氧化石墨烯基核酸适配体传感器的构建及检测伏马菌素B1的方法和应用

摘要

本发明提供了一种氧化石墨烯基核酸适配体传感器的构建及检测伏马菌素B1的方法和应用，构建过程包括：设计与合成核酸适配体荧光探针；利用氧化石墨烯与核酸适配体共轭吸附作用进行荧光淬灭；靶标伏马菌素B1与核酸适配体结合，核酸适配体空间构象变化，荧光信号恢复；核酸内切酶DNase I酶切核酸适配体，释放靶标伏马菌素B1，稀释并配置标准溶液，测定荧光信号标准曲线；将实际待测样品经前处理，利用荧光适配体传感器检测平台，根据线性模型，测定伏马菌素B1含量；该检测方法具有高灵敏度和高特异性的优点，可以快速检测小麦粉中伏马菌素B1含量，与ELISA检测试剂盒有较高的符合度，在食品安全检测中具有重要的实际应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于伏马菌素B1的快速检测技术领域，具体涉及一种基于酶信号放大的氧化石墨烯基核酸适配体传感器的构建及检测伏马菌素B1(FB1)的方法和应用。

背景技术

伏马菌素是毒性最强的霉菌毒素之一，具有四种亚型(A、B、C和P)，其中FB1毒性最强，存在最普遍，约占70％。2002年，FB1被世界卫生组织国际癌症研究机构认定为2B级致癌物。美国食品药品管理局(FDA)限定了玉米产品中伏马菌素总量(FB1、FB2和FB3)不得超过2mg kg

传统的FB1检测技术主要基于仪器法的检测平台，包括高效液相色谱法、气相色谱-质谱串联法、高效液相色谱-质谱串联法等，然而该类方法检测步骤复杂，对于样品处理要求高，耗时长，且需要专业的仪器和操作人员。相比之下，免疫分析法具有快速、简单、方便等优点，包括酶联免疫法(ELISA)、免疫层析法和免疫传感器方法。但抗体的制备不易及抗体的稳定性难以保证等问题限制了该类方法的灵活运用。

核酸适配体，又被称为“化学抗体”，是由指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选获得的单链DNA或RNA寡核苷酸。相比抗体，核酸适配体具有可体外合成、低成本、易修饰、高稳定性和高特异性等优势。核酸适配体可作为靶标识别元素，已被用于开发适配体传感器，利用荧光、电化学、阵列技术检测FB1。然而这些方法通常需要适配体与探针的共聚反应，耗时的检测过程。氧化石墨烯(GO)是一种二维的纳米材料，由于其独特的光电特性，近年来广泛应用于传感平台的构建。GO可作为荧光淬灭剂，淬灭荧光标记的核酸适配体产生的荧光，同时可作为一种保护剂，保护核酸适配体不被核酸内切酶酶切消化。经调研，基于酶信号放大的GO基适配体传感器检测FB1的相关研究还未见报道。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供基于酶信号放大的GO基核酸适配体传感器的构建及检测FB1的方法和应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

作为第一方面，本发明提供了，一种GO基核酸适配体传感器的构建方法，其包括如下步骤：

(1)、在核酸适配体的5′端修饰羧基-X-罗丹明(ROX)荧光基团，得到荧光标记的核酸适配体；

(2)、GO与荧光标记的核酸适配体的π-π共轭吸附作用结合进行荧光淬灭，得到GO基核酸适配体传感器。

优选地，步骤(1)中，荧光标记的核酸适配体的激发波长为575-595nm，发射波长为595-615nm，发射光颜色为橙红色；核酸适配体序列如：5′-ROX-ATACCAGCTTATTCAATTAATCGCATTACCTTATACCAGCTTATTCAATTACGTCTGCACATACCAGCTTATTCAATTAGATAGTAAGTGCAATCT-3′(SEQ ID NO.1)。

优选地，步骤(2)中，荧光标记的核酸适配体的最高荧光强度为758.34-928.61，结合GO后，荧光发生淬灭，荧光强度为4.77-39.97。

作为第二方面，本发明提供了，一种GO基核酸适配体传感器，其由上述的构建方法得到。

作为第三方面，本发明提供了，一种验证上述的GO基核酸适配体传感器的方法，其包括如下步骤：

(1)、将GO基核酸适配体传感器(即核酸适配体/GO复合物)与靶标FB1进行反应；

(2)、核酸内切酶DNase I酶切核酸适配体，释放靶标FB1，实现靶标循环信号放大。

优选地，步骤(1)中，反应时间为5-15min；GO基核酸适配体传感器中核酸适配体与FB1结合，空间构象发生变化，核酸适配体与GO分离，荧光信号恢复，荧光强度为55.23-305.21。

