一种BRCA1/2基因变异的分类评价方法

摘要

本发明公开了一种BRCA1/2基因变异的分类评价方法，包括如下步骤：(1)按HGVS的规则对BRCA1/2基因变异按固定的转录本进行编码区及氨基酸变化的注释，以获得证据，BRCA1的转录本为NM_007294，BRCA2的转录本为NM_000059；(2)将步骤(1)所得的证据进行根据改进的ACMG指南，分类为人群数据、计算机预测数据、功能研究数据、共分离数据、等位基因数据、数据库数据和表型数据，再根据致病性分级为PVS、PS、PM和PP，并根据良性情况分级为BA、BS和BP；(3)综合各证据的分类与分级的分值将所获得的基因变异进行分类评价。本发明评价精确且易于执行。

说明书

技术领域

本发明属于基因变异评价技术领域，具体涉及一种BRCA1/2基因变异的分类评价方法。

背景技术

BRCA1和BRCA2基因在同源重组修复通路(HRR，Homologous recombinationrepair pathway)中起着至关重要的作用，在体内，HRR通路是DNA双链损伤最主要的修复机制，若BRCA1/2基因突变而失活(致病突变)可能致使HRR通路修复功能的丧失，进一步的，细胞则可能因DNA损伤的积累而产生癌变。在临床上，BRCA1/2的致病突变也已经被证明与多种遗传性肿瘤相关，研究显示，携带BRCA1/2致病性变异的女性一生中罹患乳腺癌的风险高达45～65％，而卵巢癌高达11～39％，这一数值远远高于非携带者，相似的情况同样也发生在男性前列腺癌中。另外，临床实验显示，携带BRCA1/2基因致病性变异的乳腺癌或卵巢癌患者可以从PARP抑制剂的治疗中获益，目前多种PARP抑制剂如奥拉帕利，尼拉帕利和他拉唑帕利等已经被FDA或NMPA批准上市。因此，对BRCA1/2变异的检测具有重要的临床意义。

对检出的变异进行分类解读是BRCA1/2变异检测流程中的关键环节，按照国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)、美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)和胚系突变等位基因解读实证联盟(Evidence-based Network for the Interpretation ofGermline Mutant Alleles，ENIGMA)的分类系统，BRCA1/2变异按照风险程度由高到低可以分成以下5类：5类-致病性、4类-疑似致病性、3类-意义不明、2类-疑似良性、1类-良性，其中4类或5类在临床上具有明确的指导意义，1类和2类理论上并不会对基因的功能造成影响，而3类则是属于证据不足或者证据冲突的变异。

BRCA1/2基因属于抑癌基因，并不存在热点区域，同时由于基因编码区总长达15Kb，这就导致BRCA1/2变异不仅数量多而且分布广。目前已有报道超过30000个BRCA1/2基因变异，且每年都有大量的新发变异被报道，其中很大一部分变异由于证据不足无法给予准确的分类结果。在最常用的Clinvar数据库中(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)就记录着大量的意义不明确变异，这些情况给BRCA1/2的分类工作带来了不小的挑战，因此需要一种明确、方便且行之有效的方法对BRCA1/2的变异进行分类。目前多家机构制定了BRCA1/2变异的标准化分类规则，包括ACMG制定的《序列变异分类标准与指南》(2015版)

ACMG的2015年修订的《序列变异分类标准与指南》是目前行业内使用相对广泛的规则指南，该分类规则本质是一个对证据的加权系统，将证据类型分成八个大类(人群数据、计算预测数据、功能数据、共分离数据、新发数据、等位基因数据、其他数据库、其他数据)，并根据强弱分成七个等级(良性独立证据BA、良性强证据BS、良性支持证据BS、致病性非常强证据PVS、致病性强证据PS、致病性中等证据PM、致病性支持证据PP)，对收集到的相关证据执行加权，再根据分类标准对变异进行分类判定。ACMG的分类规则较为全面，证据分类明确，可执行性强，适用于分类判定规则的流程化。但是，ACMG分类规则是一份针对所有单基因遗传病的基因遗传变异的普适性规则，具体落实到基因的实施层面上会有很多不适用的地方；其次，ACMG分类规则中部分证据的定义模糊，可能导致执行过程中存在较多成分的主观判断。因此，ACMG分类规则存在较大的改进空间。

