一种类似胞外陷阱的微网结构及其体外制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种类似胞外陷阱的微网结构及其体外制备方法和应用，其中，体外制备方法包括以下步骤：获取菲律宾蛤仔血细胞、提取菲律宾蛤仔血细胞DNA、在树脂上固相合成菲律宾蛤仔防御素多肽、菲律宾蛤仔血细胞DNA与固相防御素以等质量百分比混合并超声15s。本发明的有益之处在于：本发明提供的制备方法能够有效形成类似胞外陷阱的微网结构，形成的类似胞外陷阱的微网结构具有抑制细菌生长的功能。

说明书

技术领域

本发明涉及一种类似胞外陷阱的微网结构及其体外制备方法和应用，属于细胞生物学技术领域。

背景技术

胞外陷阱（extracellular traps，ETs）是以细胞内核酸为骨架，负载抗菌蛋白和水解酶所组成的纤维网状结构，能够包裹并杀伤外来入侵的病原微生物，是一种不同于凋亡和坏死的新型细胞死亡方式，其所包含的抗菌蛋白包括组蛋白、髓过氧化物酶、钙蛋白、防御素及其他抗菌肽等。自2004年Brinkmann等在嗜中性粒细胞中发现了胞外陷阱现象以来，已在多种生物的不同类型细胞中发现了胞外陷阱的存在。胞外陷阱可阻止病原微生物由入侵位置向周边组织扩散，集中多种抗菌肽而使局部抗菌肽浓度升高，加大对病原微生物的杀灭作用，亦可形成不依赖于杀伤作用的防御系统，捕获入侵微生物并阻止其迁移。然而，胞外陷阱复杂的形成过程使其研究变得困难。因此，利用简单且明确的类似胞外陷阱的生物材料来进行胞外陷阱相关的研究是非常有必要的。

免疫组织或细胞能够释放抗菌蛋白以抵御外来病原菌的侵袭，而胞外陷阱能够负载抗菌蛋白并浓缩抗菌蛋白的浓度，达到更好的杀菌效果。已有研究成功将人中性粒细胞胞外陷阱结构分离出来，且分离的胞外陷阱结构可成功用于各种实验或功能分析。这使得在没有细胞自身潜在混杂效应的情况下，能够对胞外陷阱的生物学特性进行评估。然而，从细胞中分离出胞外陷阱结构需要重复离心和洗涤，这通常会导致蛋白质的部分损失。因此，体外合成微网结构及微网结构的功能值得进一步的研究。

已有研究通过将λ噬菌体DNA和组蛋白在HBSS溶液中进行声化学络合，合成具有确定组成成分的胞外陷阱样材料，其在尺寸和结构上与胞外陷阱具有相似性。在组蛋白存在下，λ噬菌体DNA可以自发聚合成网络，这有助于形成网状结构，它以类似于胞外陷阱的方式捕获致病性大肠杆菌。防御素是近年来被广泛关注的抗菌肽，在脊椎动物和无脊椎动物中都被发现。防御素是富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽家族成员，它们可以与带负电荷的细菌或真菌膜发生静电相互作用，随后导致膜破裂或改变代谢过程，最终导致细胞死亡。并且菲律宾蛤仔血细胞胞外陷阱的形成伴随着大量防御素的产生，带负电荷的DNA可以与带正电荷的防御素通过静电作用结合。

海洋无脊椎动物通常生活在富含微生物的水环境中，经常面临着多种病原微生物的侵袭。作为无脊椎动物群体，海洋贝类缺乏适应性免疫，因此它们进化出复杂的固有免疫策略来抵御病原体。胞外陷阱是固有免疫细胞特有的一种新型免疫方式，在抵御病原微生物入侵方面发挥着重要作用。因此，本发明利用菲律宾蛤仔血细胞DNA和抗菌肽制剂在体外模拟胞外陷阱结构，并确定模拟胞外陷阱结构的抑菌功能，进一步为了解菲律宾蛤仔胞外陷阱结构及新型抗菌制剂的普及提供新思路。

发明内容

本发明的目的在于：利用菲律宾蛤仔血细胞DNA和抗菌肽制剂（菲律宾蛤仔防御素多肽），提供一种类似胞外陷阱的微网结构，以及该微网结构的体外制备方法和应用。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种类似胞外陷阱的微网结构的体外制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：获取菲律宾蛤仔血细胞；

