一种高性能单细胞电阻抗检测微电极及制备方法

摘要

本发明涉及一种高性能单细胞电阻抗检测微电极及制备方法，在微流体通道两侧分别设置激发电极和检测电极，激发/检测电极可为一对或多对；并在激发电极和检测电极以外的区域设置接地电极。与传统共面电极单细胞电阻抗检测相比，两侧对称电极可以使得检测区域的电场分布更加均匀，提高检测精度；而设置接地电极可以提高检测区域的电场集中度，同时避免多对电极间电场的相互干扰，提升细胞或颗粒检测的信号强度。该方法对于准确获得单细胞或微粒稳定的、高信噪比的电阻抗值，具有非常重要的实用价值和创新意义，可有效解决目前单细胞电阻抗值不稳定，噪声干扰大的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及微机电工程技术领域和生物医学工程技术领域的细胞电阻抗检测技术，具体地，涉及一种基于库尔特计数原理的高性能单细胞电阻抗检测微电极设计与制备方法。

背景技术

微机电系统(MEMS)技术和生物细胞工程的发展和结合，为高精度细胞检测、计数等仪器的开发提供了重要保障。其中，电阻抗检测是利用MEMS系统的微小结构，使得单个细胞或微粒依次通过检测区域，这些细胞或微粒会引起检测区域的电阻抗变化，从检测电极上可以得到阻抗变化曲线，根据阻抗变化的幅值和跨度时间判断通过检测区域的细胞种类，完成该种类细胞的分类计数。电阻抗检测和分析在药物筛选、血细胞计数、食品检测、环境监控等领域都得到广泛的应用。面向细胞的电阻抗检测计数，具有快速、无标记、结构简单、对细胞伤害小等优点，逐步成为生物医学研究中一个有效的分析工具。

目前，对单细胞的检测和计数研究尚未完善，单细胞电阻抗检测往往伴随着高噪声和不稳定的缺点。因此，改善电阻抗检测中电极的布置方案，对提高单细胞阻抗值的信噪比具有重要意义。

荷兰科学家D.S.de Bruijn等人在Biosensors&Bioelectronics 173(2020)：112808撰文“Coccolithophore calcification studied by single-cell impedancecytometry：Towards single-cell PIC：POC measurements”，采用单侧共面电极实现了对钙化藻类细胞的识别。然而，该方法为了减少噪声对信号的影响，需要提前测得目标细胞的电阻抗特性，因此该方法无法识别未知细胞；且单侧共面电极产生的电场不均匀，细胞与电极之间的距离会对电阻抗信号产生重要影响。专利CN109852542A公开了一种单细胞电阻抗检测的微流控芯片及其加工方法，该微流控芯片采用两对对称电极对细胞电阻抗值进行差分检测；对称电极的电场均匀性优于共面电极，但两对电极产生的电场会相互干扰，影响检测效果。J.J.González-Murillo等人在2018Spanish Conference on Electron Devices,2018：1-4撰文“Electrical Impedance Spectroscopy Microflow Cytometer for cellviability tests”提出了通过添加接地电极改进电场集中度，提升细胞电阻抗检测性能的方法，但该微流控芯片采用共面电极，电场均匀性差。

因此，开发出一种电场更均匀、更集中的微电极设计与制备方法，对于准确检测细胞电学特性，具有非常重要的实用价值和创新意义。

发明内容

要解决的技术问题

为了解决目前单细胞电阻抗检测中信噪比低、精度不高等问题，本发明提出一种高性能单细胞电阻抗检测微电极及制备方法。

技术方案

一种高性能单细胞电阻抗检测微电极，其特征在于包括上层芯片、下层芯片，上层芯片上设有激发电极，下层芯片上设有检测电极，并在激发电极和检测电极周围设置接地电极，激发电极和检测电极分别位于微流体通道上下两侧；所述的激发电极与检测电极首先在芯片基底边缘形成触点，然后逐步向芯片中心延伸，最终在检测区域上下侧形成矩形电极片；激发电极和检测电极的长度为待测细胞或微粒最大方向尺寸的1.2～3倍；激发电极和检测电极的宽度需要完全覆盖微流体通道，并且多出微流体通道宽度的0.2～1倍。