ENIGMA在2015年制定《BRCA1/2基因变异分类标准》，在2017年进行了修订。这是行业内相对认可的、专门针对BRCA1/2基因的分类规则。ENIGMA标准对目标变异分成1-5类所需要的条件进行了详细的陈述。ENIGMA标准是为BRCA1/2基因变异分类解读连身定做，分类条件细致明确，需要使用者进行主观判断的地方相对较少。但是，在ENIGMA标准中，对于各种临床证据(如家系证据、功能实验证据、等位基因证据等)统一采用多因素似然模型(multifactorial likelihood model)进行打分，而该模型很多情况并不适用，并且对使用者存在一定的门槛，这使得ENIGMA标准的可执行性相对困难一些。

中华医学会病理学分会于2017年出台《《BRCA数据解读中国专家共识》，主要是以ENIGMA标准作为框架，但是在分类过程中缺少对部分临床证据的关注，如家系共分离证据，疾病-健康人群对照证据等。

CN 110957006A公开的技术方案的实质为ACMG指南分类规则的升级优化版，其对部分ACMG的证据细则进行了修改，并且增减了部分证据模块，使其更适用于BRCA1/2基因变异的分类解读。但仍有很多不足之处，首先是它的优化主要针对LOF(loss of function，功能缺失)变异，可能对该类变异的判定比较有效，而对于其它类型变异(例如，错义突变、同义突变)的分类效果不明显；其次是其优化后规则中仍然存在较多条件模糊而需依赖使用者主观判断的情况，因此还有很多值得优化的空间。有理由认为，使用该方法进行变异分类，仍然会有大量变异无法得出一个准确的分类结果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供了一种BRCA1/2基因变异的分类评价方法。

本发明采用技术方案如下：

一种BRCA1/2基因变异的分类评价方法，包括如下步骤：

(1)按HGVS的规则对BRCA1/2基因变异按固定的转录本进行编码区及氨基酸变化的注释，以获得证据，BRCA1的转录本为NM_007294，BRCA2的转录本为NM_000059；

(2)将步骤(1)所得的证据进行根据改进的ACMG指南，分类为人群数据、计算机预测数据、功能研究数据、共分离数据、等位基因数据、数据库数据和表型数据，再根据致病性分级为PVS、PS、PM和PP，并根据良性情况分级为BA、BS和BP；上述改进包括对PVS模块中的PVS1项的优化、对PM模块的优化、对PP模块中的PP1项及PP3项至PP5项的优化、对BA模块中的BA1项的优化、对BS模块中的BS1项的优化、对BP模块中的BP4项及BP6项至BP7项的优化和对证据模块的联合用法的优化中的至少一种；

(3)综合各证据的分类与分级的分值将所获得的基因变异分类评价为致病、疑似致病、意义未明、疑似良性和良性。

在本发明的一个优选实施方案中，所述对PVS模块中的PVS1项的优化包括以下至少之一：

将BRCA1/2基因外显子3’末端碱基的变异G＞non-G列入PVS1证据项；外显子3’末端碱基同样也是mRNA剪接中的保守序列，已经有多个发生在BRCA1/2基因外显子末端的变异被验证会导致mRNA剪接异常，该优化可以提升变异分类规则的有效性

针对经典剪接区及外显子3’端最后一个碱基的变异，排除已知或预测会导致框内RNA异构体的变异。该优化可以提升变异分类的执行效率和准确性。

进一步优选的，所述对PVS模块中的PVS1项的优化还包括：限定发生在BRCA1基因1855位或BRCA2基因3309位氨基酸之前的功能缺失变异列入PVS1项。原ACMG规则针对所以遗传基因，仅建议对基因3’末端位置的LOF变异谨慎解读，并未给出具体位置，该优化可以明确位置，统一规则，避免人工主观因素的影响。