步骤2：提取菲律宾蛤仔血细胞DNA；

步骤3：在树脂上固相合成菲律宾蛤仔防御素多肽，得到固相防御素；

步骤4：将步骤2提取的菲律宾蛤仔血细胞DNA和步骤3得到的固相防御素以等质量百分比溶于PBS中，用超声波破碎仪超声15s，获得含有菲律宾蛤仔血细胞DNA和固相防御素的微网结构。

优选的，在步骤1中，获取菲律宾蛤仔血细胞的方法具体如下：对菲律宾蛤仔进行开壳处理，取血窦处的血细胞，然后将血细胞用4°C预冷的离心机400g离心5min，收集血细胞，再使用PBS清洗血细胞两次。

优选的，在步骤2中，提取菲律宾蛤仔血细胞DNA的方法具体如下：向新鲜的血细胞中加入20μL蛋白激酶K并混匀，然后加入200μL缓冲液GB颠倒混匀，70°C反应10min，之后加入200μL无水乙醇振荡混匀15s，接着将混合液加入吸附柱中，13400g离心30s，弃掉废液，向吸附柱中依次加入500μL缓冲液GD、600μL漂洗液进行洗涤，最后用50μL洗脱液洗脱得到菲律宾蛤仔血细胞DNA。

优选的，在步骤3中，所述树脂选用的是N，N-二甲基甲酰胺，在N，N-二甲基甲酰胺上固相合成菲律宾蛤仔防御素多肽的方法具体如下：将Fmoc保护氨基酸衍生物、N，N′-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑置于N，N-二甲基甲酰胺中进行偶联，得到带有Fmoc保护的二肽中间体，该二肽中间体再与待缩合的氨基酸衍生物置于N，N-二甲基甲酰胺中进行偶联，重复上述过程，依次缩合氨基酸，直到得到全保护多肽，然后在室温下加入由三氟乙酸、三异丙基硅烷、乙二硫醇和水按照体积比94.0:1.0:2.5:2.5混合而成的混合液进行180min的切割和最终脱保护，肽产物先用二异丙醚沉淀，再用水萃取并冷冻干燥，最后使用C18色谱柱通过HPLC纯化多肽，用含有0.1% 三氟乙酸的乙腈线性梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长220nm。

本发明的有益之处在于：本发明提供的制备方法能够有效形成类似胞外陷阱的微网结构，形成的类似胞外陷阱的微网结构具有抑制细菌（鳗弧菌和大肠杆菌）生长的功能。

附图说明

图1是步骤3得到的产物报告图，其中（A）是产物HPLC图，（B）是产物质谱图；

图2是本发明制备得到的微网结构的扫描电镜图；

图3是固相防御素的质量分数与微网结构的Zeta电位值的关系图；

图4是本发明制备得到的微网结构对细菌的抑菌作用图，其中（A）是鳗弧菌抑菌作用图，（B）是大肠杆菌抑菌作用图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、类似胞外陷阱的微网结构的体外制备方法

步骤1、获取菲律宾蛤仔血细胞

对菲律宾蛤仔进行开壳处理，取血窦处的血细胞，然后将血细胞用4°C预冷的离心机400g离心5min，收集血细胞，再使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗血细胞两次。

步骤2、提取菲律宾蛤仔血细胞DNA

向新鲜的血细胞中加入20μL蛋白激酶K并混匀，然后加入200μL缓冲液GB颠倒混匀，70°C反应10min，之后加入200μL无水乙醇振荡混匀15s，接着将混合液加入吸附柱CB3中，13400g离心30s，弃掉废液，向吸附柱中依次加入500μL缓冲液GD、600μL漂洗液PW进行洗涤，最后用50μL洗脱液TE洗脱得到菲律宾蛤仔血细胞DNA，使用Nanodrop2000检测DNA浓度。

