监测多采用液相色谱-质谱法，但由于进样分析化合物的数量受限，分辨率低且受基质效应影响，在高通量的筛查检测工作时局限性较大。为了提高用于检测兽药残留的方法的分析性能，有必要提高其分析效率并减少相关的成本和时间。因此，现有技术急需一种可同时检测多种兴奋剂的筛选方法来提高现有技术的分析效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能同时灵敏快速的检测动物性食品中104种兴奋剂的方法。

本发明提供了一种同时检测动物性食品中多种兴奋剂的方法，包括如下步骤：

(1)在摩尔浓度为0.09～0.11mol/L的Na

本发明以牛肉和鸡肉为代表性基质样品，开发了一种可靠、灵敏的检测动物源性食品中104种动物源食品兴奋剂的方法，包含22种β-受体激动剂、20种β-受体阻断剂、38种糖皮质激素药物、17种蛋白同化制剂以及7种利尿剂。该方法不仅缩短了检测时间，提高实验效率，而且对于食源性兴奋剂定量检测的结果有很高的准确度，确保了兴奋剂检测的时效性及准确性。为重大赛事中食品安全以及运动员的饮食安全提供可靠的技术保障。

附图说明

图1为可的松和泼尼松龙的色谱图(由上到下依次使用SHISEIDO、Waters C18以及Phenomenex Kinetex色谱柱得到的色谱图)。图2为倍他米松和地塞米松的色谱图(由上到下依次使用SHISEIDO、WatersC18以及PhenomenexKinetex色谱柱得到的色谱图)。图3为美替洛尔和纳多洛尔的色谱图(由上到下依次使用SHISEIDO、Waters C18以及PhenomenexKinetex色谱柱得到的色谱图)。图4为醋酸可的松和醋酸泼尼松龙的色谱图(由上到下依次使用SHISEIDO、Waters C18以及Phenomenex Kinetex色谱柱得到的色谱图)。图5为有机相为甲醇时西马特罗、特布他林、沙丁胺醇、可的松和泼尼松龙的色谱图(由上到下依次为西马特罗色谱图、特布他林色谱图、沙丁胺醇色谱图、可的松和泼尼松龙的色谱图)。图6为有机相为乙腈时西马特罗、特布他林、沙丁胺醇、可的松和泼尼松龙的色谱图(由上到下依次为西马特罗色谱图、特布他林色谱图、沙丁胺醇色谱图、可的松和泼尼松龙的色谱图)。图7为不同提取液中各回收率范围下兴奋剂的数量(左图为牛肉基质中提取液的优化，右图为鸡肉基质中提取液的优化，其中：A为乙腈提取液、B为1％的甲酸乙腈提取液、C为甲醇提取液)。图8为不同净化剂中各回收率范围下兴奋剂的数量(左图为牛肉基质中净化剂的优化，右图为鸡肉基质中净化剂的优化)。图9为特仑特罗的提取离子流图和二级质谱图(上图为离子流图，下图为二级质谱图)。图10为班布特罗的提取离子流图和二级质谱图(上图为离子流图，中图为粒子流中前一峰的二级质谱图，下图为后一峰的二级质谱图)。图11为氢化可的松的提取离子流图和二级质谱图(上图为离子流图，下图为二级质谱图)。

具体实施方式

本发明实施例中所用的仪器设备的来源：UPLC-Q Exactive Orbitrap HRMS购自美国Thermo Fisher Scientific；高速冷冻离心机sigma 3-18k，购自德国SIGMA公司；Milli-Q纯水系统购自美国Millipore公司；超声波清洗器KQ-500E购自昆山市超声仪器有限公司；均质器购自瑞士KINMATIC公司；涡旋振荡器vortex genie-2购自美国scientificIndustries公司；N-EVAP112氮吹仪购自美国organomation公司。

本发明实施例中所用到的试剂的来源：乙腈色谱纯购自美国Thermo FisherScientific；甲醇色谱纯购自美国Thermo Fisher Scientific；甲酸色谱纯购自迪马科技有限公司；超纯水来源于超纯水机UPL-IV-50E制备的超纯水；氯化钠分析纯、无水乙酸钠分析纯购自天津市永大化学试剂有限公司；无水硫酸钠分析纯、二乙胺四乙酸二钠Na

