一种微生态微胶囊包被制剂及其制备方法

摘要

本发明公开一种微生态微胶囊包被制剂及其制备方法，属于饲料添加剂技术领域。所述微生态微胶囊包被制剂包含动物双歧杆菌、干酪乳杆菌和布拉迪酵母的活菌，以及这三种菌的代谢产物。本发明所述微生态微胶囊包被型制剂能够有效避免菌通过饲料制粒以及胃液、胰液、胆汁等消化后和常温长期放置的损失，发挥其有效作用，延长了保质期。

说明书

技术领域

本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种微生态微胶囊包被制剂及其制备方法。

背景技术

动物体内的微生物生态系统是由无数的细菌、病毒和真菌等微生物组成的，各种有益菌和有害菌在一个微妙的平衡状态下对动物机体发挥着不同的作用，而健康良好以及平衡的体内微生态，不仅有利于动物的新陈代谢和营养物质的吸收，还能让动物焕发更多生命活力，变得更健康活泼。因此，适当地补充益生菌，是让动物微生态保持活力最直接的方式。

在动物胃肠道遭到病原感染时，通常使用抗生素药物进行治疗，起初在短时间内即可控制病情，而近年来效果越来越不显著，究其原因，一方面，过量使用抗生素，肠道原籍菌群的平衡受到破坏，胃肠道出现紊乱，自身免疫力下降；另一方面，多次使用抗生素会造成细菌的耐药性增加，诱导产生“超级细菌”。

在动物饲料中添加原籍动物双歧杆菌和干酪乳杆菌，可以迅速定植于肠道黏膜表面，辅助建立新的菌群平衡，形成黏膜菌群屏障，通过分泌抑菌素、降低环境PH以及定植抗力减少病原的附着和繁殖，降低感染的几率；同时，通过黏膜免疫增加肠道黏膜SIgA等抗体的生成，提高动物的体液免疫力。添加布拉迪酵母，一方面可以吸附大肠杆菌和沙门氏菌等有害菌，另一方面可以分泌蛋白酶、脂肪酶等消化酶，促进食物的消化吸收，辅助动物恢复健康。

目前，动物双歧杆菌、干酪乳杆菌和布拉迪酵母在动物上都有应用，但从整体来看，具有几个方面的不足：其一，菌与菌之间无协作效应，在进入胃肠道后生长繁殖速度较慢，代谢产物生成量较少，导致效果不明显；其二，三种菌分别单独发酵生产，菌量不高，再复合成产品，制作成本较高，不利于推广；其三，经长期常温放置、饲料制粒以及胃液、胰液、胆汁等消化后，三种菌损失较多，不能继续有效发挥作用。因此，如何通过协同混合发酵增加菌量和代谢产物以及提高产品对高温环境和消化液的耐受性成为亟待解决的关键问题。

发明内容

为克服现有技术中的不足，本发明提供了一种微生态菌剂的制备方法，以动物双歧杆菌、干酪乳杆菌以及布拉迪酵母的混合发酵，形成菌含量和代谢产物双高的微生态菌剂，降低生产成本。本发明的技术方案如下：

一种微生态菌剂的制备方法，步骤如下：

(1)有氧发酵

按2％～3％接种量将布拉迪酵母种子液接种到混合培养基，进行有氧发酵，发酵温度25～28℃，压力0.04～0.06MPa，转速180～200r/min，通气量200～250m

(2)厌氧发酵

向步骤(1)的发酵体系中加入1％～3％重量份的糖，将pH值调至7.0；分别按1％～2％和2％～3％接种量将动物双歧杆菌种子液和干酪乳杆菌种子液接种至发酵体系，进行厌氧发酵，发酵温度35～37℃，压力0.04～0.06MPa，转速60～90r/min；当pH值降至3.0～3.5时停止发酵，获得发酵液，对发酵液进行冷冻或包衣干燥，制得微生态菌剂。

上述微生态菌剂的制备方法中，各种子液的制备方法为：将动物双歧杆菌接种到TPY液体培养基中，在37℃条件下厌氧培养18h，获得动物双歧杆菌种子液；将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h，获得干酪乳杆菌种子液；将布拉迪酵母接种到YPD液体培养基中，在28℃条件下培养40h，获得布拉迪酵母种子液。在接种制备微生态菌剂前，上述三种种子液均置于冰箱冷藏备用。

