用于治疗癫痫和相关病症的经鼻给药的药物组合物

摘要

一种经鼻给药的液体，所述经鼻给药的液体包括悬浮液和粘性液体组合物，内含治疗有效剂量的(Z)‑2‑(3,5,5‑三甲基‑2‑环己烯‑1‑亚基)乙酸、其盐或类似物，以及配合适当的药物成分，用来治疗癫痫和相关CNS病症。

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请是于2020年4月15日提交的题为“用于治疗癫痫和相关病症的经鼻给药的药物组合物(NASALLY ADMINISTERED PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENTOF EPILEPSY AND RELATED DISORDERS)”的美国专利申请序列号16/849,804的继续申请，所述美国专利申请的内容通过全文引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于经鼻施用的含有(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸的药物组合物、制造方法以及其在神经系统病症(特别是癫痫)中的用途。根据本发明，含有(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸和其类似物的鼻用药物组合物可以用于治疗CNS病症，如癫痫、疼痛、焦虑、痉挛、偏头痛和中风。

本发明含有(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸的鼻用药物组合物是用治疗有效量的(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸调配的悬浮液或粘性液体药物组合物(即，乳膏剂、凝胶剂和乳剂)，并且经鼻给药以治疗癫痫病症。

背景技术

如癫痫、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、多发性硬化症、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、慢性年龄相关神经退行性疾病等神经系统疾病与神经功能的改变有关，并且这些疾病的负担随着高昂的医疗费用在全球范围内不断增加。在全球范围内，癫痫是一种主要的神经系统病症，普遍存在于发展中国家。

当前可用的化学治疗剂不能完全治愈癫痫，并且在大多数情况下，癫痫患者不得不终生依靠药物来控制癫痫发作，而大多数药物具有严重的副作用。鉴于大量不可控制的癫痫患者以及使用现有药物的患者经历的副作用，迫切需要更具选择性和毒性较小的抗惊厥药物。

由于若干优点，如鼻粘膜的表面积较大、与注射/口服给药相当的快速起效作用、与胃肠道和经过肝脏首过代谢相比酶促降解的机会较低，经鼻给药是用于全身递送药物的合适方法。经鼻给药重点在于，一定量的药物可以通过嗅觉神经元直接递送到脑组织或脑脊液中，从而为中枢神经系统疾病提供更好的治疗。例如，开发了佐米曲坦(zolmitriptan)(美国专利第5,466,699A号)以治疗偏头痛；然后其以鼻喷雾制剂的形式进行商业化使用(美国专利第6,750,237号)。药物经鼻施用的程序在文献中已有报道，例如，在美国专利申请序列号13/194,928和申请第

PCT/IB2012/001127号中描述了用于睾丸素的油基媒剂。溶解度差的药物难以被开发为经鼻给药制剂，并且所述药物需要适当的表面活性溶剂以增加药物通过鼻用途径的吸收。因此，期望将合适的媒剂用于对鼻粘膜无毒性的鼻用药物。然而，没有相关报道来确保特定类别的药物更适合于经鼻施用，也没有任何数据显示对用于特定治疗的药物进行测试的启示。