优选地，步骤(2)中，反应的时间为25-35min；核酸适配体的荧光强度为136.83-756.12。

作为第四方面，本发明提供了，一种利用上述的GO基核酸适配体传感器检测FB1的方法，其包括如下步骤：

(1)、配置不同浓度梯度的FB1标准溶液，利用GO基核酸适配体传感器进行分析，检测荧光信号强度和光谱曲线，拟合标准曲线；

(2)、将实际待测样品经前处理，利用GO基核酸适配体传感器进行检测，根据标准曲线的线性模型，测定FB1的含量。

优选地，步骤(1)中，FB1标准溶液的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL。

优选地，步骤(2)中，前处理的过程为：在实际待测样品中加入FB1的加标量，之后进行靶标提取，过滤，并收集滤液；

优选地，FB1的加标量分别为0ng/mL、1.5ng/mL、8ng/mL、15ng/mL。

作为第五方面，本发明提供了，一种GO基核酸适配体传感器检测FB1的方法可以快速检测小麦粉样品中FB1含量，在食品安全检测中具有重要的实际应用价值。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

第一、本发明首次研究与应用酶信号放大的GO基核酸适配体传感器检测FB1，酶信号放大不需专业的仪器、操作简便、灵敏度高、与适配体传感器结合，可实现对FB1无需专业仪器辅助的高灵敏快速检测，检出限远低于国际限量。

第二、本发明的GO基核酸适配体传感器检测FB1，准确性高，与ELISA检测试剂盒有较高的符合度，表明该检测技术有较高的市场潜力。

第三、本发明为高灵敏度、高特异性、核酸适配体传感器的构建提供了新思路，且制备方法新颖，制备过程简单，可应用于食品检测行业。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的GO基核酸适配体传感器的原理图(Graphene oxide为氧化石墨烯，Aptamer为核酸适配体)。

图2为本发明的实施例2中对比FB1存在时和DNase I存在时的荧光发射光谱图(横坐标Wavelength为波长，纵坐标Fluorescence Intensity为荧光强度)。

图3为本发明的实施例2中GO基核酸适配体传感器检测FB1的荧光光谱图。

图4为本发明的实施例2中GO基核酸适配体传感器检测FB1的荧光标曲图。

图5本发明的实施例3中GO基核酸适配体传感器检测方法特异性分析示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种GO基核酸适配体传感器的构建及检测FB1的方法和应用。具体地，本发明使用核酸适配体作为分子识别元件，GO作为荧光淬灭物质，结合核酸内切酶酶切和靶标循环信号放大功能，构建GO基核酸适配体传感器检测平台。

如图1所示，本发明的GO基核酸适配体传感器的构建方法包括如下步骤：

(1)、设计与合成核酸适配体荧光探针：在核酸适配体的5′端修饰ROX荧光基团，得到荧光标记的核酸适配体；

(2)、GO的荧光淬灭作用：即利用GO与荧光标记的核酸适配体的π-π共轭吸附作用结合进行荧光淬灭，得到GO基核酸适配体传感器。

其中，在步骤(1)中，荧光标记的核酸适配体的激发波长可以为575-595nm，优选为585nm，发射波长可以为595-615nm，优选为605nm，发射光颜色为橙红色；核酸适配体序列如5′-ROX-ATACCAGCTTATTCAATTAATCGCATTACCTTATACCAGCTTATTCAATTACGTCTGCACATACCAGCTTATTCAATTAGATAGTAAGTGCAATCT-3′(SEQ ID NO.1)。

在步骤(2)中，荧光淬灭的具体过程为：ROX荧光基团标记的核酸适配体在Tris缓冲液中稀释至100nmol/L，与20μg mL

其中，荧光标记的核酸适配体的最高荧光强度可以为758.34-928.61，优选为928.61，结合GO后，荧光发生淬灭，荧光强度可以为4.77-39.97，优选为4.77。

本发明的GO基核酸适配体传感器由上述的构建方法得到。

本发明验证上述的GO基核酸适配体传感器的方法包括如下步骤：

(1)、核酸适配体分子识别作用机制：即将GO基核酸适配体传感器与靶标FB1进行反应：10ng mL

(2)、核酸内切酶DNase I作用，靶标循环信号放大：核酸内切酶DNase I酶切核酸适配体：100U的核酸内切酶DNase I加至上述核酸适配体中进行反应，并酶切核酸适配体，释放靶标FB1，实现靶标循环信号放大。

