硝酸盐在提高湖羊胃肠道组织形态发育及微生物改善中的应用

摘要

本发明提供了硝酸盐在提高湖羊胃肠道组织形态发育及微生物改善中的应用，在饲料中添加1～3％的硝酸盐喂养湖羊，能有效提高湖羊胃肠道的组织形态发育及改善微生物的种群，能有效提高湖羊胴体、头、蹄及内脏器官的重量，提高结肠的纤维分解能力，对饲粮能更好的吸收利用。

说明书

技术领域

本发明属于技术领域，具体涉及硝酸盐在提高湖羊胃肠道组织形态发育及微生物改善中的应用。

背景技术

反刍动物的瘤胃在消化过程中起着关键性作用，瘤胃内富含各种微生物。动物采食后，饲草料进入瘤胃，饲草料中的各种营养物质，在瘤胃微生物的作用下进行降解，降解产物被微生物吸收以后转化成动物所需的各种营养物质和能量。瘤胃微生物可以将粗纤维和碳水化合物降解成挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)，并放出能量。还可以将饲料中的蛋白质分解成氨基酸和小肽，然后利用这些氨基酸、小肽和瘤胃中其他的非蛋白氮来合成更优质的菌体蛋白。据报道，硝酸盐具有影响反刍动物瘤胃发酵的作用。反刍动物采食含有硝酸盐的饲粮后，在瘤胃内无氧的条件下，瘤胃微生物通过分解作用，将其先还原成亚硝酸盐，最终生成氨态氮。硝酸盐在瘤胃内经亚硝酸盐生成氨态氮的过程中，可通过消耗氢而抑制丙酸生成，并促进纤维降解菌的增殖，从而影响瘤胃的发酵模式，有研究发现在奶牛饲草料中添加硝酸盐可以调节瘤胃液pH值，但氨态氮和VFA含量未见明显变化。但是对于湖羊胃肠道组织形态发育及微生物变化还未有报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供硝酸盐在提高湖羊胃肠道组织形态发育及微生物改善中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

硝酸盐在提高湖羊胃肠道组织形态发育及微生物改善中的应用。

如上所述的应用，优选地，所述硝酸盐的用量为在饲料中占1～3％。

如上所述的应用，优选地，所述饲料包括按质量份计的玉米秸秆15～18份，大豆皮9～11份，葵花皮1～3份，玉米45～50份，豆粕10～12份，芝麻饼2～4份，糖蜜3～6份，石粉0.2～0.5份，NaCl 0.60～0.8份，预混料0.5～1.50份，硝酸盐1～3.5份。

如上所述的应用，优选地，预混料为每kg饲粮提供铁(Fe)25mg，锰(Mn)40mg，锌(Zn)40mg，铜(Cu)8mg，碘(I)0.3mg，硒(Se)0.2mg，钴(Co)0.1mg，维生素A(VA)940IU，维生素D(VD)111IU，维生素E(VE)20IU。

如上所述的应用，优选地，所述饲料包括按质量份计的玉米秸秆17.76份，大豆皮10.34份，葵花皮2.00份，玉米48.60份，豆粕11.35份，芝麻饼3.00份，糖蜜5.00份，石粉0.25份，NaCl 0.70份，预混料1.00份，硝酸盐3份。

如上所述的应用，优选地，所述硝酸盐为硝酸钙。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的的方法，在饲料中添加硝酸钙后喂养湖羊，显著升高了湖羊的瘤胃乳头宽度、肌层厚度和回肠绒毛宽度，显著降低了皱胃黏膜厚度，空肠绒毛长度、绒毛宽度和绒隐比，表明硝酸钙对湖羊的胃肠道组织形态发育具有一定影响，对瘤胃和回肠组织形态发育具有明显改善作用，提高养分吸收利用率；能有效提高湖羊胴体、头、蹄及内脏器官的重量；显著降低十二指肠和结肠甲烷球菌，显著降低结肠甲烷短杆菌并有降低瘤胃甲烷短杆菌的趋势，表明硝酸钙能抑制湖羊胃肠道甲烷产生，有利于环保。虽然硝酸钙抑制湖羊瘤胃发酵使纤维分解能力有所降低，但硝酸钙提高湖羊结肠琥珀酸弧菌丰度而提高结肠中纤维物质的分解和利用效率，对饲粮能更好的吸收利用。