附图说明

图1描绘了在PTZ诱导癫痫急性模型中Z-酸降低癫痫发作评分。应用单向方差分析(One-Way ANOVA)，P*<0.05，P**<0.01。

图2描绘了在Z-酸腹腔给药后，利用GC/MS检测到的血浆中Z-酸的水平。数据值用平均值±SEM(n＝4)表示。

图3描绘了Z-酸腹腔给药后，在不同时间点收集的脑样品中检测到的Z-酸浓度的图示。数据值用平均值±SEM(n＝4)表示。

图4描绘了大鼠Z-酸制剂鼻内给药后，在不同时间点收集的血浆样品中，运用超高效液相色谱法(UPLC)检测Z-酸浓度的图示。数据值用平均值±SEM(n＝4)表示。

图5描绘了大鼠Z-酸制剂鼻内给药后，在不同时间点收集的脑样品中，运用UPLC检测Z-酸浓度的图示。数据值用平均值±SEM(n＝4)表示。

图6描绘了兔Z-酸制剂鼻内给药后，在不同时间点收集的血浆样品中，运用UPLC检测Z-酸浓度的图示。数据值用平均值±SEM(n＝4)表示。

图7描绘了示波器，其显示了腹腔注射Z-酸对PTZ诱导的癫痫样的影响。在PTZ注射10分钟后注射Z-酸。

图8描绘了在PTZ诱导的癫痫样动物模型中Z-酸腹腔给药的作用。

图9描绘了示波器，其显示了Z-酸制剂经鼻给药对PTZ诱导的癫痫样的影响。在PTZ注射30分钟之前进行Z-酸给药。

图10描绘了在PTZ诱导的癫痫样动物模型中Z-酸制剂鼻内给药的作用。

图11在皮质(a)和海马(b)中观察腹腔给药Z-酸和安定(diazepam)对PTZ诱导大鼠急性癫痫发作模型中BDNF基因表达的影响。数据值用平均值±SEM(n＝3)表示。统计学显著性基于双因素方差分析，和之后的邦弗朗尼事后检验(Bonferroni post-hoc test)，与对照动物相比，**p<0.01；与PTZ组相比，++p<0.01。

图12在皮质(a)和海马(b)中观察观察腹腔给药Z-酸和安定对PTZ诱导大鼠急性癫痫发作模型中cfos基因表达的影响。数据值用平均值±SEM(n＝3)表示。统计学显著性基于双因素方差分析，和之后的邦弗朗尼事后检验，与对照动物相比，**p<0.01；与PTZ组相比，++p<0.01。

图13在皮质(a)和海马(b)中观察鼻内给药Z-酸制剂和安定对PTZ诱导大鼠急性癫痫发作模型中BDNF的基因表达的影响。数据值用平均值±SEM(n＝3)表示。统计学显著性基于单因素方差分析，和之后的邦弗朗尼事后检验，与对照动物相比，**p<0.01；与PTZ组相比，++p<0.01。

图14在皮质(a)和海马(b)中观察鼻内给药Z-酸制剂和安定对PTZ诱导大鼠急性癫痫发作模型中c-fos的基因表达的影响。数据值用平均值±SEM(n＝3)表示。统计学显著性基于单因素方差分析，和之后的邦弗朗尼事后检验，与对照动物相比，**p<0.01；与PTZ组相比，++p<0.01。

图15在皮质(a)和海马(b)中观察腹腔注射Z-酸和安定对PTZ诱导大鼠急性癫痫发作模型中谷氨酸盐水平的影响。数据值用平均值±SEM(n＝3)表示。统计学显著性基于双因素方差分析，和之后的邦弗朗尼事后检验，与对照动物相比，**p<0.01；与PTZ组相比，++p<0.01。

图16在皮质(a)和海马(b)中观察鼻内给药Z-酸调制剂对PTZ诱导大鼠急性癫痫发作模型中谷氨酸盐水平的影响。数据值用平均值±SEM(n＝3)表示。统计学显著性基于双因素方差分析，和之后的邦弗朗尼事后检验，与对照动物相比，**p<0.01；与PTZ组相比，++p<0.01。

