一种沼泽红假单胞菌及其制备5-ALA的用途和方法

摘要

本发明涉及生物发酵领域，特别是涉及一种沼泽红假单胞菌及其制备5‑ALA的用途和方法，所述沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris的保藏编号为CGMCC NO.22151，所述沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris能用于制备5‑氨基乙酰丙酸，制备方法包括以下步骤：1)将所述沼泽红假单胞菌nlsy015接种至发酵培养基中培养，得到发酵液；2)从发酵液中分离提取得到5‑氨基乙酰丙酸。本发明采用有氧避光深层发酵培养特有的沼泽红假单胞菌，操作简单、培养时间短、菌体浓度高。而且采用非化学溶剂提取5‑ALA，有效提取5‑ALA且原药中无溶剂残留。

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，特别是涉及一种沼泽红假单胞菌及其制备5-ALA的用途和方法。

背景技术

光合细菌是自然界最广泛存在的比较古老的、能进行光合作用而不产氧的特殊生理类群的原核微生物的总称，具有原始光能合成体系，能在厌氧条件下进行不放氧的光合作用，是水体兼性厌氧层中主要的初级生产者，并在自然界的碳素、氮素、硫素转化循环中起重要作用。光合细菌中含有多种丰富的营养物质，其中以辅酶Q10、类胡萝卜素、菌绿素、5ALA、单细胞蛋白最为突出和典型，被称为高价值物质。

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，简称5-ALA)，分子式C

培养光合细菌的方法多采用塑料桶、槽式装置半开放式或开放式光照厌氧培养，操作简单但易污染且菌体浓度低。采用玻璃生物反应器培养光合细菌，发酵时间长(7-14d)、菌体浓度低。国内外主要是采用化学方法以及微生物发酵法合成5-ALA，有少量研究表明可以从光合细菌中提取5-ALA，但量比较低。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种沼泽红假单胞菌及其制备5-ALA的用途和方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris，保藏编号为CGMCC NO.22151。

本发明还提供所述沼泽红假单胞菌nlsy015在制备5-氨基乙酰丙酸中的用途，所述沼泽红假单胞菌nlsy015的保藏编号为CGMCC NO.22151。

本发明还提供一种5-氨基乙酰丙酸的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)将所述沼泽红假单胞菌nlsy015经活化、扩大培养制得沼泽红假单胞菌原液；

2)将步骤1)中制得的原液接种至发酵培养基中培养，得到发酵液；

3)从发酵液中分离提取得到5-氨基乙酰丙酸。

优选的，所述制备方法步骤2)发酵液中沼泽红假单胞菌nlsy015的数量为60×10

优选的，所述制备方法步骤2)中还包括以下条件中的一项或多项：

a)培养体系内的通气比为1:0.05～1:0.2；

b)使用发酵罐作为培养容器；

c)在避光条件下培养。

优选的，所述制备方法步骤3)中分离提取包括以下步骤：

1)向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，过滤后得到一次滤清液；

2)向一次滤清液中加入吸附剂，过滤后得到二次滤清液；

3)5-氨基乙酰丙酸从二次滤清液中晶体析出，将析出的晶体从二次滤清液中分离得到5-氨基乙酰丙酸。

如上所述，本发明的沼泽红假单胞菌及其制备5-ALA的用途和方法，具有以下有益效果：本发明采用有氧避光深层发酵培养特有的沼泽红假单胞菌，操作简单、培养时间短、菌体浓度高、5-ALA的产量高。

采用非化学溶剂提取5-ALA，既有效地提取发酵液中的5-ALA且原药中无溶剂残留，又能避免化学合成5-ALA带来的有机化学溶剂污染和潜在安全危险。

具体实施方式

本发明首先提供一种沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，菌种名称为沼泽红假单胞菌nlsy015，保藏日期为2021.04.09，保藏编号为CGMCC NO.22151，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述沼泽红假单胞菌nlsy015的16小时5-氨基乙酰丙酸产量为4800mg/L以上，且5-氨基乙酰丙酸的收率为85％以上。

所述16小时5-氨基乙酰丙酸产量的检测方法如下：

将活菌数为4×10

纯度＝样品峰面积*标准品浓度*标准品纯度/标准品峰面积*样品浓度*100％①

产量＝5-氨基乙酰丙酸成品重量*纯度②

所述沼泽红假单胞菌nlsy015，属于光合细菌分类中的红螺菌科、红假单胞菌属。细胞为杆状到卵形，0.6-2.5μm×0.6-5.0μm，通过极生鞭毛运动或不运动，生长有极性，以不对称出芽分裂的方式繁殖，革兰氏染色呈阴性。琼脂平板培养，沼泽红假单胞菌菌落呈红色圆盘状，表面光滑，少隆起，边缘整齐。在光照无氧和黑暗有氧条件下均能生长。其菌体营养丰富，蛋白质含量高达65％，其被广泛应用于农业、渔业、环保、医药等领域，可用于水质净化、污水处理、饲料级微生物添加剂等，农业部公布允许使用的12种饲料级微生物中，沼泽红假单胞菌就在其内。