步骤3、合成菲律宾蛤仔防御素多肽

采用Fmoc方法在Rink酰胺树脂上固相合成菲律宾蛤仔防御素（NCBI基因编号：KT182084）多肽，具体的：

将5g Fmoc保护氨基酸衍生物、2g N，N′-二异丙基碳二亚胺和1.5g 1-羟基苯并三唑置于8mL N，N-二甲基甲酰胺中进行偶联，得到带有Fmoc保护的二肽中间体，该二肽中间体再与待缩合的氨基酸衍生物置于75mL N，N-二甲基甲酰胺中进行偶联，重复上述过程，依次缩合氨基酸，直到得到全保护多肽，然后在室温下加入由三氟乙酸、三异丙基硅烷、乙二硫醇和水按照体积比94.0:1.0:2.5:2.5混合而成的混合液进行180min的切割和最终脱保护，肽产物先用二异丙醚沉淀，得到的沉淀再用水萃取并冷冻干燥，最后使用C18色谱柱通过HPLC纯化多肽，用含有0.1% 三氟乙酸的乙腈线性梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长220nm。

产物的HPLC图见图1中的（A），质谱图见图1中的（B）。

由图1可以确定：步骤3成功的在Rink酰胺树脂上固相合成了菲律宾蛤仔防御素多肽，即得到了固相防御素。

步骤4、合成微网结构

将步骤2提取的菲律宾蛤仔血细胞DNA和步骤3得到的固相防御素以不同质量百分比溶于PBS中，使用超声波破碎仪将以上混合液分别超声15s，获得含有菲律宾蛤仔血细胞DNA和固相防御素的微网结构。

将含有微网结构的溶液滴加到硅片上，用体积浓度为2.5%的戊二醛溶液进行固定，然后采用逐级提高乙醇浓度的方式进行梯度脱水，之后再进行金属镀膜，最后用扫描电镜观察所得的微网结构，观察结果显示：步骤4成功的合成了与菲律宾蛤仔胞外陷阱类似的微网结构，并且当菲律宾蛤仔血细胞DNA与固相防御素等质量分数混合时，在制备得到的微网结构中未见游离的DNA和防御素多肽，如图2所示。

再次确定菲律宾蛤仔血细胞DNA与固相防御素的浓度配比：使用超声波破碎仪打散前面获得的微网结构，然后利用激光粒度仪扫描检测Zeta电位值，以所测Zeta电位值为纵坐标、以固相防御素的质量分数为横坐标作图，实验结果见图3。

由图3可知：当微网结构中固相防御素的质量分数从16%增加到50%时，DNA纤维逐渐被一层防御素蛋白颗粒覆盖，导致Zeta电位升高；当固相防御素的质量分数超过50%时，绝大多数DNA纤维被防御素蛋白占据，因静电斥力抑制了固相防御素与DNA的进一步结合，Zeta电位增长缓慢。

所以，菲律宾蛤仔血细胞DNA和固相防御素以等质量分数混合是制备微网结构最适的配比。

二、上述类似胞外陷阱的微网结构的抑菌作用

1、制备细菌悬液

分别在2216E和LB培养基中培养鳗弧菌和大肠杆菌，然后4°C预冷的离心机5000g离心10min收集细菌，之后使用PBS清洗细菌两次，最后将细菌浓度稀释至OD

2、检测抑菌作用

取5µL上述鳗弧菌悬液和5µL上述大肠杆菌悬液，分别加入100µL液体培养基中并添加至透明的96孔板中，然后加入100µL前面制备得到的微网结构（菲律宾蛤仔血细胞DNA和固相防御素等质量分数混合），另设只含有相同浓度的菲律宾蛤仔血细胞DNA和只含有相同浓度的固相防御素两个组别，以只含细菌悬液为对照。将大肠杆菌置于37°C培养，将鳗弧菌置于28°C培养，每隔1 h分别检测记录OD

由图4可知：

（1）菲律宾蛤仔血细胞DNA对鳗弧菌和大肠杆菌均没有抑制作用；

（2）固相防御素可以显著抑制鳗弧菌和大肠杆菌的生长；

（3）重要的是，与固相防御素相比，由菲律宾蛤仔血细胞DNA和固相防御素组成的微网结构具有更强的杀菌作用。

综上，本发明获得的微网结构（菲律宾蛤仔血细胞DNA和固相防御素等质量分数混合）可用于制备抑制鳗弧菌和大肠杆菌的制剂。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。