图17在施用Z-酸制剂I(50mg/kg，鼻内)3个月后，大鼠血清中的肾脏概况、钙和镁的图示。

图18在施用Z-酸制剂I(50mg/kg，鼻内)3个月后，大鼠血清中的胆红素和蛋白质的图示。

图19在施用Z-酸制剂I(50mg/kg，鼻内)3个月后，大鼠血清中的肝脏概况和甘油三酸酯的图示。

具体实施方式

本发明涉及(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸以含有油脂和表面活性剂的药物组合物形式的经鼻递送。本发明是(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸的鼻用制剂，与腹腔给药相比时，所述鼻用制剂在化合物的活性方面表现出十倍的提高，这是令人惊讶的。在确定(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸的抗惊厥和抗癫痫活性后，研制了试验化合物的鼻用制剂。所述制剂以不同剂量通过鼻腔给药途径进行施加。在50mg/kg(体重)的活性化合物剂量下进行了有趣的观察，经鼻递送制剂的活性足以阻断大鼠的PTZ诱导癫痫样行为(因为本发明测试组中的动物体重为200-210g)。本发明进行了为期3个月的关于大鼠Z-酸腹腔给药和Z-酸经鼻给药制剂的亚慢性毒性测试。在研究结束时，处死动物后对样品进行处理并进行大体解剖观察。在经处理的动物中未发现任何毒性迹象。

抗惊厥药(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸的合成

(E/Z)-2,2'-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸的抗惊厥异构体混合物的合成是通过水解E/Z酯2的异构体混合物来进行的(方案-1)。异木酮(isoxylitone)酸类似物的E/Z异构体混合物难溶于水，E/Z异构体混合物可以通过光谱学研究进行表征(美国专利申请14/609,211)。

方案-1：(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸的合成

纯净的异构体(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸是从酸的E/Z-混合物重结晶的纯净体中获得(方案-1)，并且通过光谱学研究进行表征。

本发明描述了纯净的(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸(Z-酸)的详细的抗惊厥活性，并且开发了(Z)-2-(3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-亚基)乙酸的经鼻给药制剂以抑制PTZ诱导的癫痫发作。在进行任何药理学测试之前，在不同的色谱条件下，通过

异木酮的新类似物的合成

方案2：Z-酸的肽类似物的合成将丝氨酸、甘氨酸和赖氨酸以及γ-氨基丁酸与Z-酸偶联以开发更多新的类似物(方案2)。在这些类似物中，Z-酸-Lys-Lys-OH是水溶性的，并且发现其在经鼻途径中具有活性。

制剂

为了进行测试，将Z-酸、以下制剂混配为粘性悬浮液：

制剂1

Z-酸20g，菜籽油适量至100mL

制剂2

Z-酸20g，橄榄适量至100mL

制剂3

Z酸20g，吐温(Tween)2g，橄榄油适量至100mL

制剂4

Z酸20g，甘油5g，橄榄油适量至100mL

给药

Z-酸制剂通过鼻内途径施用在轻度麻醉注射的大鼠上，来进行脑电图记录。Z-酸制剂以50mg/kg的剂量给药，因此，一只大鼠(～200g)的Z-酸药用组合物为10mg Z-酸。对于每种制剂，本发明观察到相同的结果，即对急性PTZ诱导的癫痫样行为具有100％的功效。

药理学筛选

在急性癫痫发作模型(抗惊厥活性)和慢性癫痫发作模型(抗癫痫活性)两者中进行化合物的筛选。点燃癫痫模型被认为是慢性癫痫模型，其主要用于评估测试药物的抗癫痫活性。PTZ测试最常用于新抗癫痫药物(AED)的初步筛选。在当前的研究中，最初使用scPTZ诱导癫痫发作的急性模型和点燃癫痫模型来评估Z-酸的抗惊厥和抗癫痫活性。一旦建模后，接下来就通过腹腔和鼻腔途径评估Z-酸和其类似物对活体动物大脑中癫痫样活动的脑电特征。同时，Z-酸的毒性概况通过腹腔和鼻腔途径进行为期3个月的研究。