本发明还提供所述沼泽红假单胞菌nlsy015在制备5-氨基乙酰丙酸中的用途，所述沼泽红假单胞菌nlsy015的保藏编号为CGMCC NO.22151。

本发明还提供一种5-氨基乙酰丙酸的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)将所述沼泽红假单胞菌nlsy015经活化、扩大培养制得沼泽红假单胞菌原液；

2)将步骤1)中制得的原液接种至发酵培养基中培养，得到发酵液；

3)从发酵液中分离提取得到5-氨基乙酰丙酸。

在一种实施方式中，所述制备方法步骤2)发酵液中沼泽红假单胞菌nlsy015的数量为60×10

在一种实施方式中，所述制备方法步骤2)还包括对发酵液进行镜检。镜检无杂菌即可。

在一种实施方式中，所述制备方法步骤1)中还包括以下条件中的一项或多项：

a)沼泽红假单胞菌nlsy015的培养温度为30-35℃；

b)沼泽红假单胞菌nlsy015的培养pH为7.0-7.5；

c)沼泽红假单胞菌nlsy015的培养光照强度为2500-3000Lx；

d)沼泽红假单胞菌nlsy015扩大培养的接种量为培养体积的10-20％；

e)沼泽红假单胞菌nlsy015扩大培养的培养时间为3-7天。

菌体活化、扩大培养培养基(固体与液体培养基)配方为硫酸铵0.1-0.2％(w/v),醋酸钠0.1-0.2％(w/v)，酵母抽提物0.15-0.30％(w/v)，磷酸氢二钾0.02-0.04％(w/v)，PH7.0-7.2，此为液体培养基，固体培养基添加1.3％(w/v)的琼脂粉。

在一种实施方式中，所述制备方法步骤2)中还包括以下条件中的一项或多项：

a)培养体系内的通气比为1:0.05～1:0.2；

b)使用发酵罐作为培养容器；

c)在避光条件下培养。

通气比是指单位发酵液中单位时间(通常为每分钟)内通入到发酵容器的气体体积。通气比＝发酵通气量(单位：立方米/分钟)：发酵液体积(单位：立方米)。

合适的通气比可以使沼泽红假单胞菌nlsy015在有氧条件下进行培养。

在一种实施方式中，发酵罐的高度或容积为50升。发酵罐液体深层微好氧培养沼泽红假单胞菌，菌体数量高，易培养，培养时间短，少污染。沼泽红假单胞菌在黑暗条件下，进行氧化磷酸化，其功能是进行电子传递、H传递及氧的利用。

在一种实施方式中，所述制备方法步骤2)中还包括以下条件中的一项或多项：

a)沼泽红假单胞菌nlsy015的培养温度为30-35℃；

b)沼泽红假单胞菌nlsy015的培养pH为7.0-7.5；

c)沼泽红假单胞菌nlsy015的接种时使用的是沼泽红假单胞菌nlsy015的原液，接种量为培养容器体积的20～40％；

d)沼泽红假单胞菌nlsy015的培养时间为16-24小时；

e)沼泽红假单胞菌nlsy015培养体系的压力为0.01～0.03MPa；

f)搅拌速度50～80rpm。

发酵培养基配方为醋酸钠0.10-0.30％(w/v)，磷酸氢二钾0.15-0.30％(w/v)，磷酸二氢钾0.05-0.10％(w/v)，硫酸镁0.01-0.05％(w/v)，氯化铵0.04-0.08％(w/v)，氯化钠0.50-1.00％(w/v)，酵母膏0.10-0.25％(w/v)，葡萄糖0.10-0.20％(w/v)，大米蛋白0.10-0.20％(w/v)，微量元素0.05-0.10％(w/v)。所述微量元素选自氯化铁、氯化锰、硫酸铜、硫酸锌、硝酸钴中的一种或多种。发酵培养基的初始pH为7.00-7.50。

在一种实施方式中，所述制备方法步骤3)中分离提取包括以下步骤：

1)向发酵液中加入絮凝剂进行絮凝，过滤后得到一次滤清液；

2)向一次滤清液中加入吸附剂，过滤后得到二次滤清液；

3)5-氨基乙酰丙酸从二次滤清液中晶体析出，将析出的晶体从二次滤清液中分离得到5-氨基乙酰丙酸。

在一种实施方式中，所述絮凝剂为复合生物絮凝剂。所述复合生物絮凝剂包括氯化钙和磷酸氢二钠。所述复合生物絮凝剂中氯化钙的浓度为0.5-1.0％(w/v)，磷酸氢二钠的浓度为0.5-1.0％(w/v)。