本发明实施例中所用的溶液的配置方法：

摩尔浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液的配置方法：称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL；

摩尔浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液的配置方法：称取28.41g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL；

Mcllvaine缓冲溶液的配置方法：将1000mL 0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液混合，调节pH＝4.0±0.05；

摩尔浓度为0.1mol/L的Na

体积浓度为1％的甲酸乙腈的配置方法：99mL乙腈中加入1mL甲酸；

体积浓度为0.1％的甲酸水溶液的配置方法：1L的超纯水里面加入1mL的甲酸。

本发明实施例中用到的兴奋剂标准品的来源：

22种β-受体激动剂混合标准溶液，浓度为100μg/mL，购自First standard；38种糖皮质激素混合标准溶液，浓度为100μg/mL，购自上海安普实验科技股份有限公司；20种β-受体阻断剂混合标准溶液，浓度为100μg/mL，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度>98％。17种蛋白同化剂：群勃龙、诺龙、勃地酮、睾酮、雄诺龙、美雄酮、甲基睾酮、司坦唑醇、1-雄烯二酮、雄烯二酮、氯司替勃、达那唑、甲基屈他雄酮、屈他雄酮、美曲勃龙、替勃龙、19-去甲雄烯二酮的标准品均购于中国食品药品检定所，纯度>97％；7种利尿剂：坎利酮、螺内酯、精磺胺、乙酰唑胺、氯噻酮、氯噻嗪、氢氯噻嗪均购自中国食品药品检定所，纯度大于97％。22种β-受体激动剂混合标准溶液中包括：班布特罗、溴布特罗、西马特罗、西布特罗、克伦特罗、克伦赛罗、克伦普罗、非诺特罗、异克舒令、拉贝特罗、马布特罗、马喷特罗、喷布特罗、苯乙醇胺A、妥布特罗、齐帕特罗、氯丙那林、福莫特罗、莱克多巴胺、利托菌、沙丁胺醇、沙美特罗。

38种糖皮质激素混合标准溶液中包括：阿氯米松双丙酸酯、倍氯米松、倍氯米松双丙酸酯、倍他米松、倍他米松戊酸酯、醋酸倍他米松、倍他米松双丙酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他松丁酸酯、可的松、醋酸可的松、地塞米松、醋酸地塞米松、二氟拉松双醋酸酯、醋酸氟氢可的松、氟氢缩松、氟米松、氟米龙、醋酸氟米龙、氟替卡松丙酸酯、哈西奈德、氢化可的松、氢化可的松丁酸酯、氢化可的松戊酸酯、醋酸氢化可的松、甲基泼尼松龙、甲基泼尼松龙醋酸酯、泼尼卡酯、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松、醋酸泼尼松、曲安奈德、醋酸曲安奈德、醋酸曲安西龙双、地夫可特、安西奈德、布地奈德。

20种β-受体阻断剂混合标准溶液中包括：特布他林、阿普洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、布诺洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、卡维洛尔、塞利洛尔、美替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、艾司洛尔、氧烯洛尔、吲哚洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔、醋丁洛尔、普萘洛尔。

本发明实施例中的标准溶液的配置方法：分别称取各标准品10.0mg(折合纯度后)与10mL容量瓶中，加入甲醇溶解后、定容。得到1mg/mL的单标储备液。移取各单标储备液按类别用甲醇稀释成1μg/mL混合标准工作液，于4℃下避光保存，备用。

实施例1

色谱条件：进样量10μL；流速0.3mL/min；正模式洗脱程序中的流动相A和流动相B；负模式洗脱程序中的流动相A和流动相B。

正模式梯度洗脱程序为0min：95％的流动相A，5％的流动相B；1.5min：95％的流动相A，5％的流动相B；6.0min：80％的流动相A，20％的流动相B；7.0min：70％的流动相A，30％的流动相B；18.0min：70％的流动相A，30％的流动相B；18.5min：60％的流动相A，40％的流动相B；22.0min：58％的流动相A，42％的流动相B；30.0min：43％的流动相A，57％的流动相B；34.5min：25％的流动相A，75％的流动相B；36.5min：90％的流动相A，10％的流动相B；38.5min：90％的流动相A，10％的流动相B；38.5min：5％的流动相A，95％的流动相B；40.5min：5％的流动相A，95％的流动相B。