实验细节

在小鼠急性PTZ诱导癫痫发作模型中测试Z-酸和其各种类似物。为了证实再现性，在急性试验中评估每批次新鲜合成的Z-酸类似物的抗惊厥活性。

在Balb/c小鼠中的体内皮下PTZ诱导的癫痫发作测试

所有实验程序均依照针对实验室动物护理和使用的NIH指南(NIH出版物编号85-23Rev.1985)进行操作，并且进一步获得了卡拉奇大学(University of Karachi)国际化学和生物科学中心(ICCBS)动物标准咨询委员会(Advisory Committee on AnimalStandards of International Center for Chemical and Biological Sciences)的批准(协议编号2019-013)。重19-25g的雄性NMRI或Balb/c白化病小鼠被饲养在21±1℃下、12:12小时的照明-黑暗循环的环境受控房间中，并且自由地摄入食物和水。

使用皮下PTZ诱导的癫痫发作试验(皮下PTZ)评估待测化合物的抗惊厥作用。在盐水中制备PTZ，而将Z-酸溶解于0.1N NaOH中。Z-酸和其类似物的腹腔注射至少在皮下注射PTZ的惊厥剂量(110mg/kg)之前30分钟。在施用PTZ后，至少观察动物1小时，确认其是否存在不同类型的癫痫发作模式，即，身体抽搐发作、临界癫痫发作、伴有翻正反射丧失的全身性癫痫发作、强直性前肢癫痫发作导致的翻正反射丧失、强直性前肢和后肢癫痫发作导致的翻正反射丧失。还计算了PTZ诱导的临界癫痫发作的潜伏期。临界癫痫发作的潜伏期的定义是指PTZ注入时间与临界癫痫首发发生之间的时间间隔。还评估了测试材料在24小时内对PTZ诱导的死亡率的保护作用。在所有实验中，安定(7.5mg/kg腹膜内)和丙戊酸(100mg/kg)用作标准药物对照。

NMRI小鼠PTZ诱导的点燃(抗致癫痫活性)：

根据De Sarro的改良方法，即通过在隔日用亚惊厥剂量的戊四唑(皮下，50mg/kg)反复处理小鼠，来诱导化学点燃。每天(腹腔)施用四剂Z-酸(150mg/kg/天、200mg/kg/天、250mg/kg/天和300mg/kg/天)。但是，在施用PTZ的当天，在施用PTZ之前30分钟用Z-酸处理动物。在注射PTZ后，将每只动物分别放置在透明有机玻璃笼中，来进行1小时的近距离观察。药物对照组每天服用丙戊酸。癫痫发作模式的Racine评分分类用于监测动物(表1)。评分为4-5的动物被认为是完全点燃的。然后计算累积点燃评分分数。一旦动物被完全点燃就终止实验。实施方案如表2所示。在每个实验结束时，将动物人道处死。

表1：PTZ诱导的癫痫发生的行为评定量表(Racine，1972)

表2：scPTZ诱导的化学点燃癫痫模型的治疗组

急性神经毒性

通过急性神经毒性翻笼试验检测Z-酸的神经毒性特征。在研究中采用了矩形金属屏的平台，并将所述平台进行180°的翻转。实验前一天在设备上对小鼠进行预测试，并且未通过任务的小鼠不用于后续的药物测试。分别在腹腔给药Z-酸后5分钟、30分钟、60分钟和120分钟进行测试。在1分钟时长内不能爬到直立姿势的小鼠被评定为失败。

急性行为评估

在实验的前一天将动物转移到单独的笼中，以适应新的环境。如通过Turner,1972所述，通过略微修改Irwin的程序来建立毒性概况。在动物被注射媒剂、标准药物和测试样品后1-2小时，观察动物的行为(运动、头部移动、咬合、舔或装束、过度兴奋、共济失调和镇静、扭动身体、跳跃等)。使用评分系统记录对行为的这些影响(评分根据症状的强度从0-4进行分配)。

肌肉松弛剂活性

这通过牵引试验进行检测。将小鼠的前掌放置在工作台顶部上方的被刚性支撑的小的双绞线上。正常小鼠用可以前掌抓握金属丝，并且使之自由悬挂时，在5秒内至少一只后脚会放置在金属丝上。无法举起至少一只后脚说明牵引失败。在注射盐水、安定、丙戊酸或Z-酸后30分钟和1小时进行测试。