在一种实施方式中，所述絮凝剂的添加比例为发酵液体积的1.0-2.0％。

具体的，向发酵液中加入絮凝剂后，开启搅拌，发酵液中形成大量的絮状悬浮物。

在一种实施方式中，所述吸附剂为活性炭吸附剂。在一种实施方式中，所述活性炭吸附剂的比表面积为1374m

在一种实施方式中，所述吸附剂的添加比例为发酵液体积的0.1-0.2％。加入吸附剂后搅拌混匀，再静置2～4小时再进行过滤。

在一种实施方式中，步骤1)和步骤2)中所述的过滤为使用板框过滤。

在一种实施方式中，步骤3)中向二次滤清液中加入氢氧化钾使5-氨基乙酰丙酸从二次滤清液中结晶析出，将析出的晶体从二次滤清液中分离，此时得到的晶体可称为5-氨基乙酰丙酸的结晶湿体。

在一种实施方式中，氢氧化钾的浓度为20％-40％(v/v)。

在一种实施方式中，将析出的晶体从二次滤清液中分离的方法可选自离心分离。

在一种实施方式中，将5-氨基乙酰丙酸的结晶湿体真空干燥得到干燥的5-氨基乙酰丙酸。具体的，真空干燥的条件为：温度25-40℃，真空度-0.05～0.1MPa，时间为12-24小时，干燥至水分2.0％以下。

所述制备方法获得的5-氨基乙酰丙酸的产量为4200-6000mg/L，5-氨基乙酰丙酸的收率85％以上。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1

本发明中沼泽红假单胞菌nlsy015原液的制备包括以下步骤：

固体与液体培养基(活化与扩大培养培养基)：硫酸铵0.2％(w/v)，醋酸钠0.2％(w/v)，酵母抽提物0.20％(w/v)，磷酸氢二钾0.03％(w/v)，pH7.0，此为液体培养基，固体培养基添加1.3％(w/v)的琼脂粉。

菌种活化：将保藏的菌种接种至固体培养基中培养单菌落，后挑取单菌落接种至液体培养基中培养，温度30-35℃，光照强度2500-3000Lx。

扩大培养：将活化的菌种按10-20％的接种量转接至液体培养基中，温度30-35℃，光照强度2500-3000Lx，培养5天，直至培养物变成深红色，原液中的活菌数为4*10

实施例2

发酵液制备：按配方配制发酵培养基，121℃消毒、灭菌，降温至培养温度时，按发酵培养基体积的20％接种量将沼泽红假单胞原液接种至发酵罐中，pH7.00，控制温度30℃，罐压0.01MPa，搅拌50rpm，通气比1：0.05。培养16小时后，取样进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到60*10

发酵培养基配方为醋酸钠0.10％(w/v)、磷酸氢二钾0.15％(w/v)、磷酸二氢钾0.05％(w/v)、硫酸镁0.01％(w/v)、氯化铵0.04％(w/v)、氯化钠0.50％(w/v)、酵母膏0.10％(w/v)、葡萄糖0.10％(w/v)、大米蛋白0.10％(w/v)、微量元素0.05％(w/v)，微量元素为氯化铁与硫酸铜，pH7.00。

5-ALA提取：在上述发酵液中按发酵液体积添加复合生物絮凝剂(0.5％氯化钙和0.5％磷酸氢二钠)，边加边搅拌，待形成大量颗粒悬浮物时，过滤，收集滤液，即得一次滤清液。在二次滤清液中按滤液体积的0.1％添加活性炭吸附剂，搅拌，静置2小时，过滤，收集滤液，即得二次滤清液。向二次滤清液中缓慢滴加20％(v/v)的氢氧化钾水溶液，搅拌，待晶体析出后，晶体液离心分离，离心转速8000rpm,收集结晶湿体，置于真空干燥器中真空干燥，温度控制在30℃，真空度控制在-0.08MPa，干燥时间为16小时，得到的干晶体置于粉碎机中粉碎，过60目筛后得到5-ALA成品。提取过程中未采用有机溶剂，故成品经检测后未检测到有机溶剂残留。