负模式洗脱程序为：0min：95％的流动相A，5％的流动相B；1.5min：95％的流动相A，5％的流动相B；6.0min：5％的流动相A，95％的流动相B；8.5min：5％的流动相A，95％的流动相B；8.6min：95％的流动相A，5％的流动相B；10.05min：95％的流动相A，5％的流动相B。

质谱条件：电喷雾离子源ESI+和ESI-；扫描模式为全扫描加自动触发二级扫描模式Full MS-ddMS

表1104种兴奋剂的相关信息

(1)色谱柱的优化：本实验检测的兴奋剂的性质有很大差异，因此所选择的色谱柱要保证对各个目标兴奋剂都能有较好的保留。实验比较了3种色谱柱，分别为WatersACQUITY

图1～4显示，当色谱柱为C

(2)流动相的选择：实验比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％甲酸水、乙腈-0.1％甲酸水以及0.1％甲酸乙腈-0.1％甲酸水作为流动相，使用SHISEIDO HPLC PACKED COLUMN2.1 mmI.D.×150mm，5μm色谱柱用相同的色谱方法对混合标准品进行分离。分离结果如图5～6所示。

结果显示，当流动相是甲醇时，化合物的响应值要略低于乙腈作流动相，且峰形效果不理想，西马特罗、特布他林、沙丁胺醇等会显示出“M”型色谱峰，而且，其中可的松和泼尼松龙分子量为361.2010的两个同分异构体不能分开；而当流动相换成乙腈，峰形显示尖锐，各同分异构体都能很好的分开。流动相水相中加入一定比例的甲酸不仅有利于提高化合物离子化效率，还可以使流动相呈现酸性环境，明显改善酸碱化合物的峰形并维持稳定的pH值，因此水相选用了含0.1％甲酸的水溶液；当流动相是0.1％甲酸乙腈-0.1％甲酸水时，各类化合物都得到了很好的分离，出峰时间理想，峰形尖锐且对称，因此，本实验正模式选用0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈为流动相，而负模式选择水-乙腈。

实施例2

准确称量鸡肉样品2g置于50mL的聚丙烯离心管中，加入2mL 0.1mol/L Na

(1)提取液的优化：本实验对于提取液的优化有以下设计：乙腈、1％甲酸乙腈、甲醇。采用这3种提取液分别提取牛肉和鸡肉样品中的目标兴奋剂。利用实施例1的色谱质谱条件检测不同提取液对目标兴奋剂的影响。结果如图7所示。

图7显示：当提取液为甲醇时，在两种基质中的提取效果都很差，大部分目标化合物未能从基质中提取出来，且提取回收率绝大部分小于60％。牛肉基质中，其余两种提取液中乙腈的提取效果最好，提取化合物回收率在80～120％的个数有92个，约为88.5％。其总体回收率在50.7～138.9％，整体回收率较好，因此牛肉基质中将乙腈作为提取液。鸡肉基质中，整体回收率较高的提取液是乙腈，回收率在55.7～134.9％，104种化合物的平均回收率为109.4％，因此选择乙腈作为提取液。

(2)净化剂的优化：分别采用200mg的PSA、C

图8显示，在牛肉基质中，所有净化剂的效果相差不大，但C

实施例3

(1)方法特异性：应用阴性样品以及阴性加标样品全过程实验作对照。实验结果表明肉类基质中104种兴奋剂均具有良好的特异性，在精确质量数偏差≤5ppm的范围内，目标化合物附近无干扰物，UPLC-Q Exactive Qribitrap HRMS很好地避免了低分辨率质谱仪容易收基质干扰而产生的假阳性的现象。

(2)线性、检出限和定量限：用甲醇将1μg/mL的混合标准工作液配置成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100ng/mL的标准溶液，以定量离子峰面积为纵坐标，对应质量浓度为横坐标绘制标准曲线。各目标兴奋剂的标准曲线如表4所示。结果表明，各目标兴奋剂分别在相应的浓度范围内，色谱峰面积和浓度均能呈现良好的线性关系，各目标化合物的R