大体解剖

一旦针对行为分析观察动物后，就将其麻醉、解剖，以及内部器官如肾脏、肝脏、脾脏、胰腺和心脏的大体解剖，并密切观察以便查看这些器官的大体外观是否有任何可能的变化。

亚慢性毒性概况：

为了评估Z-酸的亚慢性毒性概况，每天以300mg/kg(腹腔)的剂量向小鼠施用所述化合物，为期3个月。将动物分为如下所示的5个组(每组8个)：

组I正常对照；

组II每天处理，持续1周；

组III每天处理，持续2周；

组IV每天处理，持续1个月；

组V每天处理，持续2个月；

组VI每天处理，持续3个月

在研究结束时，对动物进行麻醉、解剖，并对重要器官进行肉眼检查，并收集血清和全脑样品。将血清和脑样品储存在-20℃下以便后续检测。

药代动力学概况

在小鼠腹腔注射单次剂量(300mg/kg)的Z-酸之后对血浆和脑Z-酸制剂的药代动力学进行研究。在单剂给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟和240分钟处死动物(每个时间点n＝4)。在含有肝素的真空采血管中制得血液样品。对照组由未接受其它处理剂的动物组成，并且其用作空白血浆并有助于优化和验证GC/MS方法。稍后将血液样品离心获得血浆，所述血浆储存在-20℃下用于后续处理。同样，还从被处死的动物收集了脑样品，并将其储存在-20℃下用于GC-MS的后续处理。

还研究了小鼠腹腔注射单次剂量(50mg/kg)Z-酸之后的血浆和脑Z-酸制剂的药代动力学。在单剂给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、75分钟、90分钟、120分钟和180分钟处死动物(每个时间点n＝4)。在含有肝素的真空采血管中制得血液样品。对照组由未接受其它处理剂的动物组成，并且其用作空白血浆。稍后将血液样品离心获得血浆，所述血浆储存在-20℃下用于后续处理。同样，还从被处死的动物收集了脑样品，并将其储存在-20℃下用于在UPLC中的后续处理。

还研究了在兔子鼻腔给药单次剂量(50mg/kg)Z-酸之后的血浆中Z-酸制剂的药代动力学。在单剂给药后15分钟、30分钟、60分钟、120分钟和180分钟后收集血液样品(n＝4)。在含有肝素的真空采血管中制得血液样品。对照组由未接受其它处理剂的动物组成，并且其用作空白血浆。稍后将血液样品离心获得血浆，所述血浆储存在-20℃下用于UPLC中后续处理。

大鼠中PTZ诱导的癫痫样活动，随后腹腔给药Z-酸(EEG方案)

在这组实验中，研究了Z-酸对PTZ诱导的癫痫样活动的影响。将大鼠(210±10g)分为六个组，包括对照组、安定组、Z-酸组、PTZ组、PTZ+安定组、PTZ+Z-酸组，其中每组6个样本。PTZ的注射剂量为100mg/kg。将Z-酸以150mg/kg的剂量腹腔注射至麻醉的大鼠中，而药物对照组用5mg/kg剂量的安定进行处理。盐水用作安慰剂。在盐水中制备PTZ，而将Z-酸溶解于0.1N NaOH中。从大鼠大脑的皮质区域记录EEG。