上述微生态菌剂的制备方法中，混合培养基的制备方法为：将大豆蛋白胨1.5～2.0重量份，玉米浆干粉0.2～0.4重量份，葡萄糖2.0～3.0重量份，可溶性淀粉0.1～0.2重量份，

K

上述制备方法制备的微生态菌剂，包含动物双歧杆菌(菌数≧1.0×10

上述制备方法制备的微生态菌剂，对动物的消化道疾病，包括消化不良、腹泻和便秘等，以及动物免疫力具有较好的改善作用。

为了适应动物的消化，上述微生态菌剂的制备方法中，在获得发酵液后，可将发酵液制备成微生态微胶囊包被制剂，以提高动物双歧杆菌、干酪乳杆菌和布拉迪酵母对动物消化液的耐受性，减少有益菌种的损失，从而使菌种能够有效发挥作用。微生态微胶囊包被制剂的制备方法如下：将醋酸纤维素酞酸酯(CAP)0.2～0.5重量份、聚乙烯醇酞酸酯(PVAP)0.1～0.2重量份、脱脂乳粉10～15重量份和海藻酸钠2.0～4.0重量份加入发酵液80.3～87.7重量份中，混合均匀，冷冻或包衣干燥，形成微生态微胶囊包被制剂。

上述制备方法制备的微生态微胶囊包被制剂，包含动物双歧杆菌(菌数≧1.0×10

上述制备方法制备的微生态微胶囊包被制剂，对动物的消化道疾病，包括消化不良、腹泻和便秘等，以及动物免疫力具有较好的改善作用。

本发明的有益效果为：

通过动物双歧杆菌、干酪乳杆菌和布拉迪酵母三种菌株混合发酵，实现了菌株之间的协作性，在进入胃肠道后生长繁殖速度较快，代谢产物生成量多，使用效果明显改善。

混合发酵与三种菌单独发酵生产相比，菌量高，生产成本相对低，利于临床推广使用。

本发明还通过微胶囊包被技术，将混合发酵后的菌剂进行包被，有效避免了菌通过饲料制粒以及胃液、胰液、胆汁等消化后和常温长期放置的损失，发挥其有效作用，延长了保质期。

附图说明

图1为试验鸡场图；

图2为采食本发明微生态微胶囊包被制剂后的鸡所下的蛋；

图3为第4栏公猪在采食本发明微生态微胶囊包被制剂前的图片；

图4为第8栏母猪在采食本发明微生态微胶囊包被制剂前的图片；

图5为第4栏公猪在采食本发明微生态微胶囊包被制剂后的图片；

图6为第8栏母猪在采食本发明微生态微胶囊包被制剂后的图片；

图7为第4栏和第8栏仔猪腹泻率随天数变化的曲线图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

混合发酵与单独发酵的菌数以及代谢产物对比

(1)动物双歧杆菌的发酵：按1％接种量将动物双歧杆菌种子液接种至混合培养基，进行厌氧发酵，发酵温度调整为37℃，罐压0.05MPa，转速80r/min，当pH值降至3.5时停止发酵。

(2)干酪乳杆菌的发酵：按2％接种量将干酪乳杆菌种子液接种至混合培养基，进行厌氧发酵，发酵温度调整为37℃，罐压0.05MPa，转速80r/min，当pH值降至3.5时停止发酵。

(3)布拉迪酵母的发酵：按2％接种量将布拉迪酵母种子液接种到混合培养基，进行有氧发酵，发酵温度设置为28℃，罐压0.05MPa，转速200r/min，通气量250m

(4)动物双歧杆菌、干酪乳杆菌和布拉迪酵母的混合发酵：按2％接种量将布拉迪酵母种子液接种到混合培养基，进行有氧发酵，发酵温度设置为28℃，罐压0.05MPa，转速200r/min，通气量250m

上述发酵过程中，各种子液的制备方法为：将动物双歧杆菌接种到TPY液体培养基中，在37℃条件下厌氧培养18h，获得动物双歧杆菌种子液；将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h，获得干酪乳杆菌种子液；将布拉迪酵母接种到YPD液体培养基中，在28℃条件下培养40h，获得布拉迪酵母种子液。