附图说明

图1为物种多样性的稀释曲线。

图2为胃肠道门水平上的物种相对丰度柱形图。

图3为瘤胃微生物菌群主坐标分析图。

图4为十二指肠微生物菌群主坐标分析图。

图5为结肠微生物菌群主坐标分析图。

图6为UPGMA聚类树和各样本在门水平上的物种相对丰度分布图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1

挑选健康，生长发育良好，体重接近的120日龄湖羊公羔30只用于生长育肥试验，将选好的湖羊按照组间体重相近的原则随机分成2组，每组15只，每只为一个重复。对照组湖羊饲喂基础饲粮，试验组湖羊饲喂含有3％硝酸钙的饲粮。过渡期15d，正试期60d，待湖羊饲养至61d时进行屠宰。

在挑选试羊之前，用强力消毒灵对试验所用羊舍进行全方位消毒，消毒后的羊舍让其舍内消毒液挥发一段时间后再进羊，以免造成羊只的不适感。试验正式开始后，采用单笼饲养，每天分早上和下午各喂一次饲粮，使其自由采食，自由饮水。试验在甘肃省民勤县德福农业科技有限公司完成。所用饲粮均由甘肃润牧生物工程有限责任公司生产加工，饲粮组成(按质量份计)及其营养成分见表1。

表1饲粮组成及其营养成分表(干物质基础)

其中，预混料为每kg饲粮提供：铁(Fe)25mg，锰(Mn)40mg，锌(Zn)40mg，铜(Cu)8mg，碘(I)0.3mg，硒(Se)0.2mg，钴(Co)0.1mg，维生素A(VA)940IU，维生素D(VD)111IU，维生素E(VE)20IU。

一、样品采集：

1、组织器官样品

试羊屠宰后，依次对头、蹄和内脏器官进行称重，记录数据。测量羊皮张的大小，记录数据。并计算其占宰前活重比，结果见表1。

表1饲粮中添加硝酸钙对湖羊屠宰性能和组织器官的影响

由可以看出，饲粮中添加硝酸钙对湖羊屠宰性能和组织器官有提高作用，但不显著(P＞0.05)。

2、胃肠道样品

试羊屠宰后，将胃肠道进行分离，分离后对胃肠不同部位进行称重，记录重量，测量各肠段的长度。计算不同胃重占总胃重比，不同肠段重占总肠段重比，不同肠段长度占总肠段长度比。同时用剪刀将瘤胃、十二指肠和结肠剪开，使得内容物外漏，然后用灭过菌的冻存管收集瘤胃、十二指肠和结肠食糜，将装有胃肠道食糜的冻存管快速放于液氮中冻存，后转移至-80℃冰箱保存，用于后续微生物测定。之后用剪刀分别从瘤胃、十二指肠和结肠中部剪取约2cm

二、试验方法及结果

胃肠道组织切片的制作及观察：将采集好的胃肠道组织送至湖南长沙志凡生物科技有限责任公司使用苏木精-伊红染色法进行切片制作。使用Olympus-DP71显微镜对切片进行观察，统计不同肠道组织肌层厚度、隐窝深度及绒毛长度和宽度，并计算绒隐比。统计瘤胃组织乳头长度、宽度、肌层厚度及上皮细胞厚度结果见表2。