本发明进一步的技术方案：接地电极与激发电极、检测电极的间距保持在10～500微米之间。

本发明进一步的技术方案：所述的激发/检测电极可为一对或多对。

本发明进一步的技术方案：所述的上层芯片和下层芯片的材料为玻璃或聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚碳酸酯PS。

本发明进一步的技术方案：所述的激发电极和检测电极的材料为金属。

本发明进一步的技术方案：所述的金属为氧化铟锡ITO、金或铂。

一种高性能单细胞电阻抗检测微电极的制备方法，其特征在于步骤如下：

步骤1：芯片基底制备：首先对上、下层芯片基底表面进行金属涂层图案化处理，由金属涂层形成激发电极、检测电极和接地电极；并在上层芯片打孔，形成细胞或微粒的入口和出口；

步骤2：微流体通道制备：在下层芯片基底表面旋涂一定厚度的光刻胶，然后经光刻、显影，形成微流体通道结构；

步骤3：芯片键合：将制备好的上层芯片基板与带有通道结构的下层芯片基板进行键合，形成包含上、中、下三层结构的微流控芯片。

有益效果

本发明提出的一种高性能单细胞电阻抗检测微电极及制备方法，该电极布置方案可以有效降低相邻检测区域之间及其与外围检测电路电场之间的相互干扰，提高检测信号的强度；同时改善检测区域电场的均匀性，提高检测精度。

现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提出在微通道上下两侧设计激发电极与检测电极，利用激发电极片与检测电极片的对称性在检测区域形成稳定的均匀电场，大大减少细胞通过检测区域时阻抗信号对细胞高度(细胞距检测电极的距离)的依赖性；同时在原有激发电极与检测电极的基础之上，提出在上下两层激发电极和检测电极区域的等间距外设置接地电极，利用接地电极零电势的特性，不仅可以大大改善电极边缘的电场分布从而进一步提高电场集中度，还可以避免相邻检测区域电场的相互干扰，从根本上提高细胞或微粒阻抗检测信号的精度和信噪比。

2、本发明设计了由大至小的渐变电极结构(激发/检测电极)。该电极结构触点位于上下芯片基底的边缘，该触点为正方形焊盘区域，该触点作为激发信号的输入和检测信号的输出，其大小略大于市面上常见的信号输入/输出触点，适用性好。激发/检测电极向内(芯片中部)经过等宽度的弧形区域后逐渐缩小，最终形成约为70×50um

3、本发明将上下层芯片表面的电极结构设计为中心对称(组成一个检测区域的上层激发电极与下层检测电极分别位于微流体通道两侧)，以降低上层电极信号对下层电极信号的影响。

4、本发明的电极制备方法中将传统的光刻、套刻、金属溅射等工艺结合起来，设计了上下中心对称的电极结构。该电极制备方法利用几项成熟的微纳制造工艺，可以大大提高电极制备的完整性和良品率。

附图说明

附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本发明的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的部件。

图1为本发明优选实施例的电阻抗检测区域截面图。

图2为本发明优选实施例的基于电阻抗细胞检测的微流控芯片结构示意图及芯片各层级示意图。

图3为本发明优选实施例的基于电阻抗细胞检测的微流控芯的上层芯片基底结构图及局部放大图，且局部放大图内部检测区域中的灰色虚线表示微流体通道在上层芯片基底中的投影。

图4为本发明优选实施例的基于电阻抗细胞检测的微流控芯片的微流体通道结构图及局部放大图。

图5为本发明优选实施例的基于电阻抗细胞检测的微流控芯片下层芯片基底结构图及局部放大图，且局部放大图内部检测区域中的灰色虚线表示微流体通道在下层芯片基底中的投影。

图6为本发明优选实施例在有无接地电极情况下的电场分布仿真图及其局部放大图。

图7为本发明优选实施例中细胞或微粒在检测区域I、II中的阻抗值。

图8为本发明优选实施例中包含三个检测区域的微流控芯片结构示意图以及局部放大图。

图中标记分别表示为：下层芯片基底1、位于中层芯片中的微流体通道2、上层芯片基底3、接地电极4、激发电极5、待检测的细胞或者微粒6、检测电极7、中层芯片8、入口9、出口10、过滤圆柱11、微流体通道宽度12、电极多出微流体通道的宽度13。