所述方案开始于麻醉大鼠，然后将动物固定在用于手术的立体定位器中。去除皮肤以暴露头骨的前囟和λ区域。借助手动钻机钻出三个直径为0.6mm的孔。在顶叶上开一个孔，以用于放置有源电极，而在枕叶上开两个孔，用于参考电极和接地电极。将长度为5mm且直径为0.5mm的螺钉插入每个孔中，并且然后将电极与EEG记录系统连接。通过监测基线EEG记录5分钟来开始记录。无噪音录制5分钟后，注射PTZ来诱导急性癫痫发作。在注射PTZ后，EEG记录持续10分钟，以观察癫痫样活动的诱导。在此持续时间内，认为是癫痫样的峰值被观察到是与大鼠癫痫性发作表型同步的高幅度。在记录10分钟后，腹腔注射Z-酸以观察其对PTZ诱导的癫痫样活动的影响。

大鼠中PTZ诱导的癫痫样活动，随后鼻腔给药Z-酸制剂(EEG方案)

在这组实验中，研究了Z-酸制剂鼻腔给药途径对PTZ诱导的癫痫样活动的影响。将大鼠(210±10g)分为三个组，包括对照组、PTZ组和PTZ+Z-酸组，其中每组6个样本。PTZ的注射剂量为100mg/kg。Z-酸制剂经鼻给药，剂量为50mg/kg。最初对药物制剂(1-4)进行测试，并且对所有制剂均观察到了相同的结果。最后使用制剂1来获取数据。通过经鼻途径测试溶解在水中的Z-酸-Lys-Lys-OH。从大鼠大脑的皮质区域记录EEG。

对动物的处理与上述相同。Z-酸制剂的经鼻给药是在PTZ注射前30分钟完成的。通过监测基线EEG记录5分钟来开始记录。无噪音录制5分钟后，注射PTZ来诱导急性癫痫发作。在注射PTZ后，EEG记录持续10分钟，以观察癫痫样活动的诱导。在此持续时间内，认为是癫痫样的峰值被观察到是与大鼠癫痫性发作表型同步的高幅度。通过单向方差分析，然后通过Tukey’s事后检验分析来分析数据。p值小于0.05具有显著性差异。

Z-酸制剂I对大鼠中PTZ诱导的急性癫痫发作中BDNF和cfos基因表达的影响

记录EEG来收集大脑样品后，将大鼠断头处死。将大脑的皮质和海马区域切除，利用qRT-PCR进行基因表达分析。处理组织样品以进行RNA分离，然后使用Revert Aid第一链cDNA合成试剂盒(赛默科技(Thermo Scientific))合成cDNA。接着使用SYBER green qPCRMaster混合物(赛默科技)将模板cDNA用于BDNF和Cfos的扩增。通过对照β-肌动蛋白标准化的2-ΔΔCt值来确定相对基因表达。

Z-酸试剂I对大鼠PTZ诱导的急性癫痫发作中谷氨酸盐水平的影响

在施用Z-酸试剂I之后，本发明还评估了皮质和海马中的谷氨酸盐水平。通过ELISA试剂盒(生物测定技术实验室(Bioassay Technology Laboratory)，E1474Ra)测定谷氨酸盐水平。

Z-酸试剂I在大鼠亚慢性毒性中的研究

在大鼠中，通过鼻内给药途径对亚慢性毒性进行研究。将大鼠分成两组(每组n＝4)。对待测组大鼠通过经鼻给药途径进行Z-酸试剂I(50mg/kg)处理。在实验结束时，处死大鼠收集血液样品，然后并从所述血液样品中收集血清。血清样品用于获取LFT概况、肾脏概况、蛋白质、胆红素和甘油三酸酯。