在本发明的一个优选实施方案中，所述对PM模块的优化包括：删除了原ACMG指南中的PM1/PM3/PM6三项证据分类。PM1对于热点区域的描述并不适用于BRCA1/2基因，基于对现有的BRCA1/2变异数据的收集和分析，BRCA1/2并不存在热点区域；PM3仅适用于隐性遗传基因；PM6则仅适合基因外显率较高且发病年龄较低的疾病，因此均不适用BRCA1/2基因变异的分类。该优化可以提升变异分类的执行效率。

进一步优选的，所述对PM模块的优化还包括：在PM2项中增加包括exome和genome的gnomAD数据库作为人群频率参考数据库。该数据库是目前全球最大的人群变异数据库，增加该数据库可以提高变异分类的有效性和执行效率。

在本发明的一个优选实施方案中，对PP模块中的PP1项及PP3项至PP5项的优化包括以下至少之一：

在PP1项中确定不同等级证据的需要的配子数：在1个以上家族观察到3-4个配子，此时适用PP1证据；在1个以上家族观察到5-6个配子，此时适用PP1_Moderate证据；在2个以上家族观察到7个配子，此时适用PP1_Strong证据；该变异与疾病在家系中存在分离现象，该优化明确致病性共分离证据的适用范围，提高分类的准确性和便捷性。

在PP3项中确定功能预测使用SIFT、Polyphen-2、PROVEAN、MutationTaster四种算法，剪接预测使用NNSplice、NetGene2、FSPLICE、MaxEntScan、Human Splicing Finder五种算法，并均要求至少三种算法结论一致方可使用；该优化规则更明确，更易于执行，并且可防止原ACMG指南中可能出现的多种预测结果冲突而无法判定的情况。

在PP4项中对携带者的表型进行了确定，要求符合NCCN指南所描述的遗传性乳腺癌/卵巢癌中的5条特征中的至少1个，且要求至少收集两名携带者；该优化相比之前精确，减少了大量主观因素的影响，可以提高变异分类的可执行性和有效性。

在PP5项中确定可靠信誉来源的支持数据库包括ClinVar、BRCA Exchange、LOVD，并要求数据库间记录不冲突，且ClinVar中判定的可靠度为两星或以上方可采纳。该优化相比之前精确，可以提高变异分类的执行效率和有效性。

进一步优选的，删除了原ACMG指南中的PP2项证据分类。该项证据并不适用于BRCA1/2基因变异的分类。该优化可以提升变异分类的执行效率。

在本发明的一个优选实施方案中，所述对BA模块中的BA1项的优化包括：将总人群频率的阈值降低至1％。该优化可以极大地提高BRCA1/2基因变异分类的有效性和准确性。

进一步优选的，所述对BA模块中的BA1项的优化还包括增加包括exome和genome的gnomAD数据库作为人群频率参考数据库；该数据库是目前全球最大的人群变异数据库，增加该数据库可以提高变异分类的有效性。

在本发明的一个优选实施方案中，所述对BS模块中的BS1项的优化包括修改为在包括exome和genome的gnomAD数据库、千人基因组数据库和ExAC数据库记录中等位基因个数AN超过15000且发生频率大于或等于0.1％的变异，或AN大于5000且发生频率大于或等于0.5％的变异。该优化相比之前更易于执行，可以极大地提高BRCA1/2基因变异分类的有效性。

进一步优选的，删除了原ACMG指南中的BS2项证据分类。该项证据只适用于早期完全外显的疾病，因此并不适用于BRCA1/2基因。此项改进可以提升变异分类的执行效率。

在本发明的一个优选实施方案中，所述对BP模块中的BP4项及BP6项至BP7项的优化包括以下至少之一：

在BP4项中确定功能预测使用SIFT、Polyphen-2、PROVEAN、MutationTaster四种算法，剪接预测使用NNSplice、NetGene2、FSPLICE、MaxEntScan四种算法，并均要求至少三种算法结论一致方可使用；该优化规则更清晰，更易于执行，并且可防止原ACMG指南中可能出现的多种预测结果冲突而无法判定的情况；