将空白鸡肉样品和空白牛肉样品按照实施例2优化后的方法处理成待测样品后，用复溶剂复溶的空白基质样品将1μg/mL的混合标准工作液配置成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100ng/mL的标准溶液，得到鸡肉和牛肉基质加标溶液。以鸡肉和牛肉基质加标溶液的浓度为横坐标，得到的峰面积为纵坐标，制作基质匹配标准曲线。结果表明，两种基质中各目标兴奋剂分别在相应的浓度范围内，色谱峰面积和浓度均能呈现良好的线性关系，各化合物的R

取空白牛肉和鸡肉基质样品，采用逐级稀释的方法添加适量的混合标准工作液，按照实施例2优化后的方法处理后，在实施例1优化后的色谱-质谱条件下进样，得到空白样品加标色谱图，按照信噪比S/N为3:1、10:1分别计算不同基质样品的检出限LOD和定量限LOQ。结果如表2所示。

结果显示两种基质中各目标兴奋剂的检出限和定量限分别为0.15～3.03μg/kg和0.5～10μg/kg。

表2目标化合物的线性方程、检测线和定量限

(3)回收率、重复性：回收率是空白样品添加三个不同浓度的已知浓度样品后，通过仪器测定的响应值除以该浓度化合物标准品溶液的仪器测定的响应值得到。本试验设置3个添加水平除17种蛋白同化制剂设置的浓度为10、20、40μg/kg外，其余兴奋剂的浓度均为5、10、20μg/kg。按照实施例2优化好的处理方法处理样品后，利用实施例1优化好的色谱-质谱条件下进样，根据各组分的峰面积计算加标回收率。结果如表3所示。

取空白鸡肉和牛肉基质样品，添加适量的混合标准品，使样品最终的浓度为10μg/kg，17种蛋白同化制剂为20μg/kg，6个重复，按照实施例2优化好的处理方法处理样品后，利用实施例1优化好的色谱-质谱条件下进样，根据各组分的峰面积计算重复性。结果如表3所示。

由表可知，牛肉基质中，各添加水平的回收率在52.1～138.2％以内，RSD在0.4～17.7％以内。在鸡肉基质中，各添加水平的回收率在52.3～134.1％以内，RSD在1.1～16.8％以内。

牛肉基质中各目标化合物的相对标准偏差在0.1～11.1％，鸡肉基质中各目标化合物的相对标准偏差在1.5～13.2％，方法重复性良好。

表3各目标化合物不同添加水平下的平均回收率及重复性

实施例4

应用实施例2和实施例1优化后的方法对市售及进出口的15份鸡肉和15份牛肉样品进行104种兴奋剂的检测。结果在鸡肉中检测出克仑特罗1.097μg/kg和班布特罗2.375μg/kg。克仑特罗的离子流图和二级质谱图如图9所示，班布特罗的离子流图和二级质谱图如图10所示。图10显示班布特罗的色谱图上有两个色谱峰，分别提取两个色谱峰的二级质谱图可以看到，保留时间为12.79min的色谱峰的二级碎片离子的分子量是72.0451、294.1444以及202.0012，与班布特罗的标准品的碎片离子吻合，且保留时间接近。但是34.31min的峰二级碎片离子不含有相应的二级碎片离子且保留时间相差巨大，因此可以得出结论，保留时间为12.79min的色谱峰为目标化合物的峰。牛肉中有一份检测出氢化可的松，其含量为3.541μg/kg，氢化可的松的离子流图和二级质谱图如图11所示。图11显示的二级质谱图中显示的特征碎片离子的分子量为121.0649,147.0804,171.0803，可以确证是此物质。其余牛肉和鸡肉样品中未检测到目标化合物。

由以上实施例可知，本发明以牛肉和鸡肉为代表性基质样品，开发了一种可靠、灵敏的检测动物源性食品中104种动物源食品兴奋剂的方法，包含22种β-受体激动剂、20种β-受体阻断剂、38种糖皮质激素药物、17种蛋白同化制剂以及7种利尿剂。该方法不仅缩短了检测时间，提高实验效率，而且对于食源性兴奋剂定量检测的结果有很高的准确度，确保了兴奋剂检测的时效性及准确性。为重大赛事中食品安全以及运动员的饮食安全提供可靠的技术保障。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。