其中，在步骤(1)中，反应时间可以为5-15min，优选为10min；荧光强度可以为55.23-305.21，优选为为178.61。

在步骤(2)中，反应时间可以为25-35min，优选为30min；核酸适配体的荧光强度可以为136.83-756.12，优选为为442.48。

本发明利用上述的GO基核酸适配体传感器检测FB1的方法包括如下步骤：

(1)、FB1标准曲线的拟合：配置不同浓度梯度的FB1标准溶液，利用GO基核酸适配体传感器进行分析，用分光光度计检测荧光信号强度和光谱曲线，测定拟合标准曲线；

(2)、实际样品小麦粉中FB1的含量测定：将实际待测样品经前处理，利用GO基核酸适配体传感器进行检测，根据标准曲线的线性模型，测定FB1的含量。

其中，在步骤(1)中，测定拟合标准曲线的过程为：FB1标准溶液稀释至不同浓度，分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，将其标准溶液和100U的核酸内切酶DNase I同时加入到核酸适配体/GO复合物中，反应时间为30min，激发波长为585nm，发射波长为605nm，激发光和发射光的隙缝宽度均设置为10nm，发射光颜色为橙红色。测定荧光信号强度和光谱曲线，拟合标准曲线。

在步骤(2)中，测定FB1的含量过程为：将小麦粉样品进行前处理，每个样品准确称量2g(2.00±0.05g)，FB1加标量分别为0ng/mL、1.5ng/mL、8ng/mL、15ng/mL，添加2mL、50％甲醇水提取液进行靶标提取，所得混合物过滤三次。最后，收集滤液，利用GO基核酸适配体传感器进行检测。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：

本实施例的GO基核酸适配体传感器的构建方法包括如下步骤：

(1)、在核酸适配体的5′端修饰ROX荧光基团，得到荧光标记的核酸适配体；其激发波长为585nm，发射波长为605nm，发射光颜色为橙红色；核酸适配体序列如：5′-ROX-ATACCAGCTTATTCAATTAATCGCATTACCTTATACCAGCTTATTCAATTACGTCTGCACATACCAGCTTATTCAATTAGATAGTAAGTGCAATCT-3′(SEQ ID NO.1)。

(2)、ROX荧光基团标记的核酸适配体在Tris缓冲液中稀释至100nmol/L，与20μgmL

实施例2：

如图2所示，荧光发射光谱曲线和标准曲线的制作：

10ng mL

100U的核酸内切酶DNase I加至上述核酸适配体中反应30min，并酶切核酸适配体，释放靶标FB1，实现靶标循环信号放大。

如图3和图4所示，FB1标准溶液稀释至不同浓度，分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL(图3中线条从上至下，浓度依次减小)，将其标准溶液和100U的核酸内切酶DNase I同时加入到核酸适配体/GO复合物中，反应时间为30min，激发波长为585nm，发射波长为605nm，激发光和发射光的隙缝宽度均设置为10nm，发射光颜色为橙红色。测定荧光信号强度和光谱曲线，拟合标准曲线。

实施例3：

实际样品小麦粉中FB1的含量测定：

将小麦粉样品进行前处理，每个样品准确称量2g，加入FB1标准溶液的浓度为8ng/mL，添加2mL、50％甲醇水提取液进行靶标提取，所得混合物过滤三次。最后，收集滤液，利用GO基核酸适配体传感器进行检测。根据实施例2测出的标准曲线，确定检测样品中FB1的含量为7.93ng/mL。方法特异性测定结果如图5所示，GO基核酸适配体传感器构建完成，对比分析不同靶标存在时的荧光强度恢复情况，包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)和对照组。所有靶标毒素的浓度均为5ng/mL。

从图1中可以看出，核酸适配体修饰ROX荧光基团；GO存在时，形成核酸适配体/GO复合物，核酸适配体的荧光信号因淬灭作用显著减弱；FB1存在时，核酸适配体分子识别靶标FB1，核酸适配体空间构象发生变化，核酸适配体与GO分离，荧光信号恢复；核酸内切酶DNase I存在时，酶切核酸适配体，释放靶标FB1，实现靶标循环信号放大。

从图2中可以看出，当20μg mL

从图3和图4中可以看出，FB1浓度范围为0.5-20ng mL

从图5中可以看出，在与FB1检测条件相同时，其他三种霉菌毒素(包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA))存在时检测到的荧光强度与对照组无显著差异，与FB1存在时检测到的荧光强度显著降低。表明本发明的检测方法具有很高的特异性。

综上所述，本发明的一种基于酶信号放大的GO基适配体传感器可检测FB1，主要以核酸适配体的分子识别、GO的荧光淬灭和核酸内切酶的酶切作用为基础，构建了一种具有荧光检测信号的荧光纳米探针，建立了核酸适配体传感器检测平台，可实现小麦粉样品中FB1的快速、高灵敏检测。

本发明的各方面、实施例、特征应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。

在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。

在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。

除非另外具体陈述，否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。

应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。

尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 氧化石墨烯基核酸适配体传感器的构建及检测伏马菌素B1的方法和应用

<141> 2021-09-29

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artficial Sequence)

<400> 1

ataccagctt attcaattaa tcgcattacc ttataccagc ttattcaatt acgtctgcac 60

ataccagctt attcaattag atagtaagtg caatct 96