其中，特别将靠近入口处由激发电极5和检测电极7组成的检测区域称为检测区域I、靠近出口处的由激发电极5和检测电极7组成的检测区域称为检测区域II。检测区域I和检测区域II共同组成了该微流控芯片的检测区域。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提出的高性能电阻抗检测的电极的布置方案包括在微通道上下两侧分别设置激发电极和检测电极，并在激发电极和检测电极周围设置接地电极。

在微通道上下两侧分别设置激发电极和检测电极的布置方案，可以使得微通道中的检测区域始终处于均匀电场之下，该激发电极与检测电极首先在芯片基底边缘形成触点(分别用于施加激发电信号与读取检测电信号)，然后逐步向芯片中心延伸，最终在检测区域上下侧形成微小的矩形电极片(激发电极片与检测电极片)。该激发电极片和检测电极片的长度(沿细胞或微粒流动方向)应为待测细胞或微粒最大方向尺寸的1.2～3倍；激发电极片和检测电极片的宽度(垂直细胞或微粒流动方向)需要完全覆盖微流体通道，并且多出微流体通道宽度的0.2～1倍，即多出电极宽度13为微流体通道宽度12的0.2～1倍。

在激发电极和检测电极周围设置接地电极，接地电极与激发电极、检测电极的间距保持在10～500微米，用于增强电场集中度并降低相邻电场之间的串扰。

使得细胞或微粒依次单个通过检测区域内微流体通道的宽度和高度应为待测细胞或微粒最大方向尺寸的1.2～3倍。检测区域外的微流体通道的高度与检测区域内微流体通道的高度保持一致，宽度应宽于检测区域内微流体通道的宽度，检测区域内微流体通道的长度依据激发/检测电极、接地电极以及其间隔而定。

本发明还提出了一种高性能单细胞电阻抗检测微电极的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、芯片基底制备：首先对上、下层芯片基底表面进行图案化金属涂层处理，由金属涂层形成激发电极、检测电极和接地电极。并在上层芯片打孔，形成细胞或微粒的入口和出口。

步骤二、微流体通道制备：在下层芯片基底表面旋涂一定厚度(微流体通道高度)的光刻胶，然后经光刻、显影等操作，形成微流体通道结构。

步骤三、芯片键合：将制备好的上层芯片与带有微流体通道结构的下层芯片进行键合，形成包含上、中、下三层结构的微流控芯片。

所述的三层芯片制备方案中，上、下层芯片基底中的电极布置方案采用中心对称式设计，即组成一个检测区域的上层激发电极与下层检测电极分别位于微流体通道两侧，以降低上层电极信号对下层电极信号的影响。

实施例1：

在具体实施中，电阻抗检测区域附近的电极(激发电极、检测电极、接地电极)布置方案，参照图1。整体芯片结构分为三层，参照图2，具体检测芯片各层结构如下：

上层芯片基底3，材料可以选择为玻璃，并在玻璃的下表面进行图案化金属溅射，最终形成两个激发电极5和接地电极4，激发电极5由芯片边缘逐步向内延伸。首先在芯片边缘处形成一个2×2mm

中层芯片8，该层芯片的主要目的是构建微流体通道2，该微流体通道整体为长为10.5mm宽为0.5mm的矩形通道结构，并在矩形通道的中部设计宽度和厚度仅为细胞或微粒最大方向尺寸的1.2～3倍的微米级的微流体通道，利用检测区域微小的几何尺寸使得细胞或微粒依次单个通过。在通道两侧设计直径为1mm的圆形结构是为了配合上层芯片的入口孔和出口孔，实现细胞或微粒的流入流出。同时，该检测区域上下紧靠激发/检测电极，因此该区域内可以形成稳定的均匀电场。特别的，本发明在细胞或微粒流入通道中设计过滤圆柱11，该过滤圆柱11的目的是为了滤去溶液中的大颗粒残渣，防止堵塞微小的检测区域，并保证待检测细胞或微粒可以顺利通过。