表2饲粮中添加硝酸钙对湖羊胃肠道相对质量及相对长度的影响

结果表明饲粮中添加硝酸钙显著降低了湖羊盲肠/总肠道重(P＜0.05)，对其他胃肠道相对质量及相对长度没有显著影响。

表3饲粮中添加硝酸钙对湖羊胃肠道组织形态的影响

表3的结果说明，饲料中添加硝酸钙显著升高了湖羊瘤胃乳头宽度、肌层厚度和回肠绒毛宽度(P＜0.05)，显著降低了皱胃黏膜厚度，空肠绒毛长度、绒毛宽度和绒隐比(P＜0.05)，对其他胃肠道组织形态没有显著影响(P＞0.05)。这表明，硝酸钙对湖羊胃肠道组织形态发育具有一定影响，对瘤胃和回肠组织形态发育具有改善作用。

三、胃肠道微生物多样性的测定

1微生物多样性的测定

将采集的瘤胃食糜、结肠食糜和十二指肠食糜送至北京诺禾致源科技股份有限公司，利用Illumina NovaSeq平台进行测序。主要操作流程：采用CTAB法对食糜样本总基因组DNA进行提取。然后使用1％的琼脂糖凝胶对提取到的基因组DNA进行浓度和纯度的监测，结果见图1。其中，图中SR.A(十二指肠对照组)，SR.C(十二指肠硝酸钙组)，JC.A(结肠对照组)，JC.C(结肠硝酸钙组)，LW.A(瘤胃对照组)，LW.C(瘤胃硝酸钙组)。结果表明所有样品的稀释曲线趋向平坦，说明测序数据量渐进合理，能够很好反映胃肠道样品内绝大部分的微生物情况。

待DNA质量合格后，使用特异性引物16S V3-V4

通过Illumina NovaSeq测序，瘤胃共获得1,285,763个原始下机序列，经过拼接和过滤后剩余799,104个用于分析的有效序列，平均每个样本含有49,944个有效序列，每个序列长度平均为417bp。结肠共获得1,697,211个原始下机序列，经过拼接和过滤后剩余1,043,921个用于分析的有效序列，平均每个样本含有65,245个有效序列，每个序列长度平均为413bp。十二指肠共获得1,695,420个原始下机序列，经过拼接和过滤后剩余1,045,420个用于分析的有效序列，平均每个样本含有65,338个有效序列，每个序列长度平均为410bp。根据聚类得到OTUs结果和研究需求，分析对照组和硝酸钙组之间共有和特有微生物。在97％相似水平下，十二指肠食糜样本中共产生2248个OUTs，其中对照组1848个，硝酸钙组1951个，2组共享1551个。结肠食糜样本中共产生2554个OUTs，其中对照组2180个，硝酸钙组1798个，2组共享1424个。瘤胃食糜样本中共产生3149个OUTs，其中对照组2344个，硝酸钙组2429个，2组共享1624个。

2生物信息分析

测序后得到的原始序列，首先经过FLASH对成对的末端读数进行合并拼接；然后在特定的过滤条件下对原始序列进行质量过滤，将序列与参考数据库进行比较，检测嵌合体序列，并去除嵌合体，最终得到有效序列。使用Uparse软件对序列进行分析，将具有≥97％相似性的序列分配给相同的OUT。对于每个代表序列，使用Silva数据库来注释分类信息。为了研究不同OTUs的系统发育关系以及不同样品(组)中优势种的差异，使用MUSCLE软件进行了多序列比对。使用对应于序列最少的样品的序列号标准对OTU的丰度信息进行归一化。随后根据此输出归一化数据对Alpha多样性和Beta多样性进行了分析。使用QIIME(版本1.7.0)软件计算，通过R软件(版本2.15.3)进行显示Alpha多样性。使用QIIME软件(版本1.9.1)计算加权和非加权unifrac的Beta多样性。根据物种注释结果，选取每组在门分类水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，并计算其组间差异显著性。基于WeightedUnifrac距离绘制的胃肠道微生物群落主坐标分析图。并对不同胃肠道微生物进行门水平上聚类分析，绘制最大相对丰度排名前十的物种组成分布的样本聚类树，结果如下：