在BP6项中确定可靠信誉来源的支持数据库包括ClinVar、BRCA Exchange、LOVD，并要求数据库间记录不冲突，且ClinVar中判定的可靠度为两星或以上方可采纳；该优化相比之前精确，可以提高变异分类的执行效率和有效性；

在BP7项中确定三个条件：a)对于同义突变，发生在非保守区域，且无实质证据证明会导致mRNA剪接异常；b)对于错义突变，与已知的明确为1类变异的错义突变具有相同的氨基酸改变但碱基变化不同，且无实质的证据证明该变异会导致mRNA剪接异常；c)该项证据分类在最终变异的分类判定时仅可与BP4联用，不可与其它证据项联用，也不可独立使用，否则无效。

进一步优选的，删除BP1/BP5两个证据项。这两个证据项并不符合BRCA1/2基因以及相关疾病的遗传特性，因此删除；该优化可以提升变异分类的执行效率。

进一步优选的，所述对证据模块的联合用法的优化包括在最终的变异分类中，属于同类数据分类的证据项不能同时使用，BP4+BP7是一种例外情况，这两项证据允许同时使用。该优化结合对BP7项的优化可以极大地提升分类方法的有效性，对于无法收集到有效的临床证据或功能实验证据的新发变异(特别是同义突变)效果更加显著。进一步的，该项优化的采用其它描述或许可以达到，如：1)对于发生在非保守区域的同义突变，且多种剪接预测算法一致预测不影响mRNA剪接(剪接预测影响参考BP4判定方法)，在无更多其它有效证据的情况下，可以直接判定为2-疑似良性；2)对于错义突变，与已知的明确为1类变异的错义突变具有相同的氨基酸改变但碱基变化不同，且多种剪接预测算法一致预测不影响mRNA剪接(剪接预测影响参考BP4判定方法)，在无更多其它有效证据的情况下，可以根据BP4+BP7将为位点分类到2-疑似良性。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)中的改进还包括对PS模块进行的优化。

进一步优选的，所述对PS模块进行的优化包括删除了原ACMG指南中的PS2项证据分类。该项证据仅适合基因外显率较高且发病年龄较低的疾病，因此并不适合BRCA1/2基因变异的分类；该优化可以提升变异分类的执行效率。

本发明的有益效果是：本发明提供了更加精确、高效且更易于执行和允许自动化的BRCA1/2基因变异分类评价方法，以解决现有变异分类评价方法中存在的主观性强、可执行性弱及分类有效率低等状况，能够较为准确的评价不同BRCA1/2基因变异的致病风险，以对临床检查的频次做出建议。

附图说明

图1为本发明实施例1的的原理示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

如图1所示，一种BRCA1/2基因变异的分类评价方法，主要是基于ACMG指南中的规则作为框架，对其中的规则进行升级与优化，使其更精确、更易于执行，包括如下步骤：

(1)按HGVS的规则对BRCA1/2基因变异按固定的转录本进行编码区及氨基酸变化的注释，以获得证据，BRCA1的转录本为NM_007294，BRCA2的转录本为NM_000059；

(2)将步骤(1)所得的证据进行根据改进的ACMG指南，分类为人群数据、计算机预测数据、功能研究数据、共分离数据、等位基因数据、数据库数据和表型数据，再根据致病性分级为PVS、PS、PM和PP，并根据良性情况分级为BA、BS和BP；证据分类分级表见表1与表2：

表1致病性证据分类表

表2良性证据分类表

注：*，归为同一数据分类的证据不能同时使用。

表3已知或预测的BRCA1/BRCA2基因经典剪接区变异会导致in-frame RNA异构体，可能对基因功能具有修复作用，这类突变不可作为PVS1证据。

表4已知或预测的BRCA1/2基因外显子末端突变(G＞non-G)会导致in-frame RNA异构体，可能对基因功能具有修复作用，这类突变不可作为PVS1证据。

(3)综合各证据的分类与分级的分值将所获得的基因变异分类评价为致病、疑似致病、意义未明、疑似良性和良性，具体分类评价的判读规则见表5：

表5最终分类判定规则

以下实施例2至7为运用实施例1的分类评价方法的具体实例。

实施例2

患者信息：女，35岁，乳腺癌

样本类型：石蜡蜡卷+全血(配对样本)