1.按照下述方法检测5-ALA成品的产量：

检测条件：色谱柱：C18，250×4.6mm，检测波长：220nm，流速：1ml/min，进样量：10μl

溶液配制：

标准溶液：称取50mg标准品，置于100ml容量瓶中加入纯水超声3-5min溶解并稀释定容至100ml。

待测样品：取发酵液1ml，用纯水稀释100倍，过滤进样。

发酵液中5-ALA的产量(mg/l)＝样品峰面积×标准液浓度×稀释倍数/标准液峰面积

检测结果为：发酵液中5-ALA的产量为5627mg/L。

50升罐得到的5-ALA成品进行纯度折算后即为成品的实际产量，纯度按照下述公式计算：纯度＝样品峰面积*标准品浓度*标准品纯度/标准品峰面积*样品浓度*100％，提取得到的成品重量*成品纯度＝成品实际产量。

本实施例中，提取并烘干后得到的5-ALA成品的实际产量为4800mg/L。

将实际产量除以发酵液中的产量得到成品收率。

本实施例中即4800/5627*100％＝85.3％，即成品收率在85.3％。

2.取成品(干晶体)置于水分测定仪中采用标准法测定干晶体中的水分含量，结果显示成品水分含量0.72％。(标准法测定：根据检测标准称量成品置于水分测定仪中，采取烘干法，比较烘干前与烘干后成品的差值，差值占烘干前的比例即为水分含量)

实施例3

发酵液制备：按一定比例称取进罐发酵的各原料，121℃消毒、灭菌，降温至培养温度时，按40％接种量将沼泽红假单胞原液接种至发酵罐中，pH7.20，控制温度35℃，罐压0.01MPa，搅拌80rpm，通气比1：0.05。培养24小时后，取样进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到80*10

发酵培养基配方为醋酸钠0.30％(w/v)、磷酸氢二钾0.30％(w/v)、磷酸二氢钾0.10％(w/v)、硫酸镁0.05％(w/v)、氯化铵0.08％(w/v)、氯化钠0.50％(w/v)、酵母膏0.25％(w/v)、葡萄糖0.20％(w/v)、大米蛋白0.20％(w/v)、微量元素0.10％(w/v)，微量元素为氯化锰与硫酸锌，pH7.50。

5-ALA提取：在上述发酵液中按发酵液体积添加复合生物絮凝剂1.0％氯化钙和1.0％磷酸氢二钠，边加边搅拌，待形成大量颗粒悬浮物时，过滤，收集滤液，即得一次滤清液。在二次滤清液中按滤液体积的0.2％添加活性炭吸附剂，搅拌，静置2小时，过滤，收集滤液，即得二次滤清液。向二次滤清液中缓慢滴加40％(v/v)的氢氧化钾水溶液，搅拌，待晶体析出后，晶体液离心分离，离心转速8000rpm,收集结晶湿体，置于真空干燥器中真空干燥，温度控制在30℃，真空度控制在-0.08MPa，干燥时间为16小时，得到的干晶体置于粉碎机中粉碎，过60目筛得到成品。

检测方法同实施例2，检测结果为：发酵液中5ALA的产量为6936mg/L，提取烘干后5-ALA的产量为6000mg/L，成品水分0.80％，成品收率在86.5％，无有机溶剂残留。

实施例4

发酵液制备：按一定比例称取进罐发酵的各原料，121℃消毒、灭菌，降温至培养温度时，按30％接种量将沼泽红假单胞原液接种至发酵罐中，pH7.50，控制温度33℃，罐压0.01MPa，搅拌70rpm，通气比1：0.05。培养20小时后，取样进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到75*10

发酵培养基配方为醋酸钠0.1％(w/v)、磷酸氢二钾0.25％(w/v)、磷酸二氢钾0.08％(w/v)、硫酸镁0.01％(w/v)、氯化铵0.06％(w/v)、氯化钠0.50％(w/v)、酵母膏0.20％(w/v)、葡萄糖0.15％(w/v)、大米蛋白0.10％(w/v)、微量元素0.08％(w/v)，微量元素为氯化铁、硫酸锌与硝酸钴，PH7.50。

5-ALA提取：在上述发酵液中按发酵液体积添加复合生物絮凝剂0.5％氯化钙和0.5％磷酸氢二钠，边加边搅拌，待形成大量颗粒悬浮物时，过滤，收集滤液，即得一次滤清液。在二次滤清液中按滤液体积的0.15％添加活性炭吸附剂，搅拌，静置2小时，过滤，收集滤液，即得二次滤清液。向二次滤清液中缓慢滴加40％(v/v)的氢氧化钾水溶液，搅拌，待晶体析出后，晶体液离心分离，离心转速8000rpm,收集结晶湿体，置于真空干燥器中真空干燥，温度控制在30℃，真空度控制在-0.08MPa，干燥时间为16小时，得到的干晶体置于粉碎机中粉碎，过60目筛得到成品。

检测方法同实施例2，检测结果为：发酵液中5ALA的产量为6307mg/L，提取烘干后5-ALA的产量为5500mg/L，成品水分0.60％，成品收率在87.2％，无有机溶剂残留。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。