α多样性分析

在97％一致性阈值下，湖羊不同胃肠道的Alpha多样性指数(shannon、simpson、chao1、ACE、goods_coverage)见表4。

表4饲粮中添加硝酸钙对湖羊胃肠道微生物Alpha多样性指数的影响

由表4可以看出，饲粮中添加硝酸钙显著降低了湖羊结肠食糜中chao1指数和ACE指数(P＜0.05)，显著升高了结肠食糜中覆盖度(P＜0.05)，对其他胃肠道Alpha多样性指数无显著影响(P＞0.05)。说明硝酸钙降低了湖羊结肠中微生物物种总数和群落中OUT数目。本发明中，对照组湖羊结肠共得到9741个OUT，平均每个样本1271个OUT；硝酸钙组共得到8560个OUT，平均每个样本1070个OUT。对照组湖羊瘤胃共隔得6295个OUT，平均每个样本787个OUT；硝酸钙组共得到5899个OUT，平均每个样本737个OUT。本发明的OUT数目高于陈志远.硝酸盐对湖羊瘤胃硝态氮消失率、发酵特性及微生物区系的影响[D].江苏扬州:扬州大学,2016.的平均每个样本515OUT的检测结果，远高于Pandya P,Singh K,Parnerkar S,etal.Bacterial diversity in the rumen of Indian Surti buffalo(Bubalus bubalis),assessed by 16S rDNA analysis[J].Journal of Applied Genetics,2010,51(3):395-402.平均每个样本14个OUT。这就表明，本发明有更为丰富的胃肠道微生物信息用于研究，研究结果更具有代表性。

β多样性分析

胃肠道门水平上的物种相对丰度柱形图见图2，图中：SR.A(十二指肠对照组)，SR.C(十二指肠硝酸钙组)，JC.A(结肠对照组)，JC.C(结肠硝酸钙组)，LW.A(瘤胃对照组)，LW.C(瘤胃硝酸钙组)。饲粮中添加硝酸钙对湖羊门水平上胃肠道微生物物种丰富度的影响见表5。

表5饲粮中添加硝酸钙对湖羊门水平上胃肠道微生物物种丰富度的影响

由图2和表5可以看出，在不同组湖羊胃肠道中拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actionbacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和广古菌门(Euryarchaeotad)的相对丰富度约占90％。其中，瘤胃中优势菌为拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes)，分别占47.40％和28.65％；结肠中优势菌为拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes)，分别占21.92％和57.34％；十二指肠中优势菌为放线菌门(Actionbacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)和广古菌门(Euryarchaeotad)，分别占22.96％、53.60％和13.14％。此外，不同处理湖羊胃肠道内的微生物菌群组成也大不相同。

由表5可以看出，饲粮中添加硝酸钙显著降低了湖羊瘤胃中纤维杆菌门(Fibrobacterota)、结肠中放线菌门(Actionbacteriota)和广古菌门(Euryarchaeotad)的丰富度(P＜0.05)，显著升高了十二指肠中变形菌门(Proteobacteria)和Others菌的丰富度(P＜0.05)，对其他胃肠道微生物物种丰富度无显著影响(P＞0.05)。

胃肠道微生物菌群主坐标分析图如图3-5所示，图中，SR.A(十二指肠对照组样本)，SR.C(十二指肠硝酸钙组样本)，JC.A(结肠对照组样本)，JC.C(结肠硝酸钙组样本)，LW.A(瘤胃对照组样本)，LW.C(瘤胃硝酸钙组样本)。图3中可看出PCoA1的贡献率为35.71％，PCoA2的贡献率为22.87％时，硝酸钙组和对照组湖羊瘤胃样本距离较近，表明两处理组间湖羊瘤胃微生物群落结构组成相似度较高。硝酸钙组湖羊瘤胃样本分布比较离散，而对照组湖羊瘤胃样本比较集中，说明硝酸钙组内个体间瘤胃微生物结构组成相似度低于对照组内个体间。从图4中可以看出，PCoA1的贡献率为38.75％，PCoA2的贡献率为22.51％时，硝酸钙组和对照组湖羊十二指肠样本相区分，表明两处理组间湖羊十二指肠微生物群落结构组成相似度较低。从图5中可以看出，PCoA1的贡献率为45.91％，PCoA2的贡献率为12.87％时，硝酸钙组和对照组湖羊结肠样本明显相区分，表明两处理组间湖羊结肠微生物群落结构组成相似度很低。