检出变异：chr17：41215886C＞T，BRCA1基因，突变丰度为42.83％，根据全血样本对比，确认为体细胞突变；

解读注释过程：

1)用BRCA1基因的NM_007294转录本进行注释，得出该突变结果为c.5152+5G＞A：p.？，发生在BRCA1基因的18号内含子(非编码区)，离外显子边缘5bp，但并不在经典剪接区；

2)查询人群数据库，该变异在ExAC、gnomAD和千人基因组数据库中均无记录(PM2)；

3)查询公共变异数据库显示，该变异在ClinVar数据库报道为Pathogenic/Likely_pathogenic(ID＝55427，可靠度为两颗星)(PP5)；

4)查询相关的实验报道，一项病例研究中(PMID：27886673)，通过对患者的RNA进行体外分析，证明该变异会导致整个18号外显子的缺失，从而导致重要的BRCT功能域的损伤；在另一项体外实验研究中(PMID：30209399)，研究者通过基因编辑生成变异，后转染入HAP1细胞系进行功能测定，证明该变异为Loss ofFunctional(PS3)；

5)采用剪接预测算法对该变异进行预测，结果显示三种算法(FSPLICE、MaxEntScan、NNsplice)预测为影响剪接(PP3)；

6)综合以上证据，最终该变异的分类结果为4类-疑似致病性，相应的证据项为PS3+PM2+PP5+PP3。

实施例3

患者信息：女，65岁，盆腔肿瘤

样本类型：石蜡蜡卷

检出变异：chr13：32954310delT，BRCA2基因，突变丰度为8.04％，确认为体细胞突变；解读注释过程：

1)用BRCA2基因的NM_000059转录本进行注释，得出该突变结果为c.9256+28delT：p.？，发生在BRCA2基因的24号内含子(非编码区)，离外显子边缘28bp，并不在经典剪接区；

2)查询人群数据库显示，ExAC、gnomADe、gnomADg数据库的AFR人群中频率分别为0.001281(12/9370)、0.00104(16/15386)、0.001265(11/8694)，在千人基因数据库中无记录(BS1)；

3)查询公共变异数据库显示，该变异在ClinVar数据库报道为Likelybenign(ID＝55427，可靠度为一颗星)；BRCA exchange中未作分类；

4)采用预测算法进行预测显示，3种算法(FSPLICE、NetGene2、NNsplice)预测为不影响剪接(BP4)；

5)综合以上证据，最终该变异的分类结果为2类-疑似良性，相应的证据项为BSI+BP4。

实施例4(对比例)

患者信息：女，乳腺癌

样本类型：全血

检出变异：chr13：32945237G＞C，BRCA2基因，确认为胚系变异，杂合

本发明方法解读注释过程：

1)用BRCA2基因的NM_000059转录本进行注释，得出该突变注释为c.8632G＞C，发生在BRCA2基因的20号外显子最后一个碱基，由G＞non-G，给予PVS1证据；

2)查询人群数据库显示，该变异在1000G、ExAC、gnomAD数据库中均无记录，给予PM2的证据；

3)查询公共变异数据库显示，该变异在ClinVar数据库中报道为Uncertain_significance(ID＝918105，可靠度为一颗星)；BRCA exchange中未作分类；

4)查询文献报道，未找到其它的实验证据；

5)综合以上证据，按实施例1的最终的分类结果为4类-疑似致病性，相应的证据为PVS1+PM2。

按原ACMG方法注释解读过程：

1)用BRCA2基因的NM_000059转录本进行注释，得出该突变注释为c.8632G＞Cp.(E2878Q)，属于错义突变，发生在BRCA2基因的20号外显子最后一个碱基，不在经典剪切区，不给予证据；

2)查询人群数据库显示，该变异在1000G、ExAC、gnomAD数据库中均无记录，给予PM2的证据；

3)查询公共变异数据库显示，该变异在ClinVar数据库中报道为Uncertain_significance(ID＝918105，可靠度为一颗星)；BRCAexchange中未作分类，不给予证据；