实验结果

急性PTZ诱导的癫痫发作模型的结果

选择重量在18-22g之间的NMRI雄性小鼠进行研究。将剂量110mg/Kg的PTZ施用于PTZ组，并观察首次肌阵挛性抽搐和HLTE。将剂量为300mg/Kg、400mg/Kg和500mg/Kg的Z-酸通过腹腔给药处理3个不同组的小鼠(n＝6)，并在30分钟后向这些动物施用110mg/Kg的PTZ，以评估在上述剂量下测试化合物的抗癫痫发作潜力。应注意的是，与PTZ组相比，所有三种剂量的Z-酸均明显延迟了肌阵挛性癫痫发作的发生，并预防了所有动物中的HLTE，因而预防了PTZ诱导的癫痫动物模型中的癫痫发作(图1)。如图1所示，与PTZ组相比，剂量为300mg/Kg、400mg/Kg和500mg/Kg的Z-酸衍生物显著降低了癫痫发作评分分值，并具有剂量依赖性(n＝5)。

scPTZ诱导的化学点燃癫痫模型

在未经处理的scPTZ对照组动物进行18次处理后，癫痫发作评分逐渐升高，达到5分，其中平均癫痫发作评分为4.9。与PTZ点燃的对照组相比，丙戊酸处理组在点燃方案结束之前没有表现出任何癫痫发作的情形。本发明发现能够抑制癫痫发生过程的有效剂量为300mg/kg体重。在此测试剂量下，Z-酸在scPTZ诱导的点燃癫痫进程中显示出完全的抑制作用。

毒性概况

本发明针对亚慢性毒性进行为期3个月的研究，每日剂量为300mg/kg。所有重要器官均完好无损，并且肉眼检查未观察到异常痕迹和斑点。所有动物直至实验结束均存活，大体解剖处理后的器官，未显示毒性症状。处理血液样品用于获得LFT概况、CBC和LDH、肌酸酐和脲水平，在每日以300mg/kg的剂量给药情况下，所述LFT概况、CBC和LDH、肌酸酐和脲水平在3个月后仍处于正常范围内。

药代动力学

在Z-酸腹腔给药后，通过气质联用获得Z-酸的峰面积来测定血浆药物浓度。本发明绘制了血浆浓度与时间之间的关系图。类似地，通过分析脑样品来检测脑Z-酸浓度。腹腔注射后观察到Z-酸在血浆和脑中迅速出现，并且血浆和脑中Z-酸均在5分钟和15分钟内达到峰值浓度。此后，其分别在2-2.5小时和1小时内同步地从血浆(图2)和脑(图3)中迅速消失。在血浆中的表观分布容积为10L。本发明发现血浆中的半衰期为60分钟。此后，Z-酸同样从两个隔室中被同步排出。没有证据表明Z-酸在脑中持续存留或汇集。

在Z-酸鼻内给药后，通过UPLC获得Z-酸的峰面积来测定血浆药物浓度。本发明绘制了血浆浓度与时间之间的关系图(图4)。类似地，通过分析脑样品来测量脑Z-酸浓度(图5)。观察到Z-酸迅速出现在脑中，并且在药物施用5分钟内达到峰值浓度，而在血浆中，在药物施用45分钟后获得最大浓度。120分钟后药物从脑中被排出，然而经鼻给药180分钟后，血浆中仍发现了存有药量(图4)。经鼻给药途径中，血浆中的半衰期为63分钟。

对兔进行Z-酸鼻腔给药后，通过UPLC获得Z-酸的峰面积来测定血浆药物浓度。本发明绘制了血浆浓度与时间之间的关系图(图6)。Z-酸迅速出现在血浆中，并且在药物施用15分钟内达到峰值浓度。经鼻给药途径中，血浆中的半衰期为110分钟。

Z-酸对大鼠中PTZ诱导的癫痫样活动并随后腹腔给药Z-酸(EEG方案)的影响

在PTZ诱导的癫痫动物模型中，Z-酸腹腔给药的作用进行研究。在包含基线、PTZ注射后和药物注射后的三个EEG记录时段期间，以尖峰放电/分钟的形式监测癫痫发作。在PTZ注射10分钟后给药，观察到由PTZ诱导的峰值在施用Z-酸(腹腔给药)5分钟后明显减小，随后在Z-酸处理7-10分钟后完全消失。从起点开始连续记录55分钟。在实验结束时，借助于伊朗科学光束研究所(Sciencebeam Institute,Iran)制造的电子探针软件，从示波器对峰值的数量进行计数。数据是从实验的三个时间点收集的，包含基线、PTZ注射和化合物注射(图7)。统计分析表明，与对照组动物相比，PTZ组动物的尖峰放电显著增加(P<0.01)。然而，与注射PTZ组动物相比，在PTZ+安定、PTZ+Z-酸组中由于分别施用了安定和Z-酸而使尖峰放电显著降低(P<0.01)(图8)。