硝酸钙对湖羊属水平上胃肠道产甲烷菌丰度的影响结果见表6，由表中结果可以看出，饲粮中添加硝酸钙显著降低了湖羊结肠中甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)和甲烷球形菌(Methanosphaera)的丰度(P＜0.05)，显著降低了十二指肠中甲烷球形菌(Methanosphaera)的丰度(P＜0.05)。

表6饲粮中添加硝酸钙对湖羊属水平上胃肠道产甲烷菌丰度的影响

饲粮中添加硝酸钙对湖羊属水平上胃肠道纤维分解菌的影响结果见表7。可以看出，饲粮中添加硝酸钙显著降低了湖羊瘤胃丝状杆菌(Fibrobacter)的丰度(P＜0.05)，对其他胃肠道属水平上的纤维分解菌无显著影响(P＞0.05)。

表7饲粮中添加硝酸钙对湖羊属水平上胃肠道纤维分解菌的影响

结果表明，硝酸钙对湖羊结肠中琥珀酸弧菌属有升高趋势(P＜0.10)，这表明硝酸钙可以提高湖羊结肠的纤维分解能力。纤维分解菌在分解纤维时，会产生氢气，而硝酸盐的还原过程需要消耗氢，从而促进纤维分解菌的快速分解，增强其分解能力。

UPGMA聚类树和各样本在门水平上的物种相对丰度分布图见图6。图中左侧是聚类树结构，右侧是每组每个样本在门水平上的物种相对丰度分布图，其中，SR.A(十二指肠对照组)，SR.C(十二指肠硝酸钙组)，JC.A(结肠对照组)，JC.C(结肠硝酸钙组)，LW.A(瘤胃对照组)，LW.C(瘤胃硝酸钙组)。厚壁菌门(Firmicutes)，拟杆菌门(Bacteroidota)，变形菌门(Proteobacteria)，未明确细菌(unidentified_Bacteria)，放线菌门(Actinobacteriota)，螺旋体门(Spirochaetota)，酸杆菌门(Acidobacteriota)，Verrucomicrobiota，绿弯菌门(Chloroflexi)，广古菌门(Euryarchaeota)，其他细菌Others。由此可以看出，湖羊瘤胃、结肠和十二指肠不同胃肠道微生物相区分，这表明不同胃肠道微生物组成不同。其中对照组和硝酸钙组湖羊结肠的微生物相似度较低，很明显的形成两簇，这表明硝酸钙对结肠微生物组成的影响较大。在饲粮中添加硝酸钙以后，湖羊瘤胃和十二指肠中的微生物组成相似度较高，表明硝酸钙对湖羊瘤胃和十二指肠微生物组成影响较小。

由上可看出，饲粮添加硝酸钙对湖羊胃肠道微生物组成有所改善。通过硝酸钙对湖羊胃肠道微生物区系的调控，可有效降低湖羊胃肠道甲烷排放，实现环境友好型湖羊饲养。此外，还通过湖羊结肠微生物区系的调控，提高湖羊结肠中纤维物质的消化吸收利用效率。

与其他反刍动物饲养中使用的饲料添加剂或甲烷抑制剂效果相比，本发明研究发现湖羊饲养中适量硝酸钙的使用，在不影响湖羊生产性能的前提下，通过抑制胃肠道产甲烷古细菌丰度，有效降低湖羊胃肠道甲烷排放，是目前建设环境友好型及可持续发展湖羊养殖业的最佳选择。