上述发酵过程中，混合培养基的制备方法为：将大豆蛋白胨2.0重量份，玉米浆干粉0.4重量份，葡萄糖2.0重量份，可溶性淀粉0.2重量份，K

动物双歧杆菌、布拉迪酵母分别来自江苏微康公司和安琪酵母公司成品，干酪乳杆菌(菌株编号1.8727)从中国普通微生物保藏中心购买。

对上述四种发酵后的液体的菌数进行检测和统计，结果如表1所示：

表1

对上述四种发酵液中的代谢产物进行检测，结果如表2所示：

表2

由表1和表2的检测结果可知，相对于三种菌株单独发酵，混合发酵后最终菌数和主要代谢产物都有明显提高，说明在混合发酵过程中三种菌可以互相促进生长繁殖。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

微生态菌剂的制备：

(1)制备种子液

将动物双歧杆菌接种到TPY液体培养基中，在37℃条件下厌氧培养18h，获得动物双歧杆菌种子液；将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h，获得干酪乳杆菌种子液；将布拉迪酵母接种到YPD液体培养基中，在28℃条件下培养40h，获得布拉迪酵母种子液。将上述三种菌的种子液均置于冰箱冷藏备用。

(2)制备混合培养基

将大豆蛋白胨2.0重量份，玉米浆干粉0.4重量份，葡萄糖2.0重量份，可溶性淀粉0.2重量份，K

(3)有氧发酵

按2％接种量将布拉迪酵母种子液接种到混合培养基，进行有氧发酵，发酵温度设置为28℃，罐压0.05MPa，转速200r/min，通气量250m

(4)厌氧发酵

向发酵体系中加入2％重量份的葡萄糖，将pH值调至7.0；分别按1％和2％接种量将动物双歧杆菌种子液和干酪乳杆菌种子液接种至发酵体系，进行厌氧发酵，发酵温度调整为37℃，罐压0.05MPa，转速80r/min；当pH值降至3.5时停止发酵，获得发酵液。

(5)冷冻或包衣干燥

将发酵液进行冷冻或包衣干燥，获得微生态菌剂。

实施例2

微生态微胶囊包被制剂的制备：

将醋酸纤维素酞酸酯(CAP)0.2重量份、聚乙烯醇酞酸酯(PVAP)0.2重量份、脱脂乳粉15重量份和海藻酸钠4.0重量份加入到实施例1步骤(5)制备的发酵液80.6重量份中，混合均匀，冷冻或包衣干燥，形成微生态微胶囊包被制剂。

实施例3对消化液的耐受性测试

测试实施例2制备的微生态微胶囊包被制剂对消化液的耐受性，以微生态菌剂(实施例1)为对照，以三种菌的存活率为耐受性指标。

消化液以人工胃液和人工肠液代替。

人工胃液：取稀盐酸16.4mL，加水约800mL及胃蛋白酶(3000NFU/g，索莱宝公司)10g，搅匀后加水定容至1000mL。

人工肠液：取磷酸二氢钾6.8g加水500mL，用0.4％的氢氧化钠溶液调节pH至6.8；另取胰酶(250NFU/g，索莱宝公司)10g加水适量使溶解，将两液混合后，加水定容至1000mL。

按1％浓度将菌粉样品加入人工胃液和肠液，37℃摇床80r/min分别震荡2小时和4小时，检测处理前后菌数，计算存活率。

菌存活率＝(人工胃液或人工肠液)处理后菌数/处理前菌数×100％

测试结果如表3所示：

表3

由表3可知，混合发酵后如果直接喷雾干燥，所得的菌剂在通过人工胃液和人工肠液消化后，菌数损失较多；而经过微胶囊包被后存活率在75％以上，可保证菌顺利到达肠道发挥作用。

实施例4常温保存对菌活率的影响

测试实施例2制备的微生态微胶囊包被制剂在常温保存(1个月、3个月、6个月、12个月)下的菌活率，以微生态菌剂(实施例1)为对照，以三种菌的存活率为检测指标。

测试结果如表4所示：

表4

由表4可知，混合发酵后如果直接喷雾干燥，所得的菌剂在常温放置3个月以后，布拉迪酵母仍保持较高存活率，但动物双歧杆菌和干酪乳杆菌菌数下降到60％以下，在保存12个月后损失殆尽，不能有效发挥作用；而经过微胶囊包被后，在保存12个月后菌成活率仍在70％以上，保证了产品的使用效果。

实施例5

小鼠安全试验：将30只4周龄昆明小鼠(雄雌各半)随机分为对照组、低剂量组和高剂量组(各10只)，分别使用生理盐水、低剂量微生态微胶囊包被制剂(0.001g/mL，由生理盐水配制)和高剂量微生态微胶囊包被制剂(0.1g/mL，由生理盐水配制)给小鼠灌胃，每次1mL，每天1次，每天观察有无死亡和腹泻现象，灌胃14天后称体重，解剖观察内脏有无病变，取肝脏、脾脏和肾脏称重，计算脏器指数。