在图8中，数据值用平均值±SEM(n＝6)表示。运用邦弗朗尼检验观察统计显著性，对于相应时段，与基线读数相比，*P<0.01；与PTZ注射后的记录相比，+P<0.01；与PTZ组相比，#P<0.01。

大鼠中PTZ诱导的癫痫样活动，随后鼻内给药Z-酸试剂(EEG方案)

在PTZ诱导的癫痫动物模型中，研究了Z-酸调试剂鼻内给药的作用。以尖峰放电/分钟的形式监测癫痫发作。在PTZ注射30分钟之前施用药物。记录从实验开始持续55分钟(图9)。在实验结束时，借助于伊朗科学光束研究所制造的电子探针软件从示波器中对尖峰的数量进行计数。统计分析表明，与对照组动物相比，PTZ组动物的尖峰放电显著增加(P<0.01)。然而，相比于注射PTZ的动物，在Z-酸+PTZ组中，Z-酸鼻内给药显著降低了尖峰放电(P<0.01)。图10总结了上述结果。

在图10中，数据值用平均值±SEM(n＝6)表示。运用Tukey检验观察统计显著性，与对照动物相比，*p<0.01；与PTZ组相比，+p<0.01。Z-酸试剂I对大鼠PTZ诱导的急性癫痫发作中BDNF和cfos基因表达的影响

腹膜内实验

双因素方差分析显示，在皮质和海马区域两者中，相比于对照组动物，在PTZ处理大鼠中BNDF(图11a和11b)和c-fos(图12和12b)的表达显著增加(p<0.01)。相比单独注射PTZ的大鼠，在Z-酸(p<0.01)和安定(p<0.01)处理(腹腔注射)后，BDNF和Cfos水平的增加明显降低，并且与对照组动物的水平相当。

鼻内实验

通过单因素方差分析的统计分析显示，在两个研究的脑区域中，施用PTZ均显著增加(p<0.01)BNDF(图13a和13b)和cfos(图14a和14b)的基因表达量。而与PTZ处理的动物相比，在用Z-酸鼻内预处理的大鼠中，BNDF和Cfos的基因表达显著降低(p<0.01)。

Z-酸试剂I对大鼠中PTZ诱导的急性癫痫发作中谷氨酸盐水平的影响腹膜内实验

双因素方差分析显示，在皮质和海马区域两者中，相比与于对照动物，PTZ处理大鼠中的谷氨酸盐水平显著增加(p<0.01)(图15a和图15b)。相比于单独注射PTZ的大鼠，经过Z-酸(p<0.01)和安定(p<0.01)处理后，大鼠的谷氨酸盐水平的增加明显降低，并且变得与对照动物相当。

鼻内实验

通过单因素方差分析的统计分析表明，在两个研究的脑区域中，施用PTZ显著增加(p<0.01)谷氨酸盐水平(图16a和16b)。而相比于PTZ处理的动物，在用Z-酸预处理的大鼠中谷氨酸盐水平显著降低(p<0.01)。

Z-酸试剂I在大鼠亚慢性毒性中的研究

在实施了鼻内给药的大鼠中进行亚慢性毒性研究。将大鼠分成两组(每组n＝4)。血清样品用于获取LFT概况、肾脏概况、蛋白质、胆红素和甘油三酸酯。每日鼻内给药(50mg/kg)3个月后，发现上述生化参数处于正常范围内(图17-19)。