4)采用预测算法进行预测显示，3种软件(MutationTaster、PolyPhen-2、SIFT)预测为有害突变，1种软件(PROVEAN)预测为无害突变，给予PP3的证据；

5)查询文献报道，未找到其它的实验证据；

6)综合以上证据，按原ACMG方法的分类结果为3类-意义不明确，相应的证据为PM2+PP3。

验证方法：

采用Minigene平台对该变异的mRNA剪接效应进行验证，具体实验方法参考之前已有的报道(PMID：20721748)，结果显示，突变可导致BRCA2 exon20skipping(整个外显子剪接缺失)，经预测，BRCA2 c.8632G＞C突变后的蛋白翻译结果为p.W2830Kfs*13，可导致蛋白翻译提前终止，确认属于致病性变异，符合本方法的判定结果。

实施例5

患者信息：女，45岁，卵巢癌

样本类型：石蜡玻片

检出变异：chr17：41256926A＞T，BRCA1基因，确认为体细胞突变，突变丰度47.3％

注释解读过程

1)用BRCA1基因的NM_007294转录本进行注释，得出该突变结果为c.260T＞Ap.L87*，发生在BRCA1基因的6号外显子，属于无义突变，可能导致基因编码蛋白第87位氨基酸由亮氨酸突变为终止密码子(且发生在第1855位氨基酸之前)，给予PVS1的证据；

2)查询人群数据库显示，该变异在1000G、ExAC、gnomAD数据库中均无记录，给予PM2的证据；

3)查询公共变异数据库显示，在BRCAExchange数据库中记录为Pathogenic，ClinVar数据库报道为Pathogenic(ID＝266284，可靠度为三颗星)，给予PP5的证据；

4)查询相关文献报道，在一篇研究实验中(PMID：30209399)，作者通过饱和基因组编辑的方法对该变异的功能进行验证，结果认为该变异属于loss of function；

5)综合以上证据，按实施例1的最终的分类结果为5类-致病性变异，相应的证据为PVS1+PS3+PM2+PP5。

实施例6

患者信息：女，35岁，肿瘤类型不明

样本类型：石蜡包埋组织

检出变异：chr17：41245915delC，BRCA1基因，确认为体细胞突变，突变丰度28.50％；注释解读过程

1)用BRCA1基因的NM_007294转录本进行注释，得出该突变结果为c.1633delGp.V545*，发生在BRCA1基因的11号外显子，属于缺失突变，导致基因编码蛋白第545位氨基酸由缬氨酸突变为终止密码(且发生在第1855位氨基酸之前)，给予PVS1的证据；

2)查询人群数据库显示，该变异在1000G、ExAC、gnomAD数据库中均无记录，给予PM2的证据；

3)查询公共变异数据库显示，该变异在ClinVar和BRCA Exchange数据库中均无记录；

4)查询文献报道，未找到其它的实验证据；

6)综合以上证据，按实施例1的最终的分类结果为4类-疑似致病性，相应的证据为PVS1+PM2。

实施例7

患者信息：女，70岁，输卵管癌

样本类型：石蜡玻片

检出变异：chr17：41258506delT，BRCA1基因，确认为体细胞突变，突变丰度76.3％；注释解读过程

1)用BRCA1基因的NM_007294转录本进行注释，得出该突变结果为c.179delAp.Q60Rfs*9，发生在BRCA1基因的5号外显子，可能导致基因编码蛋白第60位氨基酸由谷氨酰胺突变为精氨酸并于68位发生提前终止(且发生在第1855位氨基酸之前)，给予PVS1的证据；

2)查询人群数据库显示，该变异在1000G、ExAC、gnomAD数据库中均无记录，给予PM2的证据；

3)查询公共突变数据库显示，该变异在BRCAExchange数据库记录为Pathogenic，ClinVar数据库报道为Pathogenic(ID＝54353，可靠度为三颗星)，给予PP5的证据；

4)查询文献报道，未找到其它的实验证据；

5)综合以上证据，按实施例1的最终的分类结果为4类-疑似致病性，相应的证据为PVS1+PM2。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。