常见细胞的尺寸大概维持在1～20微米，这对中层芯片8的厚度和通道的宽度有较高要求。因此中层芯片8采用光刻的加工工艺，即直接在下层芯片基底1的结构上旋涂光刻胶，经掩模板对准、曝光、显影后，形成厚度为30um的中层芯片8，检测区域中微流体通道的宽度为30um。具体结构参照图4。

下层芯片基底1，材料可以选择为玻璃，并在玻璃的上表面进行图案化金属溅射。下层芯片检测电极和接地电极的结构与上层芯片电极的结构互为中心对称结构，结构尺寸一致。这在一定程度上防止了上层激发电极信号对于下层检测电极信号的干扰。具体结构参照图5。

中层芯片8与下层芯片基底1在光刻工艺已完成键合，对于中层芯片8与上层芯片基底3的键合，首先使用等离子清洗机进行表面改性，然后完成中层芯片8与上层芯片基底3的键合，整体芯片结构参照图2。

参考图2，整体芯片的上层芯片基底3中的两个激发电极5分别与下层芯片基底1中对应的检测电极7构成双检测区域，特别的，将靠近入口处的检测区域定为检测区域I、靠进出口处的检测区域定为检测区域II。

参考图2，本实施例中在进行细胞或微粒检测中，首先分别对上层芯片基底3中的两个激发电极5施加电信号，并将下层芯片基底中检测电极7的感应到的信号接入电阻抗分析仪，上下两层构成均匀检测电场，并将上(下)芯片基底的接地电极4接地，增大检测区域的电场集中度。细胞或微粒的悬浮液从入口9通入，由出口10流出，利用两对检测区域对细胞的阻抗信号进行差分放大。

参考图6，基于本实施例的电场仿真，可以发现设置接地电极可以大大增强电场集中度，改善芯片中的电场分布。同时，参照图7可以发现，在设置接地电极的情况下，细胞或微粒经过检测区域引起的阻抗变化量更大，这将大大提高电阻抗检测的信号强度。

实施例2：

在另一具体实施例中，可以对各层芯片的使用材料进行替换，以达到相同的增强电场均匀性和电场集中度的效果。如上下层芯片的设计材料可以从玻璃更改为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PS)等等，上下层芯片中电极材料可以选用氧化铟锡(ITO)、金、铂等等。

实施例3：

在另一具体实施例中，可以对检测电极和接地电极的个数进行增多或减少，在细胞的电阻抗检测中，对激发电极施加不同频率的电压，往往可以得到更多的细胞信息，便于后期细胞的鉴别与分类计数。因此，在该实施例中设计了三对电极的三检测区域设计方案，参考图8。该三检测区域芯片依然有三层芯片基底叠加而成，上层芯片的下表面处利用金属溅射在制作了三个由边缘向内部延伸的激发电极和围绕在激发电极外的接地电极；中层芯片依据待检测细胞的尺寸大小设计了微米通道，使得细胞或微粒可以依次单个通过检测区域；下层芯片上表面处设计与上层芯片互为中心对称结构的检测电极和接地电极。如此，三层芯片基底的叠加可以在就检测区域上下形成三对激发/检测电极。依此，可以对三个激发电极施加不同的检测信号，获得更多的细胞信息，以达到提高细胞或微粒电阻抗检测性能的目的。

本发明与传统共面电极单细胞电阻抗检测相比，两侧对称电极可以使得检测区域的电场分布更加均匀，提高检测精度；而设置接地电极可以提高检测区域的电场集中度，同时避免多对电极间电场的相互干扰，提升细胞或颗粒检测的信号强度。该方法对于准确获得单细胞或微粒稳定的、高信噪比的电阻抗值，具有非常重要的实用价值和创新意义，可有效解决目前单细胞电阻抗值不稳定，噪声干扰大的问题。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。