脏器指数＝脏器(肝、脾或肾)重量/体重×100％。

灌胃14天后小鼠脏器指数，如表5所示。

表5

经过试验观察，试验期内小鼠未出现死亡和明显的腹泻现象。灌胃14天后解剖，观察内脏和胃肠道，未发现明显的病变。由表5可知，与对照组相比，低剂量和高剂量微生态微胶囊包被制剂灌胃组肝脏、脾脏和肾脏指数无明显变化，说明由三种菌混合发酵制备的微生态微胶囊包被制剂无毒副作用。

临床案例测试与分析

(1)案例一

品种：拉布拉多犬

年龄：2年6个月

性别：雄性

症状：腹泻1个多月，眼眶下陷，粪便腥臭、不成型、偶尔带血，有肠鸣声，体重减轻约0.9kg，食欲不振，精神沉郁。

用药：曾使用氟哌酸治疗1周效果不理想，后使用复合微生态制剂(双歧杆菌、粪肠球菌和酵母菌)，使用后肠鸣声不明显，粪便不再腥臭，但仍然有腹泻现象。

处方：使用本发明的微生态微胶囊包被制剂，每日1次，每次10g，连用5天。

结果：使用后第二天粪便开始成型，水便和血便消失，第四天恢复正常采食和饮水，第五天精神状态恢复正常，半月后回访体重基本恢复到之前水平。

(2)案例二

品种：泰迪犬

年龄：1年4个月

性别：雄性

症状：病犬食欲废绝，精神沉郁，吞咽困难，吐出带有粘液的食物，有腥臭味，不定时的咳嗽，医院检查食道阻塞，食物返流，诊断为巨食道症。

用药：使用西沙比利0.25mg/kg促进消化道蠕动，使用奥美拉唑1.0mg/kg减少胃酸分泌，后使用复合微生态制剂(双歧杆菌、乳酸杆菌和嗜热链球菌)，使用后无明显作用。

处方：将本发明的微生态微胶囊包被制剂拌入30多度温水中灌服，每日2次，每次5g，连用5天。

结果：使用后第二天吞咽困难和咳嗽症状减轻，第三天不再吐出食物，食欲恢复正常。

(3)案例三

品种：海兰褐蛋鸡

年龄：1年6个月

规模：7000只

症状：有明显的腹泻和腹膜炎，腹泻率在25％左右，病死率在1.2％，畸形蛋、沙皮蛋多，产蛋量下降，平均每只鸡每天产蛋60g。试验鸡场如图1所示。

处方：将本发明的微生态微胶囊包被制剂按0.1％用量与饲料混合，连用5天。

结果：使用后第三天腹泻率下降至5％，第四天不再出现死亡，第六天每只鸡每天产蛋达到63g，畸形蛋、沙皮蛋消失，经济效益明显提高。采食本发明微生态微胶囊包被制剂后的鸡所下的蛋，如图2所示。

(4)案例四

动物：35日龄大约克仔猪33头，第4栏为公猪共15头(如图3所示)，第8栏为母猪共18头(如图4所示)。

指标：腹泻率和毛色打分。

症状：被毛粗乱、肩胛骨和背脊突出、个别有腹泻，食欲不振。

处方：将本发明的微生态微胶囊包被制剂按0.1％用量与饲料混合，连用14天。

结果：腹泻率和毛色打分以及猪只情况如图5、图6以及表6、表7所示，其中，图5为第4栏公猪在采食本发明所述微生态微胶囊包被制剂后的生活状态，图6为第8栏母猪在采食本发明所述微生态微胶囊包被制剂后的生活状态，图7为仔猪腹泻率随天数变化，表6为试验前后仔猪毛色评分表。

表6

从图7可以看出，腹泻率从进入严重期后不断下降，最后完全康复，说明本发明的微生态微胶囊包被制剂对仔猪腹泻具有缓解和消除的作用。从图3至图6以及表6可以看出，试验1周和2周后，4栏仔猪毛色分别改善10.5％和31.4％，合格率分别提高20.0％和60.0％；8栏仔猪毛色分别改善57.7％和60.3％，合格率分别提高55.6％和61.1％，说明本发明的微生态微胶囊包被制剂对仔猪具有很好的